徐少華，黃江華，謝曉霞，楊 濤，何曉華，徐 輝

1.四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院，四川成都 610000；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬三臺(tái)醫(yī)院/三臺(tái)縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川綿陽 621100;3.川北醫(yī)學(xué)院附屬三臺(tái)醫(yī)院/三臺(tái)縣人民醫(yī)院傳染病科，四川綿陽 621100

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌侵入人體引發(fā)，發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，目前每年約有180萬人死于該病，是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一[1]。我國肺結(jié)核患者人數(shù)居全球第三位，由于肺結(jié)核的耐藥性與傳染性，我國肺結(jié)核疫情仍很嚴(yán)重，因此，對(duì)肺結(jié)核進(jìn)行早期診斷并準(zhǔn)確評(píng)估肺結(jié)核患者病情，對(duì)其進(jìn)行及時(shí)有效的治療具有重要臨床意義[2]。環(huán)狀RNA(circRNA)是一種新型的非編碼RNA分子，廣泛表達(dá)于真核細(xì)胞中，因其具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、組織特異性，成為多種疾病診斷的理想生物標(biāo)志物[3]。研究顯示，肺結(jié)核患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中circRNF10表達(dá)水平升高，有望作為肺結(jié)核診斷和療效監(jiān)測(cè)的潛在生物標(biāo)志物[4]。hsa_circ_0005836屬于circRNA的一種，其在肺結(jié)核患者PBMCs中的表達(dá)情況少有研究。微小RNA(miRNA)可調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)等，可參與支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺結(jié)核等多種肺部疾病的發(fā)病過程[5]，微小RNA-146b(miR-146b)為miRNA的一種，研究表明，miR-146b在甲狀腺乳頭狀癌患者外周血中表達(dá)顯著上調(diào)，與腫瘤的進(jìn)展和患者預(yù)后不良有關(guān)[6]。miR-146b在肺結(jié)核患者PBMCs中表達(dá)的相關(guān)性尚不清楚。本研究旨在通過檢測(cè)肺結(jié)核患者PBMCs中hsa_circ_0005836與miR-146b的表達(dá)情況，探討二者的相關(guān)性及其與肺結(jié)核的關(guān)系，為肺結(jié)核患者的早期診斷提供有效依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年7月至2021年6月川北醫(yī)學(xué)院附屬三臺(tái)醫(yī)院收治的肺結(jié)核患者85例作為肺結(jié)核組，其中男53例，女32例；年齡21～58歲，平均(41.20±11.50)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)首次確診為肺結(jié)核且未經(jīng)任何治療；(3)肝、腎功能基本正常；(4)半年內(nèi)未使用抗菌藥物及糖皮質(zhì)激素者；(5)患者臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并惡性腫瘤或支氣管擴(kuò)張等其他呼吸系統(tǒng)疾病患者；(2)合并心、肝、腎功能不全者；(3)各種因素導(dǎo)致的自身免疫力低下或近期服用免疫抑制劑者；(4)患有嚴(yán)重精神疾病及語言障礙者。根據(jù)影像學(xué)肺部病灶顯示，<2個(gè)病灶患者48例，≥2個(gè)病灶患者37例；根據(jù)胸部CT顯示，肺部有空洞患者46例，肺部無空洞患者39例。選擇同期在醫(yī)院體檢的健康人員(無肺結(jié)核接觸史且肺部影像檢查正常)90例作為對(duì)照組，其中男50例，女40例；年齡26～65歲，平均(45.56±14.70)歲。肺結(jié)核組與對(duì)照組男女比例、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。本研究經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院附屬三臺(tái)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

表1 兩組一般資料比較[n/n或或n(%)]

