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微波凍融法預(yù)處理用于酵母菌落PCR檢測(cè)

2022-10-08 10:50彭志清李寅琛吳升山曾憲海
關(guān)鍵詞:水浴凍融釀酒

李 闖, 彭志清, 李寅琛, 吳升山,2,3, 林 鹿,2,3, 曾憲海,2,3

(1.廈門(mén)大學(xué)能源學(xué)院,福建 廈門(mén) 361102;2.福建省生物質(zhì)清潔高值化技術(shù)工程研究中心,福建 廈門(mén) 361102;3.廈門(mén)市生物質(zhì)清潔高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門(mén) 361102)

釀酒酵母是一種典型的模式微生物,在生命科學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用.因具備生長(zhǎng)迅速、基因操作簡(jiǎn)單、同源重組能力強(qiáng)等特點(diǎn)[1-2],釀酒酵母成為真核基因表達(dá)中最常見(jiàn)的宿主系統(tǒng).隨著基因編輯技術(shù)的高速發(fā)展,釀酒酵母在大規(guī)模DNA片段組裝等合成生物學(xué)領(lǐng)域已有廣泛的應(yīng)用[3-4].

在酵母底盤(pán)中進(jìn)行基因操作,為確保其準(zhǔn)確性,需對(duì)DNA片段引入或刪除進(jìn)行鑒定,常規(guī)步驟包括單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)、收集并裂解細(xì)胞、提取高純度DNA模板及PCR檢測(cè)[5],在進(jìn)行大規(guī)模篩選工作時(shí),該方法往往成本高且效率低;相反,菌落PCR檢測(cè)方式無(wú)需預(yù)先分離或純化DNA,而是以菌體為模板來(lái)完成靶標(biāo)序列的擴(kuò)增[6],可以有效避免上述弊端.然而與傳統(tǒng)原核微生物不同,釀酒酵母細(xì)胞壁由復(fù)雜多糖和少量蛋白質(zhì)組成,具有較強(qiáng)韌性.特殊的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)使其難以被簡(jiǎn)單的高溫程序破壞,因此將釀酒酵母直接作為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)的成功率較低[7],需使用預(yù)處理方式破壞細(xì)胞壁,再進(jìn)行菌落PCR以增強(qiáng)檢測(cè)效率.目前已有文獻(xiàn)報(bào)道了釀酒酵母的多種預(yù)處理方式,如通過(guò)消解酶水解細(xì)胞壁,使用氫氧化鈉、醋酸鋰、十二烷基硫酸鈉、曲拉通X-100處理酵母,均有效提高了檢出率[8-12],但酶制劑成本較高,酶解緩沖液以及化學(xué)試劑中金屬離子的引入會(huì)干擾PCR檢測(cè)的穩(wěn)定性[13],極大制約了菌落PCR在釀酒酵母中的應(yīng)用.

本研究通過(guò)對(duì)比不同預(yù)處理方法,探索出一種高效酵母菌落PCR檢測(cè)方法.該方法無(wú)需輔助物質(zhì)的添加,使用微波結(jié)合凍融的方式處理酵母菌液,以其為模板進(jìn)行PCR檢測(cè),成本低、效率高、穩(wěn)定性好,不僅適用于不同基因操作模式下陽(yáng)性克隆的篩選,還可用于3 000 bp以上長(zhǎng)鏈DNA片段的檢測(cè);此外,該方法可應(yīng)用于樹(shù)干畢赤酵母和巴斯德畢赤酵母陽(yáng)性克隆的篩選.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸桿菌DH5α、野生型二倍體釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YD202、單倍體釀酒酵母BY4741、巴斯德畢赤酵母(Komagataellaphaffii)GS115均由廈門(mén)大學(xué)生物質(zhì)燃料與化學(xué)品團(tuán)隊(duì)保藏;樹(shù)干畢赤酵母(Scheffersomycesstipitis)CGMCC 2.3250購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心.

1.1.2 培養(yǎng)基 Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基:10 g·L-1胰蛋白胨、5 g·L-1酵母抽提物、10 g·L-1氯化鈉;Yeast Extract Peptone Dextrose(YEPD/YPD)培養(yǎng)基:20 g·L-1胰蛋白胨、10 g·L-1酵母抽提物、20 g·L-1葡萄糖.

