郎文萱，李曉辰，王藝穎，段云濤，王 鈺，魏鵬晟，李 雪，崔 躍，朱啟文*

0 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是癡呆癥最常見的病因，導致記憶、行為和認知功能逐漸喪失。AD增長迅速，預測到2050年我國患病人數(shù)將達到2 687萬[1]。盡管經過幾十年的研究和藥物開發(fā)，仍然沒有治愈AD的方法，甚至沒有可行的長期治療方案[2]。

神經炎癥是AD的一種重要機制。Aβ的沉積會激活小膠質細胞產生更多的促炎因子[3]，隨著炎癥反應的發(fā)展，小膠質細胞釋放的促炎因子加劇了腦環(huán)境惡化[4]。研究表明，抑制神經炎癥可以保護神經元，減輕學習記憶障礙。短鏈脂肪酸(Short-chain fatty acids,SCFAs)是腸道微生物菌群的代謝產物，包括乙酸、丙酸、丁酸等[5]。SCFAs可以促進腸道內穩(wěn)態(tài)，抑制腸道炎癥[6-7]。SCFAs在發(fā)揮抗炎作用的同時，能夠通過抑制自由基，減少炎癥級聯(lián)引起的細胞氧化應激，消除潛在的損傷產物。其中丙酸鈉(Sodium propionate，SP)是SCFAs的一種，由于其具有抑制組蛋白去乙?；傅哪芰?，對炎癥有影響。已有文獻報道，SP對Aβ1-42誘導的神經毒性和脊髓損傷具有保護作用[8]。而且SP可能通過抑制某些信號分子達到抗炎和抗凋亡的作用。

本研究采用Aβ1-42誘導的AD小鼠模型，探討SP對AD小鼠認知功能和炎癥因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 采用SPF級成年ICR小鼠60只，體重(30±5)g，購自遼寧省沈陽市長生生物有限公司，所有程序均按照中國動物福利法和沈陽醫(yī)學院動物倫理委員會的準則進行。造模前適應性飼養(yǎng)1周，之后按照隨機原則進行分組，動物房溫度：18～22 ℃，濕度：50%～60%，燈光照射時間12 h明12 h暗交替進行，動物可自由進食飲水。

1.2 動物造模 麻醉：將小鼠用異氟烷進行吸入麻醉，麻醉成功后進行備皮及側腦室注射，將小鼠頭部消毒剃毛后，沿小鼠頭部皮膚矢狀線切開1 cm左右的切口，暴露小鼠顱骨前囟點，根據(jù)《小鼠腦立體定位圖譜》確定注射位置，側腦室注射Aβ1-42(Abcam,Cambridge,UK,ab120959)。術后處理：用可吸收手術縫合線進行切口縫合后，再用紅霉素涂抹傷口，最后肌注青霉素3 d預防感染。

1.3 動物分組及給藥[9-10]將ICR小鼠隨機分為5組，分別為假手術組、Aβ1-42組、Aβ1-42+SP 50 mg/kg組、Aβ1-42+SP 100 mg/kg組、Aβ1-42+SP 200 mg/kg組，每組12只。在側腦室注射Aβ1-42后1 d進行SP(Sigma公司，p1880)腹腔給藥。給藥分為低、中、高劑量，分別為50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg。假手術組和Aβ1-42組給予生理鹽水，連續(xù)21 d后取材。

1.4 實驗方法

1.4.1 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮主要由白色圓形水池(直徑120 cm,高45 cm)、可移動的黑色平臺和視頻跟蹤系統(tǒng)組成。實驗過程中水溫保持在(25±1)℃。實驗過程分為定位巡航和空間探索兩部分。定位巡航階段為連續(xù)5 d，每天進行2次實驗。小鼠可以成功地找到平臺，并且在平臺上停留10 s。如果小鼠在60 s內找不到平臺，需要人為引導到達平臺并站立10 s，以小鼠找到平臺所用的時間作為學習能力的指標。每只小鼠落在平臺上的時間被記錄為逃避潛伏期。第6天對小鼠進行記憶能力檢測，即空間探索階段，將隱藏平臺撤掉，將小鼠放置在水池中。記錄在1 min內小鼠穿越平臺次數(shù)等。

1.4.2 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA) 使用酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒(伊萊瑞特生物科技股份有限公司，武漢，中國)測定額葉皮質中白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及白細胞介素-4(IL-4)和白細胞介素-10(IL-10)的水平。預先將ELISA試劑盒從4 ℃冰箱取出，置于室溫環(huán)境，室溫平衡20 min后，取出試劑盒按照說明書進行后續(xù)實驗。根據(jù)OD值用Orgin軟件計算出蛋白濃度。

2 結果

2.1 水迷宮結果 采用Morris水迷宮試驗評價小鼠的空間學習和記憶能力。在第5天的定位巡航階段，與假手術組相比，Aβ1-42組小鼠尋找平臺的時間更長(P<0.001)，與Aβ1-42組相比，Aβ1-42+SP 100 mg/kg組和Aβ1-42+SP 200 mg/kg組均顯著降低了逃避潛伏期(P<0.001),而與Aβ1-42+SP 50 mg/kg組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