1.2試劑與儀器 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)IS59176，德國QIASGEN公司)；RNA提取試劑(Trizol，批號(hào)135402，美國Invitrogen公司)；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(批號(hào)IA-10771，北京冬璞泰和科技有限責(zé)任公司)；超低溫冰箱(型號(hào)DW86L388A，上海坤科儀器設(shè)備有限公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)Gentier96E，西安天隆科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1PBMCs分離及保存 肺結(jié)核組與對(duì)照組分別在抗結(jié)核治療前、體檢時(shí)采集清晨空腹靜脈血(3～5 mL)于EDTA抗凝管保存，使用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液離心分離PBMCs，于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)hsa_circ_0005836和miR-146b表達(dá) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)PBMCs中hsa_circ_0005836、miR-146b相對(duì)表達(dá)量。Trizol試劑提取總RNA，檢測(cè)濃度與純度后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：55 ℃預(yù)熱150 s；95 ℃預(yù)變性60 s；95 ℃變性15 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共38個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算hsa_circ_0005836和miR-146b相對(duì)表達(dá)量。hsa_circ_0005836(內(nèi)參為GAPDH)和miR-146b(內(nèi)參為U6)等引物由上海源葉生物科技有限公司合成。引物序列如下：hsa_circ_0005836上游引物為5′-ACTCATCCTTGAACCTTGC-3′，hsa_circ_0005836下游引物為5′-GGCATCTATGTACTTCAGGAC-3′；miR-146b上游引物為5′-GAGAACTGAATTCCATAGG-3′，miR-146b下游引物為5′-GAACATGTCTGCGTATCTC-3′；GAPDH上游引物為5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，GAPDH下游引物為5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′；U6上游引物為5′-GCTTCGGCACATATACTAAAT-3′，U6下游引物為5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

2 結(jié) 果

2.1對(duì)照組和肺結(jié)核組PBMCs中hsa_circ_0005836、miR-146b表達(dá)水平比較 肺結(jié)核組PBMCs中hsa_circ_0005836表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，miR-146b表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 對(duì)照組和肺結(jié)核組PBMCs中hsa_circ_0005836、miR-146b表達(dá)水平比較

2.2肺結(jié)核患者PBMCs中hsa_circ_0005836、miR-146b表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 不同年齡、性別的肺結(jié)核患者PBMCs中hsa_circ_0005836、miR-146b表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與肺部病灶<2個(gè)的肺結(jié)核患者比較，肺部病灶≥2個(gè)的肺結(jié)核患者PBMCs中hsa_circ_0005836表達(dá)水平顯著降低，miR-146b表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與肺部無空洞的肺結(jié)核患者比較，肺部有空洞的肺結(jié)核患者PBMCs中hsa_circ_0005836表達(dá)水平顯著降低，miR-146b表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 肺結(jié)核患者PBMCs中hsa_circ_0005836、miR-146b表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3肺結(jié)核患者PBMCs中hsa_circ_0005836與miR-146b表達(dá)水平的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示，肺結(jié)核患者PBMCs中hsa_circ_0005836與miR-146b表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.692，P<0.05)。見圖1。

圖1 肺結(jié)核患者PBMCs中hsa_circ_0005836與miR-146b表達(dá)水平的相關(guān)性

2.4ROC曲線分析hsa_circ_0005836與miR-146b對(duì)肺結(jié)核的診斷價(jià)值 hsa_circ_0005836診斷肺結(jié)核的曲線下面積(AUC)為0.868，靈敏度為87.06%，特異度為81.54%，截?cái)嘀禐?.77；miR-146b診斷肺結(jié)核的AUC為0.839，靈敏度為83.53%，特異度為76.38%，截?cái)嘀禐?.32；hsa_circ_0005836和miR-146b二者聯(lián)合診斷肺結(jié)核的AUC為0.896，靈敏度為88.35%，特異度為75.00%。見圖2。

