劉媛媛，李洪春

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，臨床主要表現(xiàn)為手、足小關(guān)節(jié)等多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，可致患者關(guān)節(jié)疼痛、損傷甚至功能喪失，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。劉振峰等[2]研究表明，骨性關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織中長鏈非編碼RNA母系表達(dá)基因3(LncRNA MEG3)表達(dá)降低，其降低程度與軟骨退化程度升高關(guān)系密切。LI等[3]發(fā)現(xiàn)，LncRNA MEG3通過靶向調(diào)控炎性因子表達(dá)，從而在強(qiáng)直性脊柱炎中發(fā)揮重要作用。胡玲等[4]研究指出，在骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠脊髓背角神經(jīng)細(xì)胞中微小RNA-141(miR-141)表達(dá)升高，并且其升高與模型小鼠關(guān)節(jié)疼痛程度呈正相關(guān)。WANG等[5]研究報道，在結(jié)直腸癌化療耐藥進(jìn)展中，miR-141與LncRNA MEG3存在一定的調(diào)控關(guān)系。但關(guān)于miR-141與LncRNA MEG3在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用及關(guān)系目前尚不清楚。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過程中，炎性因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)起著重要作用[6]。白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、C反應(yīng)蛋白(CRP)為機(jī)體重要的炎癥反應(yīng)標(biāo)志物，三者在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中明顯升高，且其升高程度提示疾病活動程度[7-9]。類風(fēng)濕因子(RF)是一種以變性IgG為靶抗原的自身抗體，目前廣泛應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷[10-11]。本研究通過檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者和體檢健康者血清LncRNA MEG3、miR-141表達(dá)及IL-6、TNF-α、RF、CRP水平，探究血清LncRNA MEG3、miR-141表達(dá)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷評估中的價值及與IL-6、TNF-α、RF、CRP的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月—2021年12月贛榆區(qū)人民醫(yī)院收治的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎40例，其中男4例，女36例；年齡28～59(47.12±9.45)歲；病程0.5～3.2(2.16±0.25)年。①納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]；臨床資料完整。②排除標(biāo)準(zhǔn)：伴其他自身免疫性疾病、高血壓病、糖尿病、感染性疾病、精神疾病及肝、腎功能障礙性疾病者；臨床資料欠缺者。另選取同期正常體檢的健康者40例作為對照組，其中男5例，女35例；年齡26～60(47.55±8.46)歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2主要試劑及儀器 RNA提取試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自賽默飛世爾科技有限公司；IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3研究方法

1.3.1樣本采集：觀察組于來院后第2日采集空腹外周血5 ml，對照組體檢時采集空腹外周血5 ml，3000 r/min離心5 min，分離血清，置于-80 ℃環(huán)境中保存待檢。

1.3.2血清LncRNA MEG3、miR-141表達(dá)檢測：采用qRT-PCR法檢測血清LncRNA MEG3、miR-141表達(dá)水平。取血清樣本加入RNA提取試劑提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄RNA，獲得cDNA。行qRT-PCR檢測，20 μl反應(yīng)體系：cDNA 2 μl，Mix 10 μl，ROX 0.4 μl，上、下游引物各2 μl，DEPC水3.6 μl。將反應(yīng)體系按如下步驟進(jìn)行反應(yīng)：95 ℃ 7 min，1個循環(huán)；95 ℃ 15 s，62 ℃ 32 s，73 ℃ 15 s，40個循環(huán)。LncRNA MEG3以GAPDH為內(nèi)參基因，miR-141以U6為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算血清LncRNA MEG3、miR-141相對表達(dá)量。qRT-PCR引物序列:LncRNA MEG3 上游引物:5'-GGGCTTCTGGAATGAGCATGCTACTG-3',下游引物:5'-ACATTCGAGGTCCCCTTCCCACGTAGGCATC-3';miR-141 上游引物:5'-GCCTGTAGCTTTTCCTACT-3',下游引物:5'-CACGGCGGTTCGTCGAGT-3';GAPDH 上游引物:5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3',下游引物:5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3';U6 上游引物:5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3',下游引物:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.3.3血清IL-6、TNF-α、RF、CRP水平檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測2組血清IL-6、TNF-α水平，采用免疫比濁法檢測血清RF、CRP水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1血清LncRNA MEG3、miR-141表達(dá)水平比較 觀察組血清LncRNA MEG3表達(dá)水平明顯低于對照組，miR-141表達(dá)水平明顯高于對照組(P<0.01)。見表1。

表1 2組血清LncRNA MEG3、miR-141表達(dá)水平比較

2.2血清IL-6、TNF-α、RF、CRP水平比較 觀察組血清IL-6、TNF-α、RF、CRP水平均高于對照組(P<0.01)。見表2。

表2 2組血清IL-6、TNF-α、RF、CRP水平比較

2.3血清LncRNA MEG3、miR-141表達(dá)與IL-6、TNF-α、RF、CRP水平的相關(guān)性 觀察組血清LncRNA MEG3表達(dá)與IL-6、TNF-α、RF、CRP水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，血清miR-141表達(dá)與IL-6、TNF-α、RF、CRP水平呈正相關(guān)(P<0.01)。見表3。