分別向以上體系中添加終濃度為20 g·L-1的瓊脂,配制成相應(yīng)的固體培養(yǎng)基.在制備抗性平板時(shí),向滅菌后的LB固體培養(yǎng)基中加入終濃度為100 μg·mL-1的氨芐青霉素,向YPD固體培養(yǎng)基中加入終濃度為200 μg·mL-1的潮霉素B或G418.

1.1.3 質(zhì)粒與DNA片段 釀酒酵母木糖異構(gòu)酶(XI)表達(dá)質(zhì)粒pRS41H-xylA、表面展示型XI表達(dá)質(zhì)粒pRS41H-xylA-sag1,巴斯德畢赤酵母特異蛋白表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-catcher、pPIC9K-xynA均由無(wú)縫克隆技術(shù)構(gòu)建.釀酒酵母非特異性醛糖還原酶敲除盒g(shù)re3_U-hpt-gre3_D、δ位點(diǎn)整合片段δ1-xylA-KanMX-δ2,樹(shù)干畢赤酵母己糖激酶敲除盒nag5_U-hpt_m-nag5_D均通過(guò)重疊延伸PCR方式構(gòu)建.其中,hpt為潮霉素B抗性基因,而樹(shù)干畢赤酵母屬于CUG分支酵母,將常規(guī)亮氨酸密碼子CUG翻譯為絲氨酸[14],故選用經(jīng)過(guò)突變后的潮霉素B抗性基因hpt_m作為篩選標(biāo)記[15].

1.1.4 引物 根據(jù)待測(cè)片段的特性共設(shè)計(jì)7組引物,均由上海生工生物工程公司合成,引物序列詳見(jiàn)表1.

表1 菌落PCR檢測(cè)所使用的引物

1.1.5 主要試劑與設(shè)備 2×RapidTaqMaster Mix、2×Phanta Flash Master Mix、DL5000 DNA Marker、One Step Cloning Kit購(gòu)自南京諾唯贊公司;抗生素G418、潮霉素B購(gòu)自上海生工生物工程公司;PEG3350購(gòu)自上海新鉑化學(xué)技術(shù)公司;LiAc購(gòu)自上海麥克林生化科技公司.其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

基因擴(kuò)增儀、電泳儀、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)、電穿孔系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司;微型高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司;熒光倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司;700 W微波爐購(gòu)自廣東美的公司.

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒及DNA片段的轉(zhuǎn)化 釀酒酵母醋酸鋰/聚乙二醇轉(zhuǎn)化參照Gietz[16]的方法進(jìn)行,并適當(dāng)優(yōu)化.完成感受態(tài)酵母細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化體系的配制后,于30 ℃溫浴30 min,42 ℃熱激25 min,在500 μL YPD培養(yǎng)基中復(fù)蘇2 h,吸取100 μL培養(yǎng)液涂布選擇性平板,培養(yǎng)2~3 d后,挑選單菌落檢測(cè)陽(yáng)性克隆.

畢赤酵母使用電轉(zhuǎn)化法進(jìn)行DNA的轉(zhuǎn)化[17].轉(zhuǎn)化時(shí)使用0.2 cm電轉(zhuǎn)化杯,電穿孔系統(tǒng)設(shè)置電壓2 000 V、電容25 μF、電阻200 Ω,轉(zhuǎn)化完成后在選擇性平板上涂布相應(yīng)菌液.

1.2.2 酵母質(zhì)粒及基因組DNA的獲取 在抗性平板上挑選單菌落,接種至20 mL YPD培養(yǎng)基上,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期(D600 nm=8~10)時(shí),收集菌體.分別使用北京天根生化公司的酵母質(zhì)粒提取試劑盒和基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行酵母質(zhì)粒及基因組DNA的提取.

1.2.3 預(yù)處理酵母制備PCR模板的方法 直接法:使用無(wú)菌牙簽從篩選平板上挑取少量菌體直接用于PCR檢測(cè).

