蘇 靜

綿陽市中心醫(yī)院血液內(nèi)科，四川綿陽 621000

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種典型的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，由單克隆漿細胞在骨髓微環(huán)境中異常積累引起[1]。主要特征為骨重塑嚴(yán)重失衡引起的骨病變[2]。MM是一種復(fù)雜的疾病，其潛在的分子機制尚未完全闡明，探索創(chuàng)新的治療策略對于有效治療MM患者至關(guān)重要。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是新發(fā)現(xiàn)的一類功能RNA分子，其長度超過200個核苷酸，幾乎不具有蛋白質(zhì)編碼能力[3-4]。lncRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和分化中發(fā)揮著重要作用[5]。此外，lncRNA已被證明在人類癌癥中具有異常調(diào)節(jié)作用，可能作為癌癥促進因子或癌癥抑制因子發(fā)揮作用[6]。lncRNA ANRIL已在家族性黑色素瘤患者中被鑒定。有研究報道，lncRNA ANRIL過表達是幾種人類癌癥的危險因素。例如，沉默lncRNA ANRIL通過調(diào)節(jié)白細胞介素(IL)-33/生長刺激表達基因2(ST2)減少心肌細胞凋亡[7]。lncRNA ANRIL通過增強NF-κB信號通路促進胃癌進展[8]。lncRNA ANRIL通過調(diào)節(jié)自噬途徑中的微小RNA(miRNA)-99a和miRNA-449a促進血管生成和血栓形成[9]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，miR-411-3p介導(dǎo)的lncRNA ANRIL通過調(diào)節(jié)低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)抑制MM的惡性增殖和腫瘤干細胞樣特性[10]，表明lncRNA ANRIL、HIF-1α和MM發(fā)展密切相關(guān)。另外有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)展中l(wèi)ncRNA ANRIL與miR-199a-5p、miR-199a-5p與HIF-1α具有靶向作用，但是在MM中，三者是否有聯(lián)系尚不明確，而且目前還沒有足夠的證據(jù)表明lncRNA ANRIL在MM細胞中的表達和功能。因此，本研究旨在探討lncRNA-ANRIL通過誘導(dǎo)HIF-1α對MM惡性增殖的影響及其作用機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 從本院選取55例MM患者為研究對象，均符合人民衛(wèi)生出版社出版的《血液病診斷與鑒別診斷圖譜》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時選取55例健康志愿者作為對照。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均知情同意。采集治療前MM患者與健康志愿者的外周靜脈血，離心后收集血漿。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人MM細胞系U266從美國典藏培養(yǎng)中心(ATCC)獲得，在含有15%胎牛血清(美國Gibco)、1%谷氨酰胺和1%鏈霉素-青霉素(美國Invitrogen)的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。過表達對照載體(mimics NC)、miR-199a-5p過表達載體(miR-199a-5p mimics)、敲低對照載體(inhibitor NC)、miR-199a-5p敲低載體(miR-199a-5p inhibitor)、ANRIL陰性對照(si-NC)、ANRIL沉默載體(si-ANRIL)、HIF-1α沉默載體(si-HIF-1α)由中國廣東RiboBio公司合成。U266細胞(1×106個/孔)經(jīng)Lipofectamine 2000試劑(美國Invitrogen)轉(zhuǎn)染后，接種于6孔板，收集轉(zhuǎn)染的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2雙熒光素酶報告基因活性檢測 miRanda軟件預(yù)測lncRNA ANRIL與miR-199a-5p之間的結(jié)合位點。TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)用于預(yù)測miR-199a-5p的靶位點，用熒光素酶報告基因試驗驗證miR-199a-5p與lncRNA ANRIL或HIF-1α的結(jié)合。構(gòu)建ANRIL野生型(wt-ANRIL)和突變型(mut-ANRIL)報告載體，并插入psiCHECK-2。構(gòu)建HIF-1α野生型(wt-HIF-1α)和突變型(mut-HIF-1α)報告載體并插入psiCHECK-2。報告質(zhì)粒(wt-ANRIL、mut-ANRIL、wt-HIF-1α、mut-HIF-1α)與mimics NC、miR-199a-5p mimics質(zhì)粒用Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染U266細胞48 h。最后，用雙熒光素酶報告系統(tǒng)試劑盒(Promega)檢測熒光素酶活性。

1.2.3流式細胞術(shù)測定細胞凋亡 使用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(上海Beyotime Biotechnology)檢測U266細胞的凋亡。U266細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗，以2 000 r/min離心10 min。U266細胞重懸于結(jié)合緩沖液(500 μL)中，然后與Annexin V-FITC(5 μL)和碘化丙啶(10 μL)在25 ℃條件下孵育20 min。最后采用流式細胞儀(美國BD Biosciences)對凋亡細胞進行區(qū)分，計算凋亡率。