表3 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清LncRNA MEG3、miR-141表達(dá)與IL-6、TNF-α、RF、CRP水平的相關(guān)性

2.4血清LncRNA MEG3、miR-141對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷效能 血清LncRNA MEG3診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的曲線下面積為0.812(95%CI：0.733，0.866)，當(dāng)LncRNA MEG3取最佳截斷值0.81時，診斷敏感度為77.00%，特異度為71.30%；血清miR-141診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的曲線下面積為0.834(95%CI：0.786，0.857)，當(dāng)miR-141取最佳截斷值1.82時，診斷敏感度為75.70%，特異度為84.20%；二者聯(lián)合診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的曲線下面積為0.876(95%CI：0.831，0.912)，診斷敏感度為88.91%，特異度為80.14%。見圖1。

圖1 血清LncRNA MEG3、miR-141診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的ROC曲線

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者多累及手、足、腕、膝關(guān)節(jié)等部位，出現(xiàn)腫脹、畸形、脫位等癥狀，若累及其他器官可出現(xiàn)心肌炎、冠狀動脈炎、皮膚潰瘍、間質(zhì)性腎炎等表現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者的身體健康[13-15]。目前，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生機(jī)制不明，馬武開等[16]認(rèn)為，本病發(fā)生與T淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞釋放大量炎性因子引起骨關(guān)節(jié)破壞有關(guān)。

CHEN等[17]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MEG3通過調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)降解和炎癥反應(yīng)程度在疾病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，其表達(dá)水平明顯降低。LI等[18]在一項動物實驗中指出，LncRNA MEG3可減少肺部感染模型小鼠炎性因子產(chǎn)生。TONG等[19]在高糖誘導(dǎo)的糖尿病視網(wǎng)膜病變模型中發(fā)現(xiàn)，通過抑制LncRNA MEG3表達(dá)可促進(jìn)TNF-α、IL-6等炎性因子分泌，加重疾病進(jìn)程。LI等[20]研究顯示，在骨關(guān)節(jié)炎兔模型中LncRNA MEG3過表達(dá)可降低TNF-α、IL-6水平，從而緩解模型兔疼痛和炎癥反應(yīng)程度。TIAN等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在股骨頭壞死模型小鼠骨組織中miR-141呈高表達(dá)，當(dāng)干預(yù)其表達(dá)使之降低后模型小鼠成骨細(xì)胞活性明顯改善，提示干預(yù)miR-141表達(dá)可延緩股骨頭壞死疾病進(jìn)展。

IL-6和TNF-α是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎重要的炎癥反應(yīng)標(biāo)志物，其水平與疾病程度呈正相關(guān)[22-25]。IL-6通過促使胸腺細(xì)胞及T細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病，與本病發(fā)生密不可分，還可通過促進(jìn)B細(xì)胞成熟分泌RF抗體，及促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞增生導(dǎo)致關(guān)節(jié)受損[26]。TNF-α是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病重要的促炎細(xì)胞因子，由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等分泌，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)，促進(jìn)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮黏附滲透導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及滑膜細(xì)胞等細(xì)胞生長因子釋放，促進(jìn)膠原降解、骨質(zhì)破壞及軟骨損傷[27]。RF是臨床診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎最常用的實驗室指標(biāo)，陽性檢出率為50%～90%，但在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化病、多發(fā)性心肌炎等其他免疫性疾病中常呈陽性，加之某些健康者中也會呈現(xiàn)陽性，故臨床醫(yī)生通常用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的輔助診斷，不宜單獨(dú)應(yīng)用。CRP是肝臟合成的急性時相反應(yīng)蛋白，雖然反映類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者炎癥反應(yīng)程度及病情的效果不是很好，但卻可通過檢測其陽性表達(dá)預(yù)測是否為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎所引起的炎癥反應(yīng)，故可作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎較好的輔助檢查指標(biāo)。本研究顯示，觀察組血清LncRNA MEG3表達(dá)明顯低于對照組，血清miR-141表達(dá)明顯高于對照組，血清IL-6、TNF-α、RF、CRP水平高于對照組，且觀察組血清LncRNA MEG3表達(dá)與IL-6、TNF-α、RF、CRP水平均呈負(fù)相關(guān)，血清miR-141表達(dá)與IL-6、TNF-α、RF、CRP水平均呈正相關(guān)。提示LncRNA MEG3、miR-141可能通過調(diào)控上述炎性因子表達(dá)水平，影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。

本研究還發(fā)現(xiàn)，血清LncRNA MEG3、miR-141聯(lián)合檢測診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的曲線下面積為0.876，敏感度為88.91%，特異度為80.14%，二者聯(lián)合診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的效能高于單一診斷。提示血清LncRNA MEG3、miR-141聯(lián)合檢測對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷價值較高。

綜上所述，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清LncRNA MEG3表達(dá)降低、miR-141表達(dá)升高，且與IL-6、TNF-α、RF、CRP水平具有顯著相關(guān)性，二者可能通過調(diào)控上述炎性因子表達(dá)參與疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，且二者聯(lián)合檢測對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷效能較高。