水浴法:挑取單菌落接種至20 mL抗性YPD培養(yǎng)基中,過(guò)夜培養(yǎng)(D600 nm=4~5),取1.5 mL菌液,于12 000 r·min-1離心15 s,棄上清,用200 μL ddH2O重懸菌體,于12 000 r·min-1再次離心15 s,棄上清,用200 μL TE緩沖液重懸菌體,沸水浴10 min,于12 000 r·min-1離心5 min,取1 μL上清作為PCR模板.

水浴凍融法:使用與水浴法同樣的方式收集菌體,沸水浴10 min,于-80 ℃冷凍處理10 min,完成后再次沸水浴10 min,于12 000 r·min-1離心5 min,取1 μL上清作為PCR模板.

微波法[18]:使用無(wú)菌牙簽挑取菌體至PCR管壁,用700 W微波爐全功率處理5 min,于-20 ℃快速冷卻至室溫后作為PCR模板.

微波凍融法:取單菌落接種至含2 mL抗性YPD培養(yǎng)基的5 mL無(wú)菌離心管中,過(guò)夜培養(yǎng)(D600 nm=1.5~2.0),取10 μL菌液至PCR管中,用700 W微波爐全功率處理5 min,于-80 ℃冷凍10 min,快速解凍,再次用微波爐全功率處理2 min,取1 μL菌液作為PCR模板.

1.2.4 PCR檢測(cè) 按照試劑使用說(shuō)明配制20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR檢測(cè).以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同預(yù)處理方式下酵母形貌的比較

為了比較不同預(yù)處理方式對(duì)酵母形貌的影響,以野生型釀酒酵母為研究對(duì)象,按照“1.2.3”中的方法處理菌體.顯微鏡下觀察的結(jié)果(圖1)顯示:未經(jīng)處理的酵母輪廓清晰,并展現(xiàn)出芽特性;水浴法處理后,部分酵母細(xì)胞體積膨脹,有少數(shù)胞體破裂;酵母經(jīng)過(guò)水浴凍融和微波凍融處理后的效果相似,部分細(xì)胞內(nèi)容物溢出且細(xì)胞質(zhì)壁分離明顯;與水浴法、水浴凍融法、微波凍融法不同,微波法處理后酵母整體呈降解趨勢(shì),大量細(xì)胞以碎片形式存在.表明以上4種處理方式均可在不同程度上破壞酵母細(xì)胞,與其他3種方法相比微波法的破胞效率最高.

a:原始酵母細(xì)胞;b:水浴處理;c:水浴凍融處理;d:微波處理;e:微波凍融處理.

2.2 不同預(yù)處理方式對(duì)酵母菌落PCR檢測(cè)的影響

通過(guò)醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將木糖異構(gòu)酶游離表達(dá)質(zhì)粒pRS41H-xylA轉(zhuǎn)化至野生型釀酒酵母中,使用潮霉素B抗性平板進(jìn)行克隆子的篩選,結(jié)果見(jiàn)圖2a.隨機(jī)挑選5個(gè)單菌落經(jīng)過(guò)5種預(yù)處理方式制備模板進(jìn)行菌落PCR檢測(cè),其瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖3所示.當(dāng)以試劑盒提取質(zhì)粒為PCR模板時(shí)(圖3a),電泳條帶與XI開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度1 320 bp保持一致,表明重組質(zhì)粒均已成功轉(zhuǎn)化.然而,直接以菌體為模板(圖3b)或采用水浴法(圖3c)和微波法(圖3e)制備模板,電泳圖譜顯示無(wú)條帶或微弱目標(biāo)條帶,難以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目的.采用水浴凍融法(圖3d)和微波凍融法(圖3f)處理菌體后進(jìn)行PCR檢測(cè),電泳圖譜均顯示出與質(zhì)粒PCR檢測(cè)結(jié)果相吻合的目標(biāo)條帶,但微波凍融法表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性.

a:釀酒酵母pRS41H-xylA;b:釀酒酵母Δgre3∷hpt.

a:質(zhì)粒模板;b:直接模板;c:水浴模板;d:水浴凍融模板;e:微波模板;f:微波凍融模板(M:DL5000 Marker;1~5:?jiǎn)尉?.

