蘇佳敏, 趙 虔, 陳元利

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

血管鈣化是由于鈣鹽在血管層的沉積引起的[1],根據(jù)發(fā)病原因的不同,可以將其分為中膜鈣化和內(nèi)膜鈣化。中膜鈣化主要由慢性腎病及糖尿病引起,同時(shí)隨著年齡的增加,患病的幾率也會(huì)增加,其主要的病理表現(xiàn)是血管僵直,順應(yīng)性降低,導(dǎo)致高血壓[2]。而內(nèi)膜鈣化更多的是由動(dòng)脈粥樣硬化引起的,其往往存在于晚期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處,斑塊處鈣化結(jié)節(jié)將進(jìn)一步增加斑塊破裂的可能性[3],斑塊的破裂會(huì)使斑塊中的內(nèi)溶物被釋放到血管中,導(dǎo)致血栓和中風(fēng),增加患者的發(fā)病率和死亡率[4]。

文獻(xiàn)[5]認(rèn)為鈣化是一個(gè)不可避免的、被動(dòng)的退化過(guò)程,近20年的研究表明血管鈣化是一個(gè)類似骨形成的主動(dòng)過(guò)程,參與骨形成的一些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子也在鈣化中發(fā)揮作用,如Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)、SRY-轉(zhuǎn)錄因子9 (SOX9)、Osterix (OSX)等[6]。參與血管鈣化的主要細(xì)胞類型為主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)[7],平滑肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)換被認(rèn)為是血管鈣化的起始階段,其分泌的堿性磷酸酶被裝載至胞外囊泡后促進(jìn)游離磷酸鹽的釋放為組織細(xì)胞礦化提供基礎(chǔ)[8]。隨著對(duì)血管鈣化的逐步研究,一些危險(xiǎn)因子也逐漸被發(fā)現(xiàn),包括高鈣-磷酸鹽產(chǎn)物、氧化壓力、骨形態(tài)發(fā)生蛋白及維生素D等,都可促進(jìn)VSMCs的成骨分化和血管鈣化[9]。

miRNA是一類長(zhǎng)度約22 bp的單鏈非編碼RNA,目前已鑒定出超2 500個(gè)成熟體miRNA[10],它們活躍于各個(gè)生命活動(dòng)過(guò)程,廣泛表達(dá)于各個(gè)組織,通過(guò)靶向目的基因3`UTR區(qū)域,從而降解mRNA或阻止其轉(zhuǎn)錄[11]。miRNA對(duì)生物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要,有研究表明當(dāng)在小鼠體內(nèi)敲除成熟miRNA的前體剪切酶Dicer[12]和Drosha[13]后,會(huì)引發(fā)胚胎致死性。

本課題組前期工作結(jié)果表明miRNA在血管鈣化中也發(fā)揮著一定的作用,miRNA-203b-3p通過(guò)靶向重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)抑制下游的SMAD信號(hào)通路和RUNX2的表達(dá),從而抑制鈣化[14];文獻(xiàn)[15]確定miRNA-126-3p在鈣化中的作用是通過(guò)DKK1/LRP6信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的;文獻(xiàn)[16]研究發(fā)現(xiàn)miRNA在鈣化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前,關(guān)于miRNA-130b-3p的報(bào)道主要集中于脂代謝和癌癥[17-19],對(duì)于miRNA-130b-3p在心血管疾病中的研究很少,本文主要研究miRNA-130b-3p在血管鈣化中發(fā)揮的作用。

1 實(shí)驗(yàn)方法及材料

1.1 試劑及材料

DMEM培養(yǎng)基(Corning Subsidiary,貨號(hào)27017008);DMEM/F12培養(yǎng)基(Biological Industries,貨號(hào)01-172-1ACS);5 nmol的micrON hsa-miR-130b-3p mimic(廣州銳博生物科技有限公司,貨號(hào)miR10000691-1-5);5 nmol的micrOFF hsa-miR-130b-3p antagomir,in vivo(廣州銳博生物科技有限公司,貨號(hào)miR30000691-4-5);Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,貨號(hào)1881536);茜素紅(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán),貨號(hào)20170209);細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(三箭生物,貨號(hào)A02001-09A-H);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京維諾贊生物科技有限公司,貨號(hào)R123-01);AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(諾唯贊,貨號(hào)Q111-02);人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(human aortic smooth muscle cells,HASMCs)購(gòu)于ACTT;野生型雄鼠購(gòu)于江蘇集萃藥康生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)SCXX(蘇)2019-0008。

1.2 小鼠模型

8周大野生型雄鼠被分為2組(n=6),實(shí)驗(yàn)組小鼠每天注射5.5×105IU/kg 維生素D3(VD3),對(duì)照組注射橄欖油,連續(xù)注射3 d,并于注射完成2周后,安樂(lè)處死小鼠,收集小鼠全主動(dòng)脈和腎臟,用于分析鈣化進(jìn)程。

