李榮林，唐 君，艾仄宜，穆 兵，楊亦揚(yáng)，陳正濤，史海華

（1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院休閑農(nóng)業(yè)研究所，南京 210014；2江蘇省溧陽(yáng)市玉蓮生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，江蘇溧陽(yáng) 213333）

0 引言

抗逆能力的發(fā)生是植物適應(yīng)環(huán)境延續(xù)生存的一種策略，無(wú)論是遭受病蟲(chóng)侵襲還是應(yīng)對(duì)機(jī)械損傷、氣候、土壤的變化，植物都會(huì)自主產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)，這些反應(yīng)包括酶系統(tǒng)的變化，代謝物質(zhì)合成的變化以及對(duì)逆境引起的機(jī)體自由基的清除能力。例如大多數(shù)植物受到昆蟲(chóng)取食時(shí)損傷部位會(huì)發(fā)生褐變反應(yīng)，這是由于損傷部位多酚含量上升、多酚氧化酶或過(guò)氧化物酶活性升高的結(jié)果[1]。在作物栽培管理中，采用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)提高作物的抗逆能力是提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要手段之一。

很多植物的提取物被開(kāi)發(fā)成生物農(nóng)藥，這是利用這些提取物中的成分對(duì)害蟲(chóng)或病原菌的直接殺傷作用，植物精油的抑菌機(jī)制是揮發(fā)性成分滲入病原物細(xì)胞引起細(xì)胞破裂或死亡，芳香植物揮發(fā)物對(duì)害蟲(chóng)及其天敵的作用主要是通過(guò)氣味反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，已有很多證據(jù)顯示芳香植物的揮發(fā)物可用于調(diào)節(jié)害蟲(chóng)或天敵的行為，因而用于植物的生態(tài)防護(hù)[2]。芳香植物或香辛植物提取物施用于作物后也可以引起作物酶系統(tǒng)發(fā)生直接變化，從而對(duì)植物生理活動(dòng)產(chǎn)生調(diào)節(jié)，細(xì)辛、苦參、蛇床子的提取物不僅對(duì)茄子黃萎病病原菌產(chǎn)生直接抑制，而且在一定濃度范圍(1～4 mg/L)茄子POD和PAL、SOD活性均表現(xiàn)出隨提取物濃度的升高而升高的趨勢(shì)，這些指標(biāo)的升高能提高植株抗逆性[3-4]，100 mg/L的香樟葉石油醚提取物能直接抑菌并顯著提高草莓果實(shí)PAL、PPO和POD的活性，增強(qiáng)果實(shí)自身的抗真菌病害能力[5]。

以植物中特定成分為基礎(chǔ)仿生合成的外源物質(zhì)同樣能夠誘導(dǎo)植物特定酶系統(tǒng)的變化，進(jìn)而在代謝上和生理上產(chǎn)生響應(yīng)。β-氨基丁酸(BABA)，茉莉酸或茉莉酸酯(JA，MJA)，水楊酸或水楊酸酯(SA，MSA)，苯并噻二唑(BTH)可以誘導(dǎo)植物抗病或抗蟲(chóng)[6-7]。源于芳香植物或茶樹(shù)本身的特定物質(zhì)外源施用也可以誘導(dǎo)茶樹(shù)發(fā)生復(fù)雜的生理反應(yīng)。在茶樹(shù)上施用青葉醇、羅勒烯、法尼烯、橙花醇等物質(zhì)可以誘導(dǎo)茶樹(shù)揮發(fā)物的發(fā)生量和組成的顯著變化，并發(fā)揮更多的生理或生態(tài)調(diào)節(jié)功能[8-9]。水楊酸或水楊酸甲酯(SA，MSA)能顯著提高茶樹(shù)對(duì)鹽脅迫的防御能力[10]。

茶園間作芳香植物以達(dá)到遮蔭、改良土壤、防御病蟲(chóng)害的研究已有報(bào)道[11]，但芳香植物提取物對(duì)茶樹(shù)抗逆生理的影響研究較少。本試驗(yàn)選擇迷迭香、薄荷、紫蘇等較為常見(jiàn)易于生長(zhǎng)亦適合茶園間作的香草植物，探討它們的復(fù)合提取物對(duì)茶樹(shù)生理的影響。同時(shí)選擇冬青油（主要成分水楊酸甲酯）、二氫茉莉酸酯（茉莉酸甲酯衍生物）做參照一并進(jìn)行試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備

