牛玉季,高帆,張亞茹,李雯雯,杜鋼軍

河南大學(xué)藥學(xué)院 藥物研究所,開(kāi)封475004

隨著環(huán)境污染加劇和人類生活方式的改變,全球癌癥發(fā)病率和死亡率呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)。肝癌是亞洲人群病死率最高的惡性腫瘤之一[1]。我國(guó)每年因肝癌死亡人數(shù)占全球肝癌死亡病例數(shù)的51%。2018年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示[2],在185個(gè)被統(tǒng)計(jì)的國(guó)家中,13個(gè)國(guó)家肝癌的發(fā)病率占國(guó)內(nèi)癌癥總發(fā)病率的首位[3]。目前,肝癌的常規(guī)治療方法主要包括手術(shù)、放療、介入治療等,但多數(shù)患者耐受性差、復(fù)發(fā)率高、耐藥性高[4]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療腫瘤,具有毒副作用小、不易復(fù)發(fā)、效果顯著等優(yōu)點(diǎn)。中藥能夠多成分、多靶點(diǎn)、系統(tǒng)性調(diào)節(jié)機(jī)體功能,抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,提高患者的生存期和生存質(zhì)量[5],但因作用機(jī)制不明,限制了其推廣應(yīng)用。勒馬回,別名水蔓菁、斬龍劍、蜈蚣草等,屬于多年生草本,以地上全草入藥[6-7]。勒馬回在民間最早用于充饑,廣泛分布于河北、山西、山東、河南、江蘇等地[8]。其主要成分有黃酮類、酚類、揮發(fā)油類、有機(jī)酸類等[9]。1977年版《中國(guó)藥典》一部記載,勒馬回味苦,性微寒,具有清熱解毒、利尿、止咳化痰等功效,與肝癌的中醫(yī)病機(jī)相符合。本研究旨在探討勒馬回對(duì)小鼠H22肝癌移植瘤生長(zhǎng)的影響,并采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析其抑制腫瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制。

1 試驗(yàn)材料

1.1 藥材

勒馬回購(gòu)自河南省開(kāi)封市天濟(jì)大藥房,經(jīng)河南大學(xué)生藥教研室袁王俊教授鑒定為玄參科植物水蔓菁(Veronica linariifoliaPall.ex Link subsp.Dilatata(Nakai et Kitag.)Hong)的地上干燥全草。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和瘤株

雄性昆明小鼠,體質(zhì)量M=18～26 g,由河南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SCXK(豫)2015-0002;H22肝癌細(xì)胞,由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。

1.3 儀器

EM-KC150 數(shù)顯游標(biāo)卡尺(河?xùn)|區(qū)星光扳鉗工具廠);ThermoFisher Multiskan FC 酶標(biāo)儀(上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司);超凈工作臺(tái)(蘇州仁川潔凈科技有限公司);LDZX-75KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋(四川新德醫(yī)療器械廠);HT-100血流變黏度測(cè)試儀(淄博恒拓分析儀器有限公司);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)等。

1.4 試劑

印度墨汁;生理鹽水;EDTA-2Na;0.1%(v/v)Na HCO3。

2 試驗(yàn)方法

2.1 勒馬回水煎液制備方法

稱取勒馬回干燥全草40 g,加蒸餾水適量沒(méi)過(guò)藥材,浸泡30 min,中火煎煮30 min,過(guò)濾,取濾液。重復(fù)上述過(guò)程,煎煮3次,合并濾液,文火加熱濃縮至200 mL,得到濃度為0.2 g/mL 的勒馬回水煎液[10],分裝置于-80 ℃冰箱內(nèi)。

2.2 H22皮下移植瘤小鼠模型的建立

取接種9～10 d的H22肝癌腹水型小鼠,處死,于無(wú)菌環(huán)境下抽取乳白色腹水,離心,收集沉淀細(xì)胞;用無(wú)菌生理鹽水稀釋成濃度為1×107個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,于每只小鼠右腋下皮下接種瘤液0.2 mL。

2.3 分組與給藥

接種瘤液后次日,將33只小鼠隨機(jī)分為3組,分別為正常組、模型組和給藥組,每組11只。給藥組按體質(zhì)量0.2 mL/10 g,1次/d,勒馬回水煎液灌胃;模型組等劑量生理鹽水灌胃。