主動(dòng)脈環(huán)的制備。安樂(lè)處死野生型雄鼠,取其全主動(dòng)脈,在顯微鏡下去除其他組織,使用顯微剪將主動(dòng)脈剪為5 mm大小片段,置于DMEM/F12培養(yǎng)基中穩(wěn)定過(guò)夜,隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)染及鈣化處理。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HASMCs培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(FBS)和1%雙抗(抗鏈霉素和青霉素)的DMEM/F12培養(yǎng)基中。鈣化培養(yǎng)基的配制是將Na2HPO4和NaH2PO4按照1∶1的比例溶于含有2% FBS、1% 雙抗的DMEM培養(yǎng)基中,最終PO43-的濃度為3.0 mmol/L,待孔板中細(xì)胞密度為80%時(shí)添加鈣化培養(yǎng)基,并且每2天更換1次新培養(yǎng)基。

1.4 茜素紅染色及銀染

取1.0 g茜素紅溶于100 mL PBS并調(diào)節(jié)pH值至4.0,細(xì)胞茜素紅染色前需先使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞,然后向培養(yǎng)皿中添加茜素紅染液30 min,抽走染液,使用酸性PBS清洗以洗去浮色,置于顯微鏡下拍照,拍照完成后,向孔中加入10%乙酸溶液,吸上清于405 nm處測(cè)吸光度值,用于相對(duì)定量分析鈣鹽沉積變化情況。

小鼠動(dòng)脈環(huán)的茜素紅染色。將動(dòng)脈環(huán)冰凍切片從-20 ℃冰箱中取出,室溫放置30 min,隨后浸泡于PBS 20 min,染色,顯微鏡下拍照。全主動(dòng)脈茜素紅染色需將0.003%的茜素紅溶于1%的KOH溶液制備染液,將全主動(dòng)脈置于染液中過(guò)夜,隨后使用2% KOH溶液沖洗2次,顯微鏡下拍照。

動(dòng)脈環(huán)和全主動(dòng)脈的銀染是將切片主動(dòng)脈浸泡于2%硝酸銀溶液,置于紫外光下45 min,ddH2O水洗5 min,5%硫代硫酸鈉溶液清洗2 min,顯微鏡下拍照。

1.5 免疫熒光

細(xì)胞爬片完成后,使用0.5% Triton X-100處理45 min破膜,2% BSA室溫封閉2 h,封閉完成后洗去BSA,使用對(duì)應(yīng)抗體4 ℃孕育過(guò)夜,次日吸走抗體并使用PBS清洗3次,每次10 min,然后使用1∶1 000配置的FITC或Rhodamine偶聯(lián)的熒光二抗,于室溫孵育1 h。使用PBS清洗3次,每次10 min,之后使用1% DAPI染核10 min,使用防熒光淬滅劑封片并避光風(fēng)干,待風(fēng)干之后使用熒光顯微鏡拍照分析。

1.6 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

主動(dòng)脈RNA的提取,向裝有主動(dòng)脈的試管中加入400 μL RNA總提取試劑,組織研磨機(jī)研磨5 min,加入80 μL三氯甲烷,12 000 r/min離心10 min,吸取上清液,加入等體積異丙醇于-30 ℃過(guò)夜沉降。

次日于12 000 r/min離心10 min,吸除液體,加入400 μL 75% 乙醇溶液洗滌,12 000 r/min離心10 min,吸除液體,再加入400 μL 95%乙醇溶液洗滌,12 000 r/min離心10 min,盡量將液體全部吸除,置于超凈臺(tái)風(fēng)干20 min,加入50 μL ddH2O,測(cè)濃度,取1 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,然后通過(guò)SYBR(熒光染料)檢測(cè)mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

SYBR在游離狀態(tài)下不散發(fā)熒光,但當(dāng)結(jié)合至DNA雙鏈溝中時(shí)可發(fā)出綠色熒光,通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度可確定mRNA表達(dá)量的變化。引物見(jiàn)表1所列。

表1 引物序列

1.7 Western Blot檢測(cè)

細(xì)胞處理完成后加入150 μL裂解液,反復(fù)吹打,移入1.5 mL EP管,置于冰上,每隔5 min振蕩,重復(fù)2次后,于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,吸取上清液,隨后通過(guò)BCA測(cè)蛋白濃度,定量檢測(cè)60 μg蛋白中目的蛋白的表達(dá),先于100 ℃熱變性5 min,隨后上樣,跑膠、轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶室溫封閉1 h,上一抗過(guò)夜孵育,PBS清洗3次,每次8 min,二抗室溫孵育1 h,PBS清洗3次,每次8 min,最后使用ECL顯色液在曝光機(jī)中曝光。

1.8 流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)(FACS)