Eppendorf 5702離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf儀器有限公司），759S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司），Light Cycler 480 II實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（瑞士Roche group）。

1.2 植物提取物

迷迭香、紫蘇、貓薄荷新鮮葉片液氮磨碎，葉片水分按75%計(jì)算，然后以干重計(jì)按料液比1:10在75%工業(yè)乙醇中浸提72 h,浸提完畢4層紗布過(guò)濾得植物粗提液，-20℃保存。

冬青油（水楊酸甲酯≥99.2%），二氫茉莉酸酯（茉莉酸酯衍生物，二氫茉莉酸酯≥99%）購(gòu)于江西吉安紅星香料有限公司，預(yù)先以75%乙醇稀釋至1%(V/V)作為貯備液，-20℃保存。

1.3 供試茶樹(shù)

南京中山陵茶場(chǎng)，黃山種，15年生。

1.4 試驗(yàn)處理

冬青油、二氫茉莉酸酯貯備液用水稀釋至0.1%(V/V)。迷迭香、紫蘇、貓薄荷粗提液用水稀釋100倍(V/V)，于12月初選擇晴天均勻噴灑于茶樹(shù)上，每種物質(zhì)處理重復(fù)3次，每個(gè)處理茶行之間間隔2行，試驗(yàn)區(qū)茶行長(zhǎng)度10 m，噴液量1 L，對(duì)照用液為將75%工業(yè)乙醇用水稀釋1000倍(V/V)所得。噴液24 h后采集1芽2～3葉或同等嫩度對(duì)夾葉，立即投入液氮，然后-80℃保存，供測(cè)試用。

1.5 茶樹(shù)葉片酶活性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[12-13]方法，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)加以調(diào)整。

1.5.1 酶提取 取約1.0 g樣品放入研缽，加1 g交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，少量石英砂，加預(yù)冷的磷酸緩沖液(PBS)3～5 mL，多酚氧化酶(PPO)提取時(shí)用pH 6.5的PBS，苯丙氨酸解氨酶(PAL)、脂氧合酶(LOX)和超氧化物歧化酶(CAT)提取時(shí)用pH 8.0的PBS研磨，然后4℃，6000 g離心15 min，上清液以水定容至25 mL作為酶儲(chǔ)備液。

1.5.2 多酚氧化酶活性測(cè)定 用鄰苯二酚比色法，定義每克樣品吸光度每分鐘變化0.1為1個(gè)酶活力單位。底物：pH 6.5的PBS與0.1%脯氨酸及1%鄰苯二酚按10:2:3的體積比均勻混合。酶活性計(jì)算見(jiàn)式(1)。

式中：AX-酶反應(yīng)液吸光度，A0-空白吸光度，V1-測(cè)定酶活時(shí)取用酶液體積，V2-酶提取液總體積，t-酶反應(yīng)時(shí)間(min)，W-酶提取所用鮮葉樣品質(zhì)量(g)。

1.5.3 苯丙氨酸解氨酶活性測(cè)定 用290 nm紫外法，每克樣品每分鐘吸光度變化0.01為1個(gè)酶活力單位。底物：20 mmol/L苯丙氨酸溶液。

酶活性計(jì)算同1.5.2。

1.5.4 脂氧合酶(LOX)活性測(cè)定 每克樣品每分鐘吸光度變化0.01為1個(gè)酶活單位。

底物：亞油酸鈉與Tween20按1:1.1(M/M)比例均勻混合，再用pH 8.7硼酸緩沖液溶解，以0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)至pH 6.5，使溶液澄清，亞油酸鈉濃度10 mmol/L。

酶活性計(jì)算同1.5.2公式(1)。

1.5.5 超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定 用NBT光還原法，以NBT光氧化抑制率50%為1個(gè)酶活單位。

底物：130 mmol/L甲硫氨酸，750 μmol/L氮藍(lán)四唑，20 μmol/L核黃素等體積混合。SOD酶活性計(jì)算見(jiàn)式(2)。

式中：AX-酶反應(yīng)液吸光度，A0-空白吸光度，V1-測(cè)定酶活時(shí)取用酶液體積(mL)，V2-酶提取液總體積(mL)，W-酶提取所用鮮葉樣品質(zhì)量(g)。

1.5.6 葉片基本代謝成分分析 多酚總量用Folin-Ciocalteu’s法(GB/T8313—2018)，黃酮總量用三氯化鋁比色法[12]，可溶糖測(cè)定用蒽酮比色法[12]，氨基酸總量用茚三酮比色法(GB/T8313—2013)。丙二醛測(cè)定用硫代巴比妥(TBA)法[13]，木質(zhì)素測(cè)定用尿素-氫氧化鈉法[14]。

