梅 璐, 陳 新, 周 悅, 孫漢巨, 徐尚英, 楊 柳

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601; 2.安徽海神黃酒集團(tuán)有限公司,安徽 合肥 231500)

以黃酒為主體釀造的料酒具有營養(yǎng)豐富、增香提味的優(yōu)點,市場需求量逐年增加。釀造料酒一般通過添加焦糖色素調(diào)節(jié)產(chǎn)品色澤,而以黑米為原料釀造的酒液顏色較深,降低了焦糖色素的使用量,且黑米料酒中含有多種活性物質(zhì),因此深受消費者歡迎[1]。

黑米是黑稻脫去谷殼的糙米,不僅富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)、維生素和膳食纖維等,還含有大量的花青素、類黃酮、維生素E、胡蘿卜素、強心甙、植酸、多酚和γ-谷維素等多種活性物質(zhì)[2]。料酒釀造過程包括浸米、蒸煮、發(fā)酵、壓榨、煎酒、貯存等。浸米是釀造的第1步,浸泡過程中大米吸收水分,使淀粉在蒸煮過程中易被糊化,且有利于產(chǎn)酸細(xì)菌生長,增加米漿水的酸度。酸化的大米能保證發(fā)酵初期不易被雜菌污染,提高原料出酒率和產(chǎn)品品質(zhì)[3]。在料酒釀造過程中,每噸大米產(chǎn)生約1 m3的米漿水,產(chǎn)量巨大。米漿水中淀粉、有機酸、可溶性蛋白等物質(zhì)含量高[4],理論上可被用于料酒發(fā)酵,但在實際生產(chǎn)應(yīng)用中,發(fā)現(xiàn)將米漿水添加到發(fā)酵過程可能會降低料酒過濾速率以及改變產(chǎn)品風(fēng)味等。米漿水的資源化利用已有一些研究,文獻(xiàn)[5]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過酸性蛋白酶處理的米漿水上清液回用至發(fā)酵過程,酒液過濾速率增加43.48%,并且不會影響黃酒的發(fā)酵及黃酒風(fēng)味;文獻(xiàn)[6]發(fā)現(xiàn)將生物酸化浸米的米漿水添加20%代替自來水發(fā)酵,與自然浸泡發(fā)酵的黃酒無明顯差別。但上述研究過程中仍存在著大量米漿水被作為廢水處理。米漿水具有較高的生化需氧量(biological oxygen demand,BOD)和化學(xué)需氧量(chemical oxygen demand,COD),直接排放會污染環(huán)境[7]。一般工廠多采用酸化、UASB厭氧、SBR好氧等工藝對米漿水進(jìn)行治理。

黑米堅硬的外殼包裹著糊粉層,花青素、類黃酮等活性物質(zhì)存在于糊粉層中,浸泡時物質(zhì)溶出量較少,不利于米漿水的酸化[8],從而導(dǎo)致發(fā)酵效率降低;蒸煮過程中黑米不易被蒸汽穿透而導(dǎo)致蒸汽量消耗量大。

在前期研究中,課題組從料酒發(fā)酵醪中篩選得到一株產(chǎn)酸快、不產(chǎn)生物胺且能在米漿水中快速生長的植物乳桿菌F25-4,將其擴大培養(yǎng)后在浸米過程中添加,發(fā)現(xiàn)能夠減少黑米蒸煮時的蒸汽用量;將其米漿水添加至發(fā)酵醪中,對料酒發(fā)酵產(chǎn)生有益效果。本文將接菌浸泡的米漿水代替普通釀造用水添加至初始發(fā)酵的米醪中,對料酒發(fā)酵的影響進(jìn)行研究,研究結(jié)果為米漿水的資源化利用提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)F25-4從安徽海神黃酒集團(tuán)有限公司的發(fā)酵醪中篩選得到,在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC No.M 20211574。

1.2 材料

黑米由安徽海神黃酒集團(tuán)有限公司提供;ABTS(分析純)購于上海源葉生物科技有限公司;濃硫酸、蒽酮、鹽酸、茚三酮、香草醛、無水乙醇、酪氨酸(均為分析純)均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;水合茚三酮(99.9%)購于美國Sigma-Aldrich公司;釀酒曲(紹酒風(fēng)味T3)、安琪釀酒高活性干酵母(黃酒專用)均購于安琪酵母股份有限公司。