在空間探測階段，與假手術組相比，Aβ1-42組小鼠穿越平臺次數(shù)較少(P<0.001)，與Aβ1-42組相比，Aβ1-42+SP 100 mg/kg組和Aβ1-42+SP 200 mg/kg組穿越平臺次數(shù)均增加(P<0.05,P<0.001)。而Aβ1-42+SP 50 mg/kg組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。水迷宮結果顯示，阿爾茨海默病小鼠造模成功，并且丙酸鈉改善了Aβ誘導的AD小鼠的認知能力，見表1。

表1 各組小鼠第5天逃避潛伏期時間和第6天穿越平臺次數(shù)

2.2 IL-1β和TNF-α結果 采用鼠源IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒，以空白孔調零檢測其450 nm處的OD值測量表達量。IL-1β結果顯示，與假手術組相比，IL-1β表達水平在Aβ1-42組增加(P<0.001)，與Aβ1-42組相比，IL-1β表達水平在Aβ1-42+SP 100 mg/kg組和Aβ1-42+SP 200 mg/kg組減少(P<0.01，P<0.001)，而在Aβ1-42+SP 50 mg/kg組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

TNF-α結果顯示，與假手術相比，TNF-α表達水平在Aβ1-42組增加(P<0.05)，與Aβ1-42組相比，TNF-α表達水平在Aβ1-42+SP 200 mg/kg組表達減少(P<0.05)，而在Aβ1-42+SP 50 mg/kg組和Aβ1-42+SP 100 mg/kg組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3 IL-4和IL-10的結果 采用鼠源IL-4和IL-10 ELISA試劑盒，以空白孔調零檢測其450 nm處的OD值測量表達量。IL-4結果顯示，與假手術組相比，IL-4表達水平在Aβ1-42組減少(P<0.01)，與Aβ1-42組相比，IL-4表達水平在Aβ1-42+SP 200 mg/kg組表達增加(P<0.05)，而在Aβ1-42+SP50 mg/kg和Aβ1-42+SP 100 mg/kg組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

與假手術組相比，IL-10表達水平在Aβ1-42組減少(P<0.001)，與Aβ1-42組相比，IL-10表達水平在Aβ1-42+SP 100 mg/kg組和Aβ1-42+SP200 mg/kg組表達增加(P<0.01，P<0.001)，而在Aβ1-42+SP 50 mg/kg組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組小鼠IL-1β、TNF-α、IL-4和IL-10表達水平比較

3 討論

AD的主要病理特征之一是由大量Aβ沉積形成的老年斑。Aβ可引起氧化應激、神經炎癥、能量代謝紊亂和離子紊亂等，最終導致退行性病變和神經元丟失[11-12]。

本研究探討了丙酸鈉對AD病理進展中神經炎癥反應的影響。結果顯示，與假手術組相比，Aβ1-42組IL-1β和TNF-α的含量明顯上升，與Aβ1-42組相比，丙酸鈉中劑量組IL-1β的含量下調，高劑量組IL-1β和TNF-α的含量顯著下調。說明丙酸鈉對促炎因子有明顯的調節(jié)作用。另外，本研究也探討了丙酸鈉對抗炎因子的作用，與假手術組相比，Aβ1-42組IL-4和IL-10的含量明顯減少，與Aβ1-42組相比，丙酸鈉中劑量組IL-10的含量顯著上調，丙酸鈉高劑量組IL-4和IL-10的含量上調。先前的研究表明，小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)的先天免疫效應細胞，具有維持大腦穩(wěn)態(tài)的作用。在AD大腦中，活化的小膠質細胞伴隨著促炎細胞因子的增加，如白細胞介素和TNF-α[13-14]。Aβ的積聚可以導致炎癥反應。Aβ激活小膠質細胞，并與受體CD14、CD36和CD47結合。這種相互作用使小膠質細胞分泌更多的促炎介質[15]。有研究顯示，丁酸鈉可抑制小膠質細胞的激活，減少神經炎癥的發(fā)生和Aβ的積聚[16]。丙酸鈉在體外神經炎癥模型和體內脊髓損傷模型中，可減少炎癥過程，具有神經保護作用。正常衰老細胞與抗炎因子IL-4和IL-10降低有關，IL-10通過抑制促炎細胞因子受體表達和激活來減少促炎細胞因子的產生[17]，因此，IL-10的減少可能導致促炎細胞因子表達延長和增加，使衰老的大腦容易受到傷害。本研究支持丙酸鈉可通過降低促炎因子的表達，提高抗炎因子的表達，進而減少AD小鼠的神經炎癥反應，有效改善了小鼠的認知功能。

綜上所述，在Aβ1-42誘導的AD小鼠動物模型上，本研究提供了丙酸鈉具有治療潛力的實驗證據(jù)。丙酸鈉通過減少促炎因子IL-1β和TNF-α的表達，提高抗炎因子IL-4和IL-10的表達，改善AD小鼠的認知能力。丙酸鈉調控AD模型中促炎因子和抗炎因子平衡的具體機制有待進一步研究。