1.5.7 自由基清除試驗(yàn) 1 g新鮮葉片，用75%乙醇按1:10(M/V)物料比提取24 h,5000 g離心，取上清液，用水定容至50 mL,再稀釋10倍，用于測(cè)試試驗(yàn)處理茶樹(shù)的葉片提取物對(duì)活性氧的清除能力。超氧自由基(O2·)由水楊酸反應(yīng)體系產(chǎn)生，羥自由基(OH·)由Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生[15]。

1.5.8 CsOPB3基因表達(dá)測(cè)試[16]參考文獻(xiàn)[16]的方法?？俁NA提取用RNA分離試劑盒(Invitrogen,CA,USA)按使用說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行，定量PCR分析在96孔板中進(jìn)行，反應(yīng)程序：起始95℃2 min，95℃變性10 s，退火與擴(kuò)增58℃30 s。

2 結(jié)果與分析

表1數(shù)據(jù)顯示，植物提取物和仿生合成香精油處理茶樹(shù)葉片多酚含量相對(duì)提高3.93%～24.2%，木質(zhì)素含量相對(duì)提高5.8%～16.53%，氨基酸含量相對(duì)提高27.8%～55.6%。除薄荷提取物處理外，其他處理葉片丙二醛含量降低9.2%～32.8%。

表1 葉片中代謝物含量

酶活性分析結(jié)果（表2），各試驗(yàn)處理多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、脂氧合酶(LOX)活性都有明顯升高，多酚氧化酶活性升高幅度1.89～4.35倍，超氧化物歧化酶活性升高1.98～10.4倍，脂氧合酶(LOX)活性升高1.41～2.58倍，紫蘇、迷迭香提取物處理可使苯丙解氨酶(PAL)活性明顯提高，其余處理PAL呈下降趨勢(shì)。

表2 茶樹(shù)葉片酶活性(U）

植物精油或香草提取物處理后的茶樹(shù)鮮葉（表3），其乙醇提取物對(duì)超氧自由基的清除能力提高1.3～2.9倍。對(duì)羥自由基的清除效率除薄荷處理外都稍有提高，冬清油處理比對(duì)照略低，但差異不顯著。

表3 茶樹(shù)葉片提取物活性氧清除效率 %

二氫茉莉酸酯、迷迭香、紫蘇提取物處理后茉莉酸信號(hào)途徑關(guān)鍵基因(CsOPB3)表達(dá)上調(diào)明顯，薄荷處理變化不明顯，冬青油處理略有下降（見(jiàn)圖1）。

圖1 CsOPB3基因表達(dá)分析

3 討論與結(jié)論

逆境(stress)是指對(duì)植物生存或生長(zhǎng)不利的環(huán)境因子，也稱脅迫。環(huán)境脅迫可分為生物脅迫(bioticstress)（如病害、蟲(chóng)害、雜草等）和非生物脅迫(abioticstress)（如輻射、高溫、低溫、干旱、鹽害、大氣污染等）[1]，提高作物對(duì)逆境的防御或適應(yīng)能力是作物栽培管理的重要環(huán)節(jié)。

筆者在前期工作中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些生物刺激素能夠很好地調(diào)動(dòng)茶樹(shù)對(duì)逆境的生理響應(yīng)[17]，本研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)芳香植物提取物和仿生生物活性物質(zhì)同樣具有提升植物抗逆境能力的潛在效能。

氨基酸是植物體內(nèi)重要的基礎(chǔ)生化成分，在植物生長(zhǎng)生理活動(dòng)中直接發(fā)揮關(guān)鍵性作用，因而是反應(yīng)植物抗逆能力的重要指標(biāo)，氨基酸含量升高對(duì)增強(qiáng)植物的抗逆境能力有利，相反丙二醛是脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，在逆境條件下，植物體內(nèi)丙二醛含量通常會(huì)顯著增加[1]。本試驗(yàn)中，各處理都可誘導(dǎo)氨基酸的升高，因而具有提升茶樹(shù)抗逆能力的潛能。而除薄荷處理外，其余各組丙二醛含量都發(fā)生下降，提示茶樹(shù)細(xì)胞所受脅迫有所減輕。