2.4 觀察指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后,每天記錄各組小鼠的體質(zhì)量變化情況。待小鼠皮下長(zhǎng)出可觸摸到的瘤塊時(shí),用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤的長(zhǎng)徑a和短徑b,計(jì)算瘤體積V。模型組小鼠腋下瘤體積平均直徑大于20 mm 時(shí)終止實(shí)驗(yàn)。過(guò)量麻醉處死小鼠,取瘤塊、肝臟、胸腺和脾臟,并記錄瘤質(zhì)量和臟器質(zhì)量,計(jì)算腫瘤抑制率R和胸腺指數(shù)Kth、脾臟指數(shù)Ksp[11]。

式中,m1為模型組平均瘤質(zhì)量,m2為給藥組平均瘤質(zhì)量,mth為胸腺質(zhì)量,msp為脾臟質(zhì)量,M為體質(zhì)量。

2.5 勒馬回對(duì)荷瘤小鼠血流變的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束,各小鼠摘眼球取血1.0 mL,置于預(yù)先制備的EDTA-2Na抗凝管中,輕輕混勻。上機(jī)檢測(cè)血流變各項(xiàng)指標(biāo):全血黏度(高切、中切、低切)、血漿黏度。

2.6 碳粒廓清實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束,小鼠經(jīng)尾靜脈注射印度墨汁(1∶4生理鹽水稀釋),每只小鼠注射劑量為0.1 mL/10 g體質(zhì)量。注射后立即計(jì)時(shí),分別于注射后1 min、10 min經(jīng)眼眶采取20μL 血,立刻加入2 mL 0.1%(v/v)NaHCO3混勻,離心。在650 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A,計(jì)算廓清指數(shù)Kex和吞噬系數(shù)α[12]。

式中,A1、A2分別為取血時(shí)間t1、t2時(shí)的吸光度,mli為肝臟質(zhì)量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.8 勒馬回有效成分的搜集與篩選

以“勒馬回”和“水蔓菁”為關(guān)鍵詞,查閱文獻(xiàn)得到有效成分23種,主要包括黃酮類、酚類和揮發(fā)油類。在化源網(wǎng)(https://www.chemsrc.com/)中查詢其CAS號(hào),并保存。采用上海有機(jī)所中藥與化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)(http://www.organchem.csdb.cn.)對(duì)勒馬回(水蔓菁)有效成分進(jìn)行檢索,得到有效成分,保留其CAS號(hào)。利用CAS號(hào),在TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)中根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥20%、類藥性(druglikeness,DL)≥0.1進(jìn)行篩選[13],利用PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載有效成分的SMILES號(hào)。

2.9 有效成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用篩選得到的有效成分的SMILES 號(hào)在Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/)中得到有效成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn),通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/),將預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的蛋白名轉(zhuǎn)換為基因名。

2.10 癌癥治療靶點(diǎn)的篩選與成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)中,以“cancer”和“l(fā)iver cancer”為關(guān)鍵詞篩選出有關(guān)癌癥的治療靶點(diǎn),以“immunity”為關(guān)鍵詞篩選出與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)。通過(guò)OmicShare Tools(http://www.omicshare.com/tools)內(nèi)的在線維恩圖分別得到有效成分的潛在靶點(diǎn)與癌癥治療靶點(diǎn)和免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)的交集,以提高靶點(diǎn)篩選的可靠性,增大預(yù)測(cè)結(jié)果的可信度[14]。通過(guò)Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,利用該軟件中的“Network Analyzer”對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行相關(guān)拓?fù)鋵W(xué)分析,根據(jù)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果篩選出勒馬回發(fā)揮抗腫瘤作用和免疫調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵成分。

2.11 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點(diǎn)的篩選

將2.10得到的交集靶點(diǎn)文件上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)文件,設(shè)置蛋白物種為人源,隱去游離點(diǎn),得到PPI網(wǎng)絡(luò)文件;將該文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖,利用該軟件中的“Network Analyzer”功能和“Cyto NCA”插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值(degree)篩選出核心靶點(diǎn)。

2.12 富集分析和成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將2.10 得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)中,選擇物種為人源,進(jìn)行GO 功能注釋分析和KEGG 通路富集分析,以P＜0.05為篩選條件,得到勒馬回發(fā)揮抗腫瘤作用和免疫調(diào)節(jié)作用的有關(guān)通路和生物過(guò)程。再通過(guò)Omicshare在線對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理,根據(jù)富集分析結(jié)果做出氣泡圖。利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建有效成分—核心靶點(diǎn)—信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖。