向釀酒酵母中導(dǎo)入DNA片段gre3_U-hpt-gre3_D后,通過(guò)同源重組的方式敲除非特異性醛糖還原酶基因gre3,抗性篩選結(jié)果見(jiàn)圖2b.挑選5個(gè)單菌落,使用不同預(yù)處理方式制備的模板進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果如圖4所示.以提取的基因組DNA為模板時(shí)(圖4a),電泳圖譜顯示于2 100 bp處存在明顯條帶,其中,泳道3、4更為明亮.測(cè)序結(jié)果顯示,以上兩條DNA片段即為擴(kuò)增所得的gre3基因敲除盒.采用直接法(圖4b)和微波法(圖4e)制備的模板均無(wú)法完全擴(kuò)增出目標(biāo)條帶,檢測(cè)結(jié)果顯示假陰性率高.相比水浴法和水浴凍融法,采用微波凍融法(圖4f)制備的模板進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)的穩(wěn)定性更好.此外,菌落PCR仍能檢測(cè)出800 bp左右的待敲除片段,表明在多個(gè)單菌落中,基因敲除盒部分整合至二倍體酵母染色體中,敲除基因同源位點(diǎn)仍存在完整的gre3基因.

a:基因組模板;b:直接模板;c:水浴模板;d:水浴凍融模板;e:微波模板;f:微波凍融模板(M:DL5000 Marker;1~5:?jiǎn)尉?.

對(duì)于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和染色體整合兩種體系,直接以酵母菌體為模板進(jìn)行PCR檢測(cè),無(wú)法擴(kuò)增出目的片段,表明通過(guò)PCR無(wú)法使酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)遭受破壞而暴露核酸物質(zhì).水浴法所得的電泳條帶較暗,在經(jīng)過(guò)冷凍和2次水浴后,菌落PCR靈敏度提升明顯,但穩(wěn)定性不足,可能由長(zhǎng)時(shí)間高溫破壞核酸結(jié)構(gòu)所致.由圖1d可知,微波法處理后的酵母破胞明顯,大量?jī)?nèi)容物溢出以及劇烈變化的物理環(huán)境導(dǎo)致DNA降解等因素均可導(dǎo)致PCR檢測(cè)結(jié)果呈假陰性.相比其他預(yù)處理方法,微波凍融法操作簡(jiǎn)單,所得電泳圖譜條帶清晰,耗費(fèi)較少時(shí)間即可達(dá)到常規(guī)試劑盒提取法相同的檢測(cè)效果.

2.3 酵母長(zhǎng)鏈DNA片段的檢測(cè)結(jié)果

使用醋酸鋰/聚乙二醇轉(zhuǎn)化法分別向野生型釀酒酵母和BY4741中導(dǎo)入δ位點(diǎn)整合片段δ1-xylA-KanMX-δ2和表面展示型XI表達(dá)質(zhì)粒pRS41H-xylA-sag1,分別使用G418和潮霉素B平板進(jìn)行篩選.在選擇性平板上隨機(jī)挑選單菌落,使用微波凍融法制備的模板進(jìn)行PCR檢測(cè).電泳圖譜(圖5)顯示,基因組模板和微波凍融模板在4 000 bp左右處有明顯條帶,與插入δ位點(diǎn)的特征序列長(zhǎng)度相同.圖6b顯示,泳道1、2、3、4、6在3 000~5 000 bp處有單一條帶,與質(zhì)粒PCR檢測(cè)結(jié)果(圖6a)一致.以上兩種檢測(cè)結(jié)果表明,使用微波凍融法制備的模板進(jìn)行菌落PCR可用于釀酒酵母長(zhǎng)鏈DNA片段的檢測(cè).

a:基因組模板;b:微波凍融模板(M:DL5000 Marker;1~5:?jiǎn)尉?.

a:質(zhì)粒模板;b:微波凍融模板(M:DL5000 Marker;1~6:?jiǎn)尉?.