1.3 儀器

7890B氣相色譜儀(安捷倫科技有限公司);SP-752紫外可見光分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司);S-4330D氨基酸分析儀(德國SYKAM公司);SCION-456四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(德國布魯克分析儀器公司);WSF分光測色儀(上海一電公司);pHS-3C pH計(雷磁儀器公司);TA-XTPLUS物性測試儀(英國STABLE公司);SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵(河南省予華儀器有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 黑米料酒發(fā)酵

稱取5 kg黑米,加入1.5倍質(zhì)量的自來水(符合生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)GB 5749—2006),加入植物乳桿菌F25-4的培養(yǎng)物使菌體菌落濃度為105CFU/mL,37 ℃浸泡48 h,瀝去水,黑米置于蒸籠中,通入蒸汽,控制溫度為110 ℃,蒸煮15 min。加入7.5 L煮沸并冷卻至室溫的自來水,待物料冷卻至35 ℃左右時轉(zhuǎn)入25 L發(fā)酵罐中,加入5 L補料水、活化后的釀酒曲和活性干酵母,攪拌均勻。28～32 ℃發(fā)酵5 d并不時攪拌,15 ℃繼續(xù)發(fā)酵15 d。發(fā)酵結(jié)束后,對發(fā)酵醪液進(jìn)行抽濾,濾液即為原酒液。按加入補料水的不同,實驗分2組:對照組為經(jīng)煮沸的自來水;實驗組為經(jīng)煮沸的米漿水(產(chǎn)生的米漿水共約4.5 L,不足5 L部分用經(jīng)煮沸的自來水補足)。

1.4.2 測定方法

pH值采用pH計法;氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度的測定參照GB/T 5009.235—2016;花青素質(zhì)量濃度測定采用鹽酸香草醛法[9];總糖質(zhì)量濃度采用蒽酮硫酸法[10],以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品測標(biāo)準(zhǔn)曲線,具體公式如下：

y=1.618x-0.047 2,R2=0.999。

米漿水中菌落數(shù)量的測定。各取1 mL自然浸泡與植物乳桿菌F25-4浸泡48 h的米漿水梯度稀釋至106、107,分別涂布于營養(yǎng)瓊脂平板和MRS瓊脂平板,30 ℃培養(yǎng)48 h,進(jìn)行計數(shù)。

黑米蒸煮特性測定。將浸泡后黑米分別于121、110、105、100 ℃蒸煮15 min,利用TA-XTPLUS物性測試儀對各樣品進(jìn)行物性分析。物性測試程序如下：探頭為P36 R、壓縮比為90%、速度為0.5 mm/s。

過濾速率的測定。將布氏漏斗與真空泵相連,漏斗中放入中速濾紙,提前打開真空泵,倒入發(fā)酵醪的同時進(jìn)行計時,至抽濾完畢測量濾液體積,計算出每分鐘過濾體積，即為過濾速率。

酒精度的測量采用氣相色譜法[11];色度采用測色儀對酒液進(jìn)行測定。

1.4.3 清除率的測定

DPPH自由基清除率方法參考文獻(xiàn)[12],并略有修改。取4 mL酒液加入1 mL 1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液,混勻,置于黑暗處反應(yīng)30 min,于517 nm處測定吸光度值,Vc為陽性對照。DPPH自由基清除率的計算公式如下:

(1)

其中:A0為DPPH和水的吸光度;A1為樣品溶液的吸光度;A2為樣品溶液加入 DPPH自由基反應(yīng)后的吸光度。

ABTS自由基清除率參考文獻(xiàn)[13]方法測定,按ABTS試劑盒方法檢測。

·OH清除率測定參考文獻(xiàn)[14]方法,略有修改。取2 mL黑米料酒于試管中,加入2 mL的9 mmol/L的FeSO4溶液和2 mL的9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液,充分混勻后,加入2 mL 8.8 mmol/L的H2O2溶液混勻,37 ℃下反應(yīng) 30 min,510 nm下測定吸光度值。計算黑米料酒對·OH的清除率,具體公式如下:

(2)

其中:A0′為空白對照的吸光度;A1′為樣品溶液的吸光度;A2′為樣品溶液加入H2O2溶液反應(yīng)后的吸光度。

1.4.4 風(fēng)味及感官評價

游離氨基酸采用氨基酸分析儀,參考文獻(xiàn)[15]方法測定。氨基酸風(fēng)味比值為鮮味氨基酸和甜味氨基酸質(zhì)量濃度之和與苦味氨基酸和澀味氨基酸質(zhì)量濃度之和的比值。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)采用頂空固相微萃取(head space solid-phase microextraction,HS-SPME)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)，測定發(fā)酵樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的質(zhì)量濃度,測定方法參考文獻(xiàn)[15]。