1.2.4細胞增殖活力測定 將U266細胞(5 000個/孔)接種于96孔板，培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染0 h和48 h后，添加10 μL CCK-8(日本Dojindo)到每個孔，與細胞孵育4 h。最后在450 nm波長下檢測吸光度。

1.2.5RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR 所有的RNA均使用TRIzol試劑(美國Invitrogen)從血漿和細胞中提取，然后用PrimeScript RT試劑盒按照廠家說明書(日本Takara)將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。miRNA采用DNaseⅠ處理樣品，去除樣品中的gDNA。隨后使用miR-X miR第一鏈合成試劑盒(日本Takara)合成cDNA。最后，利用SYBR Premix Ex TaqⅡ(日本Takara)和羅氏LightCycler 480 PCR儀進行qRT-PCR反應(yīng)。引物序列如下：lncRNA ANRIL-F 5′-GGACTACAGATGCACCACCAT-3′；lncRNA ANRIL-R 5′-TGAGCACTGTGTCCATAGCA-3′;miR-199a-5p-F 5′-GGCGCCCAGTGTTCAGACTAC-3′；miR-199a-5p-R 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；HIF-1α-F 5′-ACCTATGACCTGCTTGGTGC-3′;HIF-1α-R 5′-GGCTGTGTCGACTGAGGAAA-3′;GAPDH-F 5′-AAATCCCATCACCATCTTCCAG-3′;GAPDH-R 5′-GAGTCCTTCCACGATACCAAAGTTG-3′。

1.2.6Western blot U266細胞用預(yù)冷的PBS洗滌，用RIPA裂解緩沖液進行裂解。將等量的蛋白樣品通過10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用5%脫脂牛奶封閉1.5 h后，用一抗[抗caspase3(英國Abcam,ab32351)、抗caspase 9(英國Abcam，ab32539)、抗Bax(英國Abcam，ab32503)、抗Bcl-2(英國Abcam，ab32124)、抗GAPDH(英國Abcam，ab8485)]和辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗孵育PVDF膜。用Pierce ECL Western blot(美國Thermo Scientific)觀察條帶。采用GAPDH作為內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α在MM患者和健康志愿者血漿中的表達差異 MM患者血漿lncRNA ANRIL、HIF-1α表達高于健康志愿者(P<0.05)，MM患者血漿miR-199a-5p表達低于健康志愿者(P<0.05)。見圖1。

注：A為MM患者和健康志愿者血漿lncRNA ANRIL表達比較；B為MM患者和健康志愿者血漿miR-199a-5p表達比較；C為MM患者和健康志愿者血漿HIF-1α表達比較;**表示P<0.05。

2.2lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α三者之間的關(guān)系 生物信息學(xué)軟件預(yù)測了lncRNA ANRIL與miR-199a-5p、miR-199a-5p和HIF-1α之間的結(jié)合位點(圖2A、2B)。熒光素酶報告基因檢測顯示，與wt-ANRIL+mimics NC組相比，wt-ANRIL+miR-199a-5p mimics的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；mut-ANRIL+mimics NC組與mut-ANRIL+miR-199a-5p mimics組熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2C)；與wt-HIF-1α+mimics NC組相比，wt-HIF-1α+miR-199a-5p mimics組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；mut-HIF-1α+mimics NC組與mut-HIF-1α+miR-199a-5p mimics組熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖2D)。進一步研究了lncRNA ANRIL對miR-199a-5p、HIF-1α表達的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)與si-NC組相比，si-ANRIL組細胞內(nèi)HIF-1α相對表達量明顯降低(P<0.05)，與inhibitor NC組相比，miR-199a-5p inhibitor組細胞內(nèi)HIF-1α相對表達量明顯升高(P<0.05)，表明lncRNA ANRIL表達對HIF-1α表達有正向調(diào)控作用，miR-199a-5p表達對HIF-1α表達有負向調(diào)控作用(圖2E)。

注：A為lncRNA ANRIL與miR-199a-5p之間的結(jié)合位點；B為miR-199a-5p和HIF-1α之間的結(jié)合位點；C為lncRNA ANRIL等雙熒光素酶活性檢測；D為HIF-1α等雙熒光素酶活性檢測；E為qRT-PCR分析HIF-1α mRNA相對表達水平;**表示P<0.05。