2.4 畢赤酵母菌落PCR檢測(cè)結(jié)果

使用電轉(zhuǎn)化法向樹(shù)干畢赤酵母中導(dǎo)入己糖激酶敲除盒nag5_U-hpt_m-nag5_D,在獲取轉(zhuǎn)化子后采用微波凍融法制備模板,使用nag5上下游引物對(duì)基因敲除情況進(jìn)行PCR檢測(cè).結(jié)果(圖7)顯示,以樹(shù)干畢赤酵母原始基因組DNA作為對(duì)照可以擴(kuò)增出2 233 bp的待敲除片段,而對(duì)于樹(shù)干畢赤酵母nag5敲除體系,大部分篩選所得的單菌落可擴(kuò)增出3 456 bp的nag5基因敲除盒.

C:原始基因組模板;M:DL5000 Marker;1~8:微波凍融模板.

使用電轉(zhuǎn)化法向巴斯德畢赤酵母中分別導(dǎo)入使用限制酶SalⅠ線性化處理后的質(zhì)粒pPIC9K-xynA、pPIC9K-catcher,在篩選平板上獲取單菌落后,采用微波凍融法制備PCR模板,使用AOX1通用引物擴(kuò)增目標(biāo)條帶.結(jié)果(圖8)顯示:兩種體系均可擴(kuò)增得到2 200 bp的野生型AOX1基因,表明獲得的單菌落均為甲醇利用野生型(Mut+);同時(shí),泳道1~4、5~10分別在1 200和1 700 bp處有明顯條帶,與組合AOX1基因上下游同源序列的目的基因長(zhǎng)度相匹配.表明微波凍融模板不僅適用于釀酒酵母菌落的PCR檢測(cè),在畢赤酵母中亦有較好的檢測(cè)效果.

a:pPIC9K-xynA;b:pPIC9K-catcher(M:DL5000 Marker;1~4、5~10:微波凍融模板).

3 討論

使用菌落PCR篩選大腸桿菌陽(yáng)性克隆時(shí),在PCR預(yù)變性步驟持續(xù)高溫的作用下,菌體會(huì)部分裂解而暴露DNA,可直接作為菌落PCR檢測(cè)的模板.與之不同的是,酵母菌落PCR檢測(cè)成功的關(guān)鍵是通過(guò)預(yù)處理方式破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),以提高聚合酶與擴(kuò)增模板的接觸概率,來(lái)實(shí)現(xiàn)PCR的順利進(jìn)行.酵母預(yù)處理方法包括酶法、化學(xué)法、物理法.酶法借助消解酶、蝸牛酶等酶制劑的水解作用來(lái)處理酵母細(xì)胞壁,消除PCR檢測(cè)的屏障,但成本較高、作用時(shí)間長(zhǎng),且對(duì)細(xì)胞壁組分復(fù)雜的野生型酵母的作用并不顯著,一般用于輔助其他處理方式,以協(xié)同方式完成破胞[19].化學(xué)法需添加醋酸鋰、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉、曲拉通X-100改變細(xì)胞壁的通透性,以提高菌落PCR檢測(cè)的成功率,但化學(xué)試劑的引入會(huì)干擾PCR體系,對(duì)聚合酶活性產(chǎn)生較大的影響[13].物理法常使用高溫、冷凍、微波、研磨等方式破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)以達(dá)到釋放DNA的目的[20],該方法操作簡(jiǎn)單,但部分處理方式的PCR檢測(cè)效果并不理想.基于物理法的優(yōu)勢(shì),本研究對(duì)不同處理方式與菌落PCR檢測(cè)結(jié)果之間的關(guān)系進(jìn)行了探究.

粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)可直接使用酵母菌體為模板進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)用于分子遺傳鑒定,對(duì)1 500 bp以內(nèi)的短鏈基因片段有較好的檢測(cè)效果[7];但本研究采用直接法制備的野生型釀酒酵母模板進(jìn)行菌落PCR檢測(cè),無(wú)法檢測(cè)出目標(biāo)條帶.試驗(yàn)結(jié)果不一致推測(cè)是由于酵母的遺傳背景差異較大且野生型釀酒酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜[21].相比水浴法,采用水浴凍融法制備的模板進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)時(shí),其檢測(cè)靈敏度提升明顯,與通過(guò)冰晶破壞細(xì)胞壁可以提高檢測(cè)成功率的快速凍融法[22]一致,然而長(zhǎng)時(shí)間的高溫環(huán)境以及反復(fù)凍融操作均會(huì)破壞基因組DNA結(jié)構(gòu),影響后續(xù)PCR檢測(cè)結(jié)果.據(jù)報(bào)道,微波法制備的模板適用于釀酒酵母2 000 bp以內(nèi)DNA片段的快速檢測(cè)[18],但在操作中發(fā)現(xiàn)此法的PCR模板量難以得到精確控制,最優(yōu)微波處理時(shí)間亦隨菌體量和酵母遺傳背景的不同而改變;同時(shí),菌體以及微波處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物溢出(圖1d)均可成為PCR檢測(cè)的干擾因素.因此,本研究使用微波法制備的模板進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)的靈敏度低、穩(wěn)定性較差(圖3e、4e).與微波法不同,微波凍融法以酵母菌液為操作對(duì)象,使用長(zhǎng)時(shí)間微波處理可以保證微波破胞的同時(shí)降低高溫對(duì)酵母基因組的破壞,保持基因組的完整性,在經(jīng)過(guò)凍融輔助破壁和再次微波處理后,進(jìn)行菌落PCR可達(dá)到相比其他預(yù)處理方式更優(yōu)的檢測(cè)效果(圖3f、4f).

培養(yǎng)基的組成以及培養(yǎng)物的生長(zhǎng)周期均可成為影響酵母菌落PCR檢測(cè)效率的因素[18],本研究選取不同生長(zhǎng)時(shí)期的酵母菌液進(jìn)行微波凍融處理,后續(xù)的PCR檢測(cè)結(jié)果并無(wú)明顯差異.對(duì)于微波凍融法制備的模板,控制相同模板量,使用10 μL反應(yīng)體系亦可得到相同的檢測(cè)結(jié)果.因此,微波凍融法受培養(yǎng)基以及菌體生長(zhǎng)周期的影響較小,相比其他預(yù)處理方式更占優(yōu)勢(shì).在釀酒酵母大規(guī)模DNA片段組裝后的鑒定中,以長(zhǎng)鏈DNA片段為靶標(biāo)可以提高檢測(cè)準(zhǔn)確度,同時(shí)能夠助力測(cè)序驗(yàn)證工作的高效運(yùn)行.本研究使用微波凍融法擴(kuò)增長(zhǎng)鏈DNA片段,所得電泳條帶明亮且單一,表明該方法的條件溫和且對(duì)細(xì)胞DNA的破壞較小,適用于長(zhǎng)鏈DNA片段的檢測(cè).

4 結(jié)論

本研究從菌落PCR常規(guī)的物理預(yù)處理方式出發(fā),通過(guò)對(duì)比各種方法的異同之處,提出使用微波凍融法制備的模板進(jìn)行釀酒酵母菌落PCR檢測(cè),該方法操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、條件較為溫和、破壁效果顯著,不僅可在不同基因操作體系中高效擴(kuò)增短鏈DNA,且適用于3 000 bp以上長(zhǎng)鏈DNA片段的檢測(cè).此外,在巴斯德畢赤酵母和樹(shù)干畢赤酵母中使用微波凍融法制備的模板進(jìn)行菌落PCR均可實(shí)現(xiàn)較好的檢測(cè)效果.綜上所述,微波凍融法的應(yīng)用降低了檢測(cè)成本,提高了檢測(cè)效率,適合應(yīng)用在復(fù)雜酵母菌落PCR檢測(cè).

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不同水浴處理對(duì)百香果種子萌發(fā)的影響
低溫凍融作用下煤巖體靜力學(xué)特性研究
凍融對(duì)銀川平原壓實(shí)砂土壓縮性的影響
為什么酵母菌既能做面包也能釀酒?
更 正
高錳酸鉀法測(cè)定飼料鈣含量的水浴陳化條件研究
凍融環(huán)境下?lián)胶狭吓c引氣劑對(duì)混凝土的影響
冰水浴