1.4.5 感官評價

由經(jīng)驗豐富的10人組成一個評定小組(5女5男),根據(jù)GB/T 13662—2018從外觀(紅度、濁度)、香氣(酒香、果香、花香、谷香)、口感(甜、酸、辣、黏、苦)、口感(澀味、持久性、飽和感)等對樣品進(jìn)行感官特征評價。強度等級為0～5(0無，1代表很弱，2代表普通，3代表溫和,4代表強烈,5代表最強烈)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Microsoft Office Excel 2016、SPSS statistics 22.0、Origin 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。所有實驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 米漿水的理化性質(zhì)

將植物乳桿菌F25-4培養(yǎng)物添加至浸米罐中,對照組為未人工接種的自然浸泡,37 ℃下浸米48 h。2組米漿水的理化性質(zhì)見表1所列。

從表1可以看出，接菌組米漿水中的氨基酸態(tài)氮為1.690 mg/mL,較對照組增加60.80%;花青素和總糖的質(zhì)量濃度比對照組分別降低了12.14%和26.54%;接菌組米漿水的pH值為4.36,顯著低于對照組。實驗結(jié)果表明,菌株F25-4能利用水漿水中營養(yǎng)成分迅速生長,并產(chǎn)生有機酸,降低了體系pH值。接菌組米漿水中,不僅有接入的菌株F25-4細(xì)胞,還含有環(huán)境中微生物,接菌組的微生物細(xì)胞數(shù)量高于對照組,隨著酸度增大,不耐酸的微生物會自溶死亡,釋放出菌體的氨基氮,導(dǎo)致實驗組氨基酸態(tài)氮增加[16]。接菌組米漿水中總糖、花青素質(zhì)量濃度降低,可能是由于在酸性環(huán)境下,黑米溶出物減少。

表1 米漿水的理化性質(zhì)

2.2 蒸煮特性比較

將浸泡后黑米分別在不同溫度下蒸煮15 min,利用物性儀測定各樣品的硬度、黏度和口感均衡性,對照組為自然浸泡黑米在121 ℃蒸煮15 min,結(jié)果如圖1所示。圖1中,對照組為浸泡黑米121 ℃蒸煮15 min;F121、F110、F105、F100組為加菌浸泡黑米于121、110、105、100 ℃蒸煮15 min 。

由圖1可知,接菌浸泡后黑米在110 ℃蒸煮時,米的硬度、黏度以及口感均衡性與對照組沒有顯著差異。蒸煮溫度若過高則米飯呈糊狀,若過低則淀粉不能完全糊化,不利于淀粉的糖化。文獻(xiàn)[17]發(fā)現(xiàn)黑米外皮層影響米粒淀粉的膨脹溶出,蒸煮時間隨著碾減率的增加而減小。接菌浸泡后,黑米酸度增加,可能軟化或部分分解纖維素、細(xì)胞壁組織,有利于淀粉粒的膨脹和溶出,改善米粒的黏彈性,降低黑米的蒸煮溫度,減少蒸汽用量。

組別圖1 蒸煮溫度對黑米物性的影響

2.3 米漿水對料酒過濾速率的影響

米漿水中含有淀粉顆粒、蛋白質(zhì)、脂肪及灰分等,其作為投料水進(jìn)行發(fā)酵會降低料酒的壓榨速率[18]。植物乳桿菌浸泡的米漿水中含有大量乳酸,其米漿水中總酸質(zhì)量濃度高于自然浸泡的米漿水。添加不同米漿水對料酒抽濾速率的影響見表2所列。 表2中,對照組為自然浸泡添加自來水發(fā)酵;對照補料組為自然浸泡添加米漿水發(fā)酵;F組為接菌浸泡添加自來水發(fā)酵;F補料組為接菌浸泡添加米漿水浸泡。

由表2可知,添加米漿水后,對照補料組過濾速率與對照組相比略有降低,可能是米漿水中的蛋白質(zhì)和淀粉具有很強的吸水性和保水性,這使得抽濾過程中抽濾速率減慢,降低了出酒率[5]。接菌浸泡的米漿水能提高酒醪的過濾速率。前期的米漿水凍干物聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗(數(shù)據(jù)未顯示)發(fā)現(xiàn)接菌浸泡的米漿水中的蛋白質(zhì)含量增加,但相對分子量降低,淀粉含量減少,從而降低了蛋白質(zhì)與淀粉的吸水率,提高了酒醪的過濾速率。