3 結(jié)果

3.1 勒馬回的抗腫瘤作用

小鼠腋下接種H22肝癌細(xì)胞后,于第5天長(zhǎng)出可觸摸到的瘤塊,之后模型組小鼠腫瘤快速增長(zhǎng)。與模型組比較,給藥組小鼠瘤體積V增加緩慢(P＜0.01),見(jiàn)圖1。腫瘤抑制率R=34.82%,見(jiàn)表1。

圖1 小鼠腫瘤體積變化情況

表1 勒馬回對(duì)H22肝癌小鼠的腫瘤抑制作用

3.2 對(duì)小鼠血流變、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響

與正常組相比,模型組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著降低(P＜0.01),與模型組相比,給藥組小鼠的脾臟指數(shù)Ksp和胸腺指數(shù)Kth顯著升高(P＜0.01),見(jiàn)圖2、圖3。且給藥組小鼠的全血黏度(低切、中切、高切)和血漿黏度均低于模型組(P＜0.01),見(jiàn)圖4、圖5。

圖2 勒馬回對(duì)小鼠脾臟指數(shù)的影響

圖3 勒馬回對(duì)小鼠胸腺指數(shù)的影響

圖4 勒馬回對(duì)小鼠全血黏度的影響

圖5 勒馬回對(duì)小鼠血漿黏度的影響

3.3 碳粒廓清實(shí)驗(yàn)

與正常組比較,模型組小鼠取血時(shí)間t1=1 min和t2=10 min時(shí)的吸光度A均增加(P＜0.01),廓清指數(shù)Kex(P＜0.05)和吞噬系數(shù)α(P＜0.01)均降低;與模型組比較,給藥組小鼠在10 min時(shí)的吸光度A降低(P＜0.01),廓清指數(shù)Kex和吞噬系數(shù)α均有所升高(P＜0.01),見(jiàn)表2、圖6、圖7。

表2 給藥組與非給藥組吸光度、廓清指數(shù)Kex和吞噬系數(shù)α 比較

圖6 勒馬回對(duì)小鼠廓清指數(shù)的影響

圖7 勒馬回對(duì)小鼠吞噬系數(shù)的影響

3.4 勒馬回有效成分的搜集與篩選

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道、上海有機(jī)所化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果,結(jié)合TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出10 種有效成分,見(jiàn)表3。分別是β-谷甾醇(beta-Sitosterol)、6-羥基木樨草素(6-Hydroxyluteolin)、芹黃素(Alizarin)、芹菜素(Apigenin)、兒茶酚(Caulophyllogenin)、蟲(chóng)草酸(cordycepic acid)、大黃素(Emodin)、亞油酸(Linolenic acid)、木樨草素(Luteolin)、地黃素D(rehmaglutin D)。

表3 勒馬回有效成分

3.5 有效成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)中根據(jù)從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的有效成分的SMILES號(hào),得到有效成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)共646個(gè),刪除重復(fù)值后,得到人類相關(guān)基因靶點(diǎn)蛋白共318個(gè),在Uni-Prot數(shù)據(jù)庫(kù),將預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的蛋白名轉(zhuǎn)換為基因名。

3.6 癌癥治療靶點(diǎn)的篩選與成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中,以“cancer”和“l(fā)iver cancer”為關(guān)鍵詞搜索得到共25 460個(gè)相關(guān)靶點(diǎn),根據(jù)“Relevance score”值(score≥7.34)共篩選得到3 178癌癥相關(guān)靶點(diǎn)。同樣,以“immunity”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索篩選,得到3 800個(gè)免疫調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)。利用OmicShare Tools內(nèi)的在線維恩圖功能將勒馬回有效成分對(duì)應(yīng)的317個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)分別與3 177個(gè)癌癥相關(guān)靶點(diǎn)和3 800個(gè)免疫調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)取交集,共得到勒馬回作用于癌癥的潛在靶點(diǎn)共206個(gè),作用于免疫調(diào)節(jié)的潛在靶點(diǎn)共195個(gè)。利用Cytoscape 3.8.0軟件分別構(gòu)建勒馬回發(fā)揮抗腫瘤作用與免疫調(diào)節(jié)作用的“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,“勒馬回抗腫瘤成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中共有節(jié)點(diǎn)215個(gè)(有效成分節(jié)點(diǎn)9個(gè),靶點(diǎn)蛋白基因節(jié)點(diǎn)206個(gè)),邊464條,見(jiàn)圖8。其中橙色代表勒馬回的有效成分,紅色代表潛在勒馬回的抗腫瘤作用靶點(diǎn);“勒馬回免疫調(diào)節(jié)成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中共有節(jié)點(diǎn)204個(gè)(有效成分節(jié)點(diǎn)9個(gè),靶點(diǎn)蛋白基因節(jié)點(diǎn)195個(gè)),邊429條。其中紅色代表勒馬回的有效成分,綠色代表了勒馬回的潛在免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn),見(jiàn)圖9。