次生代謝物質(zhì)如酚類、黃酮類、萜類、生物堿合成主要通過(guò)苯丙烷類代謝途徑進(jìn)行，苯丙氨酸解氨酶(PAL)是這一途徑的關(guān)鍵酶之一。一些文獻(xiàn)認(rèn)為PAL活性可以作衡量植物抗逆性強(qiáng)弱的指標(biāo)之一[20-21]，但在本試驗(yàn)中，PAL活性的變化趨勢(shì)與多酚類含量的變化趨勢(shì)并不一致，這一現(xiàn)象在以前的試驗(yàn)中也有發(fā)現(xiàn)[17]。這是因?yàn)榉宇愇镔|(zhì)生物合成在PAL催化反應(yīng)之后還有很多的分支途徑，PAL可能是影響多酚積累的重要因素，但后續(xù)過(guò)程也會(huì)發(fā)生重要影響。另外，雖然PAL活性升高有利于酚的累積，但酚類含量升高也可能對(duì)PAL產(chǎn)生反饋抑制，這個(gè)過(guò)程也涉及到眾多的調(diào)控因子。筆者嘗試分析PAL與黃酮之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，PAL活性處于第2位，第3位的處理對(duì)應(yīng)黃酮含量在第1和第2位，但PAL活性最高的紫蘇處理組，黃酮含量處于第4位，相關(guān)性也沒(méi)有很明顯。PAL家族有眾多的同工酶，有可能總的酶活性不能全面反映酚類的次級(jí)代謝狀態(tài)，這問(wèn)題需要進(jìn)一步研究[22]。

多酚能夠吸收逆境反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生的自由基，能夠防止UV輻射和自由基引起的損傷，中止自由基引發(fā)的鏈鎖反應(yīng)，從而阻止氧化的繼續(xù)進(jìn)行，這在許多植物上都已得到證明[18,23]，植物體內(nèi)多酚含量適度提高對(duì)緩解氧化脅迫有利，本試驗(yàn)各處理均能使葉片多酚含量適當(dāng)提高，這是有益的。木質(zhì)素是與多酚關(guān)系密切的高聚物。木質(zhì)素可與纖維素、蛋白等結(jié)合成復(fù)雜的不溶性聚合物，形成物理屏障阻隔病原菌侵染和擴(kuò)散，或阻礙害蟲(chóng)取食[18-19]。本試驗(yàn)顯示3種香草提取物冬季處理茶樹(shù)木質(zhì)素含量提高了5.8%～16.53%，不過(guò)冬青油（水楊酸酯）和二氫茉莉酸酯處理下木質(zhì)素卻呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，如果是在春季，冬青油和二氫茉莉酸酯處理也能引起木質(zhì)素下調(diào)，則對(duì)保持茶樹(shù)新梢持嫩性有利[24]。

多酚氧化酶(PPO)是多酚轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，在植物防御逆境脅迫中與多酚協(xié)同發(fā)揮重要作用，多酚氧化酶活性升高，催化較多的酚類物質(zhì)氧化生成醌類，并進(jìn)一步生成黑色素，可防止病原菌擴(kuò)散或阻止草食動(dòng)物取食[25-26]。茉莉酸信號(hào)可能參與PPO活性的調(diào)節(jié)[26-27]。

脂氧合酶(LOX)在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫應(yīng)答等諸多過(guò)程中都具有廣泛的作用，植物在生長(zhǎng)過(guò)程中遭遇機(jī)械傷害、干旱、病原菌侵染、紫外線輻射等逆境壓力時(shí)，都能誘導(dǎo)LOX基因的表達(dá)[28]。LOX還能促進(jìn)香氣物質(zhì)醛和醇的合成與釋放，LOX參與的茉莉酸合成的丙二烯氧化合酶(AOS)途徑是脂肪酸代謝的主要分支路徑之一，并可能與萜類的形成有關(guān)。這些揮發(fā)物質(zhì)不僅是茶葉品質(zhì)形成的關(guān)鍵，也是重要的生態(tài)調(diào)節(jié)因子，鄰近植株通過(guò)感受到近鄰茶樹(shù)因遭受環(huán)境脅迫而釋放的揮發(fā)物，可及時(shí)產(chǎn)生相應(yīng)的預(yù)警反應(yīng)，提高對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)能力。因此提高LOX活性是增強(qiáng)植物抗逆能力的重要途徑[29]。本試驗(yàn)中除冬青油處理下脂氧合酶(LOX)活性微有下降，其余各組脂氧合酶(LOX)活性升高了1.41～2.58倍，因此可以認(rèn)為用香草植物提取物處理茶樹(shù)對(duì)于提高茶樹(shù)的綜合抗逆能力是有益的。