表2 米漿水對黑米料酒過濾速率的影響 單位:mL/min

2.4 米漿水對黑米料酒發(fā)酵的影響

米漿水中含有一定量的營養(yǎng)物質(zhì),其作為投料水進(jìn)入發(fā)酵對料酒的酒精度、花青素、氨基酸態(tài)氮以及總糖質(zhì)量濃度的影響見表3所列。

從表3可以看出,米漿水的添加對酒精度、花青素以及總糖質(zhì)量濃度影響不顯著,但氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度顯著增加,酒液色澤變化明顯。添加米漿水的料酒酒液氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度為191.535 mg/L,較對照組提高 14.46%。料酒中氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度適當(dāng)提高有利于酒的醇厚性。加入米漿水發(fā)酵的料酒的亮度、紅色、藍(lán)色色澤都高于對照組,即黑米酒的亮度、紅色和黃色色澤都增加,但紅色色澤顯著增加(P<0.05),紅色主要來源于花青素[19]。說明米漿水的添加可改善黑米料酒的部分顏色指標(biāo),提高酒中花青素的質(zhì)量濃度。

表3 米漿水對黑米料酒理化性質(zhì)的影響

2.5 黑米料酒抗氧化活性的變化

黑米米漿水含有大量花青素,花青素屬于黃酮類物質(zhì),具有自由基清除能力和抗氧化能力。通過DPPH、ABTS和·OH自由基清除率來測定米漿水對料酒抗氧化活性的影響，結(jié)果如圖2所示。

組別圖2 米漿水對黑米料酒抗氧化活性的影響

由圖2可知,米漿水的添加能顯著提高酒液的抗氧化活性，其中米漿水組中DPPH、ABTS、·OH自由基清除率分別為64.96%、40.23%、37.11%,較對照組分別增加39.11%、20.80%、19.40%?？寡趸钚耘c花青素、總酚、總黃酮等有關(guān),文獻(xiàn)[20]報道自由基清除活性與花青素含量成正比。黑米浸泡過程中,花青素溶出進(jìn)入米漿水中,抗氧化活性隨著米漿水添加而升高。

2.6 黑米料酒氨基酸質(zhì)量濃度的變化

氨基酸是重要的呈味物質(zhì),料酒中氨基酸主要來自于原料中蛋白質(zhì)的分解及酵母、霉菌等微生物自溶,其含量、種類與料酒的質(zhì)量和風(fēng)味有密切關(guān)系[21]。向蒸煮后的米添加100%米漿水作為投料用水進(jìn)行發(fā)酵,利用氨基酸分析儀測定黑米料酒原酒液中游離氨基酸的種類和質(zhì)量濃度,并與未添加米漿水的料酒(對照組)比較,結(jié)果見表4所列。

表4 米漿水對黑米料酒游離氨基酸的影響

由表4可知,黑米料酒中共檢測到15種氨基酸,含有蘇氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸7種必需氨基酸。氨基酸不僅賦予了料酒豐富的營養(yǎng)價值,而且具有良好的呈味作用,例如絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸等呈甜味;組氨酸、精氨酸等呈苦味;酪氨酸呈澀味;天冬氨酸、谷氨酸呈鮮味[22]。與對照組相比,添加米漿水制備的料酒氨基酸質(zhì)量濃度顯著增加,其中甜味氨基酸增加10.26%,絲氨酸、蘇氨酸貢獻(xiàn)最多,并且氨基酸風(fēng)味比值較對照組增加10.74%,達(dá)到80.4%。料酒酒液總氨基酸質(zhì)量濃度較對照組增加10.26%。說明添加米漿水有利于料酒中氨基酸質(zhì)量濃度提升和料酒風(fēng)味改善。

2.7 黑米料酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

風(fēng)味物質(zhì)是料酒品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,而揮發(fā)性物質(zhì)是影響料酒風(fēng)味的關(guān)鍵因素。料酒中香氣成分主要來源于釀造原料、酒曲中微生物代謝物及陳釀過程中物質(zhì)的轉(zhuǎn)化, 同時料酒中不同物質(zhì)之間存在相互作用, 使得香氣成分的組成更加復(fù)雜[23]。米漿水添加對料酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和質(zhì)量濃度的影響見表5所列。