圖8 勒馬回抗腫瘤作用成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖9 勒馬回免疫調(diào)節(jié)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

對(duì)上述兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析發(fā)現(xiàn),二者度值排名前三位的化合物節(jié)點(diǎn)相同,分別是木樨草素(Luteolin)、芹菜素(Apigenin)和6-羥基木樨草素(6-Hydroxyluteolin)。推測(cè)這些化合物可能是勒馬回發(fā)揮抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵化合物。

3.7 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點(diǎn)的篩選

將3.6得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)得到蛋白相互作用文件,保存為CSV 格式,再將該文件上傳至Cytoscape 3.8.0軟件中分別構(gòu)建勒馬回抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò),對(duì)兩個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析,取degree值排名前5%的靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn),各得到10個(gè)核心靶點(diǎn),見(jiàn)表4,表5。其中degree 值較高的TP53、MAPK1、AKT1、EGFR、SRC、PIK3R1,既是勒馬回發(fā)揮抗腫瘤作用的核心靶點(diǎn)也是發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的核心靶點(diǎn),推測(cè)這些靶點(diǎn)可能是勒馬回發(fā)揮抗癌作用的重要藥效靶點(diǎn)。

表4 勒馬回抗腫瘤作用核心靶點(diǎn)蛋白

表5 勒馬回免疫調(diào)節(jié)核心靶點(diǎn)蛋白

3.8 富集分析和成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)206個(gè)抗腫瘤作用交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 信號(hào)通路富集分析,以P＜0.05、count＞9為篩選條件,結(jié)果顯示,勒馬回的206 個(gè)潛在抗腫瘤靶點(diǎn)共涉及81 個(gè)GO 生物過(guò)程和91條KEGG 信號(hào)通路。所富集到的GO 生物過(guò)程主要包括“RNA 聚合酶II啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控”“細(xì)胞的增殖與凋亡”“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”“炎癥反應(yīng)”“蛋白質(zhì)磷酸化”等。KEGG 信號(hào)通路主要涉及“癌癥的通路”“PI3K-Akt信號(hào)通路”“癌癥蛋白多糖”“缺氧誘導(dǎo)因子-1 信號(hào)通路”“腫瘤壞死因子信號(hào)通路”“FOXO 信號(hào)通路”“RAS信號(hào)通路”等。由此可初步推測(cè),勒馬回可能是通過(guò)以上的信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用。同樣,對(duì)勒馬回發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的195個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 分析,結(jié)果顯示,勒馬回的195個(gè)潛在免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)共涉及77個(gè)GO 生物過(guò)程和86條KEGG 信號(hào)通路,且這些生物過(guò)程和信號(hào)通路與抗腫瘤潛在靶點(diǎn)所涉及的主要生物過(guò)程和信號(hào)通路基本一致。通過(guò)Omicshare在線分析軟件對(duì)前20個(gè)GO 生物過(guò)程和KEGG 信號(hào)通路進(jìn)行可視化分析,做出氣泡圖,見(jiàn)圖10、圖11。利用Cytoscape 3.8.0 軟件做出有效成分—核心靶點(diǎn)—通路”的網(wǎng)絡(luò)圖,見(jiàn)圖12。圖中包括119個(gè)節(jié)點(diǎn)和409條邊,顯示了勒馬回的有效成分與核心靶點(diǎn)以及相關(guān)通路間的聯(lián)系。其中橙色代表勒馬回的有效成分、紅色代表核心靶點(diǎn)、紫色代表信號(hào)通路。