本研究所用的6種不同供試物質(zhì)在處理茶樹(shù)后，SOD酶活性均有顯著提高。SOD在活性氧清除反應(yīng)中有重要意義[30]，從超氧自由基和羥自由基的清除效率看，香草植物處理確實(shí)能發(fā)揮一定作用。

茉莉酸(JA,MJA)或水楊酸(SA,MSA)不僅是植物綠葉揮發(fā)物的重要組分，還是重要的信號(hào)物質(zhì)。外源MJA可減輕干旱脅迫下的生理傷害，促進(jìn)β蘿卜素的積累，保護(hù)其他質(zhì)體色素免受氧化降解，增強(qiáng)植物的免疫能力[31]。外源MSA或MJA處理茶樹(shù)可提高茶樹(shù)抗蟲(chóng)能力，耐鹽能力和抗低溫能力[32-33]。本試驗(yàn)條件下二氫茉莉酸酯也可以產(chǎn)生很好的生理調(diào)節(jié)效應(yīng)，工業(yè)上二氫茉莉酸酯比茉莉酸酯廉價(jià)易得，更有利于在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用。內(nèi)源茉莉酸(JA)或茉莉酸酯(MJA)是植物響應(yīng)機(jī)械傷害、病蟲(chóng)害、低溫以及鹽脅迫等逆境的重要信號(hào)物質(zhì)，損傷通過(guò)機(jī)械刺激產(chǎn)生特定信號(hào)，并經(jīng)茉莉酸途徑進(jìn)行傳導(dǎo)激活相應(yīng)的反應(yīng)。外源茉莉酸或水楊酸對(duì)植物發(fā)揮作用一般要通過(guò)內(nèi)源茉莉酸信號(hào)的調(diào)節(jié)來(lái)完成，茉莉酸信號(hào)途徑關(guān)鍵基因(CsOPB3)對(duì)內(nèi)源茉莉酸合成有直接影響[34-35]，二氫茉莉酸酯、迷迭香、紫蘇提取物處理后表達(dá)上調(diào)明顯，這可能有利于JA或MJA的積累，并產(chǎn)生更多的生理效應(yīng)，冬青油處理下CsOPB3表達(dá)略有下降，這可能是因?yàn)镾A與JA在植物體內(nèi)存在拮抗效應(yīng)[36]。

消除植物體內(nèi)過(guò)剩的活性氧，降低膜脂質(zhì)過(guò)氧化水平是減輕環(huán)境脅迫對(duì)植物傷害的重要途徑。有研究認(rèn)為2，4-表油菜素內(nèi)酯、外源MJA等可以通過(guò)消除活性氧解除高溫或低溫脅迫下水稻的應(yīng)急狀態(tài)[35,37]。本試驗(yàn)指出植物精油或香草提取物處理后的茶樹(shù)鮮葉，其水提取物對(duì)超氧自由基的清除能力提高1.3～2.9倍，但對(duì)羥自由基的清除效應(yīng)的提高不明顯，如欲經(jīng)此途徑進(jìn)一步提高茶樹(shù)的抗逆能力，仍需對(duì)所用提取物的使用濃度、使用方法做廣泛探討，并擴(kuò)大篩選范圍。

芳香植物間作改善生態(tài)循環(huán)的功能在茶園以及其他作物系統(tǒng)中都已得到證明[11,38]，芳香植物提取物直接用于作物病蟲(chóng)害的防治也已廣泛研究[39-40]，芳香植物提取物還可以改善植物的代謝，尤其是刺激植物釋放更多的揮發(fā)物，植物通過(guò)揮發(fā)性物質(zhì)直接防御食葉動(dòng)物和病原菌的侵害，還可以作為信號(hào)物質(zhì)通過(guò)植物激素信號(hào)途徑在同株未受損組織器官或鄰近植物中引發(fā)防御反應(yīng)，這種逆境響應(yīng)的利用對(duì)環(huán)境更加安全、短時(shí)有效[38,40]。

綜合代謝物分析、酶活性分析和活性氧清除能力等幾方面的結(jié)果，本試驗(yàn)中每一種處理下均有2～3個(gè)以上與提高茶樹(shù)抗逆能力有正相關(guān)性的指標(biāo)有顯著上升趨勢(shì)，因此可以認(rèn)為這些物質(zhì)尤其是香草植物的提取物有可能被用來(lái)緩解茶樹(shù)所受的環(huán)境脅迫。