表5 米漿水對黑米料酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

由表5可知,米漿水組料酒中檢測到2種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)質(zhì)量濃度為92.543 mg/L,較對照組增加10.53%,其主要的風(fēng)味成分為醇類、酯類和酸類,質(zhì)量濃度分別為70.891、11.212、8.837 mg/L。醇類賦予黑米料酒特有的醇香、豐滿圓潤的口感[24],醇類中質(zhì)量濃度較高的為β-苯乙醇、十二醇、異戊醇,β-苯乙醇是料酒中重要的芳香化合物,賦予料酒柔和、優(yōu)雅的玫瑰香氣,提高β-苯乙醇質(zhì)量濃度有利于提升料酒風(fēng)味。米漿水添加對β-苯乙醇質(zhì)量濃度影響較大,隨米漿水增加而增加[25]。異戊醇具有蘋果白蘭地香氣和辛辣味,是酒中產(chǎn)生上頭感主要成分之一。酯類是酵母將有機酸與醇類通過酶的催化形成的[26],酯類中辛酸乙酯具有白蘭地氣味,由辛酸和乙醇反應(yīng)生成,乙酸苯乙酯具有濃烈的蜜樣花香以及水果香。酸類物質(zhì)中己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸呈不適氣味,棕櫚酸無味,除棕櫚酸外,米漿水添加引起料酒中酸類物質(zhì)質(zhì)量濃度略有降低。4-乙烯基苯酚具有甜香和香莢蘭豆萃取物的香氣,十一烯醛有強烈的玫瑰、柑橘型香氣,對酒體風(fēng)味產(chǎn)生較好效應(yīng)。

2.8 感官評價分析

料酒的風(fēng)味是許多組分相互作用、相互平衡的結(jié)果,添加米漿水對黑米料酒的感官品質(zhì)的影響如圖3所示。

圖3 米漿水對黑米料酒感官評價的影響

由圖3可知,添加米漿水發(fā)酵的產(chǎn)品在濃郁度、持久性、紅色度、酒香和果香等特性方面明顯高于對照組,但酸度、苦味以及辣味較低,這可能是由于料酒中甜味和鮮味氨基酸與風(fēng)味物質(zhì)共同作用的結(jié)果,較多的酸類和苦味氨基酸可能影響黑米料酒呈味品質(zhì)。添加米漿水制備的黑米料酒中持久性、酒香以及紅色度得分最高,這可能與黑米料酒中含有的風(fēng)味物質(zhì)種類以及高級醇質(zhì)量濃度有關(guān),色澤與花青素質(zhì)量濃度有關(guān)。

3 討 論

隨著釀造料酒產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展,生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的米漿水、酒糟及加工廢水等環(huán)境問題受到廣泛關(guān)注。米漿水是釀造料酒行業(yè)的主要副產(chǎn)物,含有大量有機物、多種微生物及其代謝物。在春、秋兩季浸米,米漿水常含有產(chǎn)生不良?xì)馕兜难挎邨U菌,常表現(xiàn)為“白花”和異嗅味[27]。這種米漿水直接用于發(fā)酵不僅給料酒帶來不良風(fēng)味,還會降低酒醪的過濾速率。在浸米過程中接種性能優(yōu)良的植物乳桿菌F25-4,該菌株在米漿水中能夠快速生長并產(chǎn)生乳酸,抑制雜菌生長,降低米漿水中的生物胺含量;米漿水酸度的增加導(dǎo)致黑米的蒸煮溫度降低,有利于生產(chǎn)企業(yè)的節(jié)能降耗。米漿水中的蛋白質(zhì)與淀粉影響酒液壓榨速率,接菌浸泡后的米漿水中淀粉質(zhì)量濃度與可溶蛋白平均分子量均明顯降低,更利于被微生物利用,提高黑米酒醪的過濾速率。此外,米漿水可以有效提高料酒中氨基酸態(tài)氮、花青素的質(zhì)量濃度,促進(jìn)料酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生,提高酒液的抗氧化活性以及色澤。但對料酒中的風(fēng)味物質(zhì)種類及其質(zhì)量濃度等影響還需進(jìn)一步探究。通過接種性能優(yōu)良的乳酸菌進(jìn)行浸米,將產(chǎn)生的米漿水用于料酒發(fā)酵,能解決米漿水的污染問題,是一種簡單易行的料酒綠色釀造技術(shù),具有廣闊的應(yīng)用前景。