2.3lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α對U266細胞增殖活力的影響 分析圖3A可知，與si-NC組相比，si-ANRIL組和si-HIF-1α組U266細胞增殖活力明顯降低(P<0.05)；與inhibitor NC組相比，miR-199a-5p inhibitor組U266細胞增殖活力明顯升高(P<0.05)。分析圖3B可知，與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-ANRIL+mimics NC組U266細胞增殖活力明顯升高(P<0.05);pcDNA-3.1(+)+miR-199a-5p mimics組U266細胞增殖活力明顯降低(P<0.05)；與pcDNA-3.1(+)+miR-199a-5p mimics組相比，pcDNA-ANRIL+miR-199a-5p mimics組U266細胞增殖活力明顯升高(P<0.05)。

注：A為CCK-8檢測分別下調(diào)lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α表達后對U266細胞增殖活力的影響；B為CCK-8檢測lncRNA ANRIL通過miR-199a-5p對U266細胞增殖活力的影響;**表示P<0.05。

2.4lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α對U266細胞凋亡的影響 分析圖4A、4B可知，與si-NC組相比，si-ANRIL組和si-HIF-1α組U266細胞凋亡率明顯上升(P<0.05)；與inhibitor NC組相比，miR-199a-5p inhibitor組U266細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。分析圖4C、4D可知，與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-ANRIL+mimics NC組U266細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，pcDNA-3.1(+)+miR-199a-5p mimics組U266細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與pcDNA-3.1(+)+miR-199a-5p mimics組相比，pcDNA-ANRIL+miR-199a-5p mimics組U266細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。

注：A為流式細胞術(shù)檢測分別下調(diào)lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α表達后對U266細胞凋亡的影響；B為A中細胞凋亡率統(tǒng)計結(jié)果；C為流式細胞術(shù)檢測lncRNA ANRIL通過miR-199a-5p對U266細胞凋亡的影響；D為C中細胞凋亡率統(tǒng)計結(jié)果;**表示P<0.05。

2.5lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α對U266細胞內(nèi)Bax、Bcl-2、caspase3和caspase9蛋白相對表達量的影響 分析圖5A可知，與si-NC組相比，si-ANRIL和si-HIF-1α組細胞內(nèi)Bax、caspase3和caspase9表達顯著上調(diào)(P<0.05)，Bcl-2表達顯著下調(diào)(P<0.05)；與inhibitor NC組相比，miR-199a-5p inhibitor組細胞內(nèi)Bax、caspase3和caspase9表達顯著下調(diào)(P<0.05)，Bcl-2表達顯著上調(diào)(P<0.05)。分析圖5B可知，與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-ANRIL+mimics NC組細胞內(nèi)Bax、caspase3和caspase9表達顯著下調(diào)(P<0.05)，Bcl-2表達顯著上調(diào)(P<0.05)，pcDNA-3.1(+)+miR-199a-5p mimics組細胞內(nèi)Bax、caspase3和caspase9表達顯著上調(diào)(P<0.05)，Bcl-2表達顯著下調(diào)(P<0.05)；與pcDNA-3.1(+)+miR-199a-5p mimics組相比，pcDNA-ANRIL+miR-199a-5p mimics組細胞內(nèi)Bax、caspase3和caspase9表達顯著下調(diào)(P<0.05)，Bcl-2表達顯著上調(diào)(P<0.05)。

注：A為Western blot檢測分別下調(diào)lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α表達后對Bax、Bcl-2、caspase3和caspase9表達的影響;B為Western blot檢測lncRNA ANRIL通過miR-199a-5p對Bax、Bcl-2、caspase3和caspase9表達的影響。

2.6lncRNA ANRIL通過miR-199a-5p對HIF-1α表達的影響 與對照組相比，過表達lncRNA ANRIL顯著促進了HIF-1α表達(P<0.05)，而miR-199a-5p mimics組與mimics NC組相比顯著抑制了HIF-1α表達(P<0.05)，和miR-199a-5p mimics組對比，lncRNA ANRIL過表達質(zhì)粒和miR-199a-5p mimics同時轉(zhuǎn)染細胞后顯著促進了HIF-1α表達(P<0.05)。見圖6。