圖2 hsa_circ_0005836與miR-146b診斷肺結(jié)核的ROC曲線

3 討 論

circRNA是一類單鏈閉合RNA分子，不受RNA外切酶影響，在真核生物中具有高度穩(wěn)定性、豐富性和進(jìn)化保守性。研究顯示，circRNA具有miRNA和“蛋白質(zhì)海綿”的作用，在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和剪接方面發(fā)揮著重要作用，與腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)[8-9]。CHENG等[10]研究表明，circRNA-012091調(diào)控的PPP1R13B通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，在矽肺肺纖維化的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。circRNA在組織和外周血中均有表達(dá)，且具有良好的穩(wěn)定性與特異性，可作為惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、炎癥性疾病等多種疾病的診斷標(biāo)志物[11-13]。多項(xiàng)研究顯示，多種circRNA在肺結(jié)核患者外周血中有表達(dá)，對(duì)肺結(jié)核的診斷具有一定價(jià)值[14-15]。黃自坤等[14]研究表明，肺結(jié)核患者血漿hsa_circ_0009024表達(dá)水平顯著升高，且與患者病情相關(guān)，可作為肺結(jié)核診斷和療效監(jiān)測(cè)的潛在標(biāo)志物。hsa_circ_0005836為circRNA的一種，ZHUANG等[15]通過高通量測(cè)序活動(dòng)性肺結(jié)核患者PBMCs中circRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0005836表達(dá)顯著下調(diào)，提示hsa_circ_0005836可能成為肺結(jié)核的新型潛在生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，肺結(jié)核組患者PBMCs中hsa_circ_0005836表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組人員，且肺部病灶≥2個(gè)的肺結(jié)核患者PBMCs中hsa_circ_0005836表達(dá)水平顯著低于肺部病灶<2個(gè)的肺結(jié)核患者，肺部有空洞的肺結(jié)核患者PBMCs中hsa_circ_0005836表達(dá)水平顯著低于肺部無空洞的肺結(jié)核患者，提示hsa_circ_0005836可能與肺結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可反映患者病情嚴(yán)重程度。

miRNA可參與細(xì)胞增殖、凋亡、代謝等多個(gè)生理和病理過程，與非小細(xì)胞肺癌、急性肺損傷、肺結(jié)核等肺部疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，調(diào)控結(jié)核分枝桿菌感染后的免疫反應(yīng)、炎癥因子釋放等過程[16-17]。miR-146b為miRNA的一種，是炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，在先天免疫中具有重要作用，與多種疾病密切相關(guān)。研究顯示，急性ST段抬高型心肌梗死患者血漿中miR-146b表達(dá)水平升高，與肌酸激酶同工酶、心肌肌鈣蛋白I及冠脈造影評(píng)分呈正相關(guān)[18]。miR-146b的異常表達(dá)與肺部疾病的發(fā)生有關(guān)，ZHANG等[19]研究顯示，miR-146b可通過抑制髓樣分化因子88(MyD88)/核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路減輕小兒肺炎的炎癥損傷。在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷的小鼠模型中，過表達(dá)的miR-146b可顯著減少LPS誘導(dǎo)的肺損傷、肺部炎癥、總細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、促炎細(xì)胞因子和支氣管肺泡灌洗液中的趨化因子水平[20]。本研究結(jié)果顯示，肺結(jié)核組患者PBMCs中miR-146b表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組人員，且肺部病灶≥2個(gè)和肺部有空洞的肺結(jié)核患者PBMCs中miR-146b表達(dá)水平較高，表明miR-146b可能成為評(píng)價(jià)肺結(jié)核患者病情的一項(xiàng)指標(biāo)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患者PBMCs中hsa_circ_0005836與miR-146b表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.692,P<0.05)，表明二者可能存在負(fù)向調(diào)控關(guān)系。因此，本研究推測(cè)hsa_circ_0005836通過靶向調(diào)控miR-146b的表達(dá)參與肺結(jié)核疾病的發(fā)生與發(fā)展，但具體作用機(jī)制有待結(jié)合基礎(chǔ)研究進(jìn)一步證實(shí)。本研究通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0005836、miR-146b聯(lián)合診斷肺結(jié)核的AUC為0.896，靈敏度為88.35%，特異度為75.00%，表明hsa_circ_0005836、miR-146b聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肺結(jié)核具有一定診斷價(jià)值。

綜上所述，肺結(jié)核患者PBMCs中hsa_circ_0005836呈低表達(dá)，miR-146b呈高表達(dá)，二者呈負(fù)相關(guān)，均與患者病情有關(guān)，可能作為肺結(jié)核診斷的標(biāo)志物，但是其具體作用機(jī)制及臨床實(shí)用價(jià)值仍需結(jié)合種族特異性、人群易感性、社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況等因素做進(jìn)一步系統(tǒng)研究。