圖10 勒馬回抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)GO 注釋分析

圖11 勒馬回抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)KEGG通路分析

圖12 勒馬回有效成分—靶點(diǎn)蛋白-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用小鼠H22肝癌模型,評(píng)價(jià)勒馬回對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示,與模型組相比,給藥組小鼠腫瘤生長(zhǎng)緩慢,腫瘤抑制率達(dá)34.82%,達(dá)到藥效學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。臨床數(shù)據(jù)表明,血液流變學(xué)與惡性腫瘤之間有密切的關(guān)系[15],腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)產(chǎn)生組織因子和癌促凝素,使惡性腫瘤的患者血液呈現(xiàn)高黏度、高凝血的狀態(tài),而在高凝狀態(tài)下,血液的流速較慢,有利于癌栓組織的形成和血小板對(duì)腫瘤細(xì)胞的遮蓋,造成免疫逃逸,使得腫瘤細(xì)胞易于在較高黏度的血液中轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散[16]。中醫(yī)藥理論認(rèn)為,肝癌以氣滯血瘀、濕熱蘊(yùn)結(jié)為主[17]。臨床上采用的中藥多具有清熱解毒、理氣活血的功效的中藥[18]?！吨袊?guó)藥典》記載,勒馬回味苦,性微寒,具有清熱解毒的功效。在本實(shí)驗(yàn)中,與正常組相比,模型組小鼠的全血黏度和血漿黏度均高于正常組,而勒馬回能明顯降低模型組小鼠的全血黏度和血漿黏度,表明勒馬回可能通過(guò)降低患癌小鼠的血液黏度來(lái)減少腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。

常規(guī)的癌癥治療手段如化療、放療,常會(huì)干擾機(jī)體免疫系統(tǒng)的正常運(yùn)行,造成機(jī)體免疫力下降,導(dǎo)致抗腫瘤治療失敗。在腫瘤細(xì)胞與機(jī)體的免疫系統(tǒng)相互作用過(guò)程中,腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)某種機(jī)制實(shí)現(xiàn)免疫逃逸,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[19]。因此,機(jī)體免疫能力的提高有助于阻止腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。脾和胸腺是機(jī)體主要的免疫器官(含有B 細(xì)胞、T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞),脾指數(shù)和胸腺指數(shù)升高說(shuō)明免疫器官內(nèi)B 細(xì)胞、T 細(xì)胞的活化,免疫能力得到提高[20]。小鼠尾靜脈注射惰性碳(印度墨汁)后,可經(jīng)巨噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用后從血液中被廓清。因此,廓清指數(shù)和吞噬系數(shù)可以反映單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)清除異物的能力,進(jìn)一步反映出機(jī)體的免疫能力。本研究結(jié)果顯示,與模型組小鼠相比,給藥組小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、碳粒廓清指數(shù)和吞噬系數(shù)均升高,表明勒馬回可以通過(guò)提高小鼠的免疫能力,減少免疫逃逸,發(fā)揮抗腫瘤作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性、系統(tǒng)性與中藥的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑相吻合,為傳統(tǒng)中藥的研究和開(kāi)發(fā)搭建了良好的平臺(tái)[21]。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),篩選出勒馬回9種活性成分,206個(gè)潛在抗腫瘤作用靶點(diǎn)和195個(gè)免疫調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)。通過(guò)PPI靶點(diǎn)蛋白相互作用關(guān)系篩選出勒馬回14 個(gè)核心靶點(diǎn),分別是MAPK1、PIK3R1、TP53、AKT1、SRC、HSP90AA1、IL6、EGF、MYC、VEGFA、JUN、JAK2、RELA、EGFR。經(jīng)KEGG 和GOBP 富集分析,這些靶點(diǎn)主要通過(guò)參與“RNA 聚合酶II啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控”“細(xì)胞的增殖與凋亡”“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”“炎癥反應(yīng)”“蛋白質(zhì)磷酸化”等生物過(guò)程和“癌癥的通路”“PI3K-Akt信號(hào)通路”“癌癥蛋白多糖”“缺氧誘導(dǎo)因子-1 信號(hào)通路”“腫瘤壞死因子信號(hào)通路”“FOXO 信號(hào)通路”“RAS信號(hào)通路”等信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,在細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮著重要作用,其過(guò)度活化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)?；罨腁kt可以直接將叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FoxO)家族磷酸化,促進(jìn)其與抗凋亡結(jié)合蛋白結(jié)合,從而抑制細(xì)胞凋亡。此外該信號(hào)通路還可以通過(guò)上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2m RNA 的表達(dá)來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移,通過(guò)促進(jìn)腫瘤壞死因子(TNF)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤組織血管的生成等[22]。因此,抑制該信號(hào)通路的表達(dá)有利于阻止腫瘤細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)是一種核轉(zhuǎn)錄因子[23],包括HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞單位[24],可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境。該因子的表達(dá)水平也與細(xì)胞的增殖與凋亡、血管生成、腫瘤擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移等過(guò)程相關(guān)[25]。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,初步證實(shí)勒馬回可通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路來(lái)提高機(jī)體的免疫能力,發(fā)揮抗腫瘤作用。作為一種廉價(jià)易得的中藥材,勒馬回值得在腫瘤的預(yù)防和治療方面進(jìn)行深入研究。