3 討 論

已有研究表明，lncRNA和miRNA的異常表達與MM的進展有關(guān)[9]。前期有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PDIA3P、lncRNA MALAT-1、lncRNA TUG1等在MM患者血漿中呈高表達[11-12]，而miR-193a、miR-29b-3p、miR-610等呈低表達[13]。既往研究報道，lncRNA ANRIL在多種癌癥如視網(wǎng)膜母細胞瘤、卵巢癌、胰腺癌中可作為癌基因發(fā)揮作用[14-15]，而miR-199a-5p在多種癌癥如胃癌、膀胱癌、宮頸癌中可作為抑癌基因發(fā)揮功能[16]。因此，基于lncRNA ANRIL和miR-199a-5p在癌癥中的作用，筆者推測lncRNA ANRIL/miR-199a-5p軸可能參與調(diào)控MM發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ANRIL在MM患者血漿中呈高表達，而miR-199a-5p在MM患者血漿中表達下調(diào)。生物信息學(xué)軟件預(yù)測ANRIL與miR-199a-5p之間存在結(jié)合位點。熒光素酶報告基因檢測和轉(zhuǎn)染實驗進一步表明，miR-199a-5p是lncRNA ANRIL直接作用的靶點，在U266細胞中miR-199a-5p表達水平受到lncRNA ANRIL的負調(diào)控。本研究揭示了lncRNA ANRIL和miR-199a-5p在MM細胞中的靶調(diào)控關(guān)系，但其具體作用機制還需進一步研究。

越來越多的證據(jù)表明，lncRNA在MM中通過與miRNA競爭性結(jié)合發(fā)揮作用。例如，在MM中，lncRNA OIP5-AS1通過與miR-410競爭性結(jié)合促進細胞增殖[17]。lncRNA CCAT1通過與miR-181a-5p競爭性結(jié)合抑制MM細胞增殖并促進細胞凋亡[18]。因此，揭示lncRNA ANRIL/miR-199a-5p的潛在機制對于了解MM的惡性增殖具有重要意義。為了深入研究lncRNA ANRIL/miR-199a-5p的作用機制，本研究中將lncRNA ANRIL下調(diào)質(zhì)粒、miR-199a-5p抑制劑或lncRNA ANRIL過表達質(zhì)粒與miR-199a-5p模擬物共轉(zhuǎn)染U266細胞，觀察其對細胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制lncRNA ANRIL表達可抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，而抑制miR-199a-5p表達則會得到相反的結(jié)果。lncRNA ANRIL過表達質(zhì)粒協(xié)同miR-199a-5p模擬物共轉(zhuǎn)染進一步促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。雖然lncRNA ANRIL/miR-199a-5p軸在神經(jīng)元損傷中的調(diào)節(jié)作用已被報道[19]，但鮮有其他報道證實lncRNA ANRIL/miR-199a-5p軸在調(diào)節(jié)MM惡性增殖中的作用，這將為MM治療及復(fù)發(fā)防治提供理論指導(dǎo)。HIF-1α作為轉(zhuǎn)錄因子HIF-1的一個亞基，在缺氧反應(yīng)時可受到疾病特異性miRNA的調(diào)控。例如，miR-199a通過調(diào)控HIF-1α/血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號通路對非小細胞肺癌大鼠產(chǎn)生影響[20]。miR-200c下調(diào)HIF-1α并抑制肺癌細胞的遷移。miR-199a-5p是一種疾病特異性miRNA，調(diào)控腫瘤中多種惡性生物學(xué)行為。根據(jù)以往的報道，miR-199a-5p和miR-495在肺癌UPR通路中靶向調(diào)控GRP78[21]。此外，通過靶向HIF-1α-GSK3β-mPTP軸，下調(diào)miR-199a-5p可減弱心肌細胞缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的細胞毒性[22]。然而，miR-199a-5p在MM中的具體作用機制尚不清楚。根據(jù)生物信息學(xué)軟件的預(yù)測，HIF-1α是miR-199a-5p的一個潛在靶點。因此，miR-199a-5p可能通過靶向調(diào)控HIF-1α在MM中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，HIF-1α在MM患者的血漿中呈高表達。熒光素酶報告基因檢測和轉(zhuǎn)染實驗進一步表明，HIF-1α是miR-199a-5p的靶點，在U266細胞中HIF-1α表達受miR-199a-5p的負調(diào)控。因此，本研究在U266細胞中發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p對HIF-1α的靶調(diào)控作用。此外，HIF-1α表達下調(diào)明顯抑制了U266細胞的增殖，表明HIF-1α對U266細胞增殖具有明顯的促進作用。

綜上所述，本研究結(jié)果證實了MM患者血漿lncRNA ANRIL和HIF-1α表達上調(diào)，而miR-199a-5p表達下調(diào)。此外，lncRNA ANRIL通過miR-199a-5p調(diào)控HIF-1α表達，影響細胞增殖和凋亡。這提示lncRNA ANRIL/miR-199a-5p/HIF-1α軸可能作為治療MM的潛在靶點。