六孔板細(xì)胞完成處理后,收集培養(yǎng)基和孔板中的細(xì)胞(使用不含EDTA的胰酶消化),隨后的染色操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,染色完成后,上機(jī)操作。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,所有數(shù)據(jù)均為(平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差)。流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)(fluorescence activated cell sorting,FACS)數(shù)據(jù)從CytExpret(Beckman Coulter, Inc. 版本 2.1.0.92)導(dǎo)出,GraphPad Prism軟件(版本7.0)用來(lái)進(jìn)行t分析,若P<0.05則認(rèn)為具有顯著性,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1。

2 結(jié)果與分析

2.1 中膜鈣化主動(dòng)脈miRNA-130b-3p的表達(dá)

本研究通過(guò)皮下注射VD3來(lái)造成小鼠急性中膜鈣化,結(jié)果如圖1所示,從圖1可以看出,茜素紅染色和銀染造模成功,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測(cè)miRNA-130b-3p的變化如圖2所示。

圖1 中膜鈣化小鼠主動(dòng)脈銀染和茜素紅染色

圖2 SOX9、RUNX2和miRNA-130b-3p的基因相對(duì)表達(dá)量

由圖2可知,與對(duì)照組相比,VD3組主動(dòng)脈中miRNA-130b-3p的表達(dá)顯著上升,而且成骨轉(zhuǎn)錄因子RUNX2和軟骨轉(zhuǎn)錄因子SOX9的表達(dá)也顯著上升。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,血管鈣化時(shí)miRNA-130b-3p的表達(dá)顯著上升,預(yù)示著其將參與血管鈣化進(jìn)程。

2.2 鈣化程度與miRNA-130b-3p表達(dá)的正相關(guān)性

為了進(jìn)一步探索miRNA-130b-3p在血管鈣化中發(fā)揮的作用,本研究通過(guò)體外培養(yǎng)HASMCs并通過(guò)高磷酸鹽來(lái)誘導(dǎo)鈣化,如圖3所示,高磷酸鹽能顯著誘導(dǎo)RUNX2的表達(dá)和鈣鹽沉積并能上調(diào)miRNA-130b-3p的表達(dá)。對(duì)HASMCs進(jìn)行不同鈣化時(shí)間的處理,如圖4所示。隨著鈣化時(shí)間的增加,鈣鹽沉積也增加,miRNA-130b-3p的表達(dá)也上升,通過(guò)對(duì)兩者進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),鈣鹽沉積與miRNA-130b-3p的表達(dá)呈正相關(guān),如圖5所示。

圖3 茜素紅染色、RUNX2表達(dá)及miRNA-130b-3p相對(duì)表達(dá)量

圖4 時(shí)間梯度誘導(dǎo)HASMCs鈣化情況

圖5 miRNA-130b-3p與鈣化相關(guān)性分析

2.3 miRNA-130b-3p對(duì)平滑肌鈣化的影響

HASMCs轉(zhuǎn)染mimic和antagomir后鈣化誘導(dǎo)miRNA-130b-3p的相對(duì)表達(dá)變化如圖6所示。圖6中:a代表不轉(zhuǎn)染、不鈣化;b代表不轉(zhuǎn)染、鈣化;c代表轉(zhuǎn)染mimic、不鈣化;d代表轉(zhuǎn)染mimic、鈣化;e代表轉(zhuǎn)染antagomir、不鈣化;f代表轉(zhuǎn)染antagomir、鈣化。下同。

圖6 HASMCs轉(zhuǎn)染mimic和antagomir后 miRNA-130b-3p的相對(duì)表達(dá)

從圖6可以看出,轉(zhuǎn)染mimic在鈣化時(shí)將進(jìn)一步提高miRNA-130b-3p的水平,而轉(zhuǎn)染antagomir則可以抑制miRNA-130b-3p的水平,為了確定這一上升和降低的miRNA是否會(huì)影響鈣化進(jìn)程,本文通過(guò)茜素紅染色分析轉(zhuǎn)染時(shí)HASMCs的對(duì)應(yīng)鈣化情況,如圖7所示。從圖7可以看出,茜素紅染色顯示轉(zhuǎn)染mimic將會(huì)增加鈣鹽沉積,而轉(zhuǎn)染antagomir則可減少鈣鹽沉積。也可通過(guò)體外培養(yǎng)主動(dòng)脈環(huán)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這一結(jié)論。

圖7 茜素紅染色和鈣鹽相對(duì)定量分析

體外培養(yǎng)動(dòng)脈環(huán),并轉(zhuǎn)染mimic和antagomir,結(jié)果與HASMCs實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,如圖8所示。由圖8可知,過(guò)表達(dá)miRNA-130b-3p將增加鈣化,而封閉miRNA-130b-3p則會(huì)減輕鈣化程度。

圖8 茜素紅染色及鈣化面積占比統(tǒng)計(jì)

2.4 RUNX2及凋亡對(duì)鈣化的影響

為了進(jìn)一步確定具體發(fā)揮作用的信號(hào)途徑,通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子RUNX2和關(guān)鍵蛋白BMP2的表達(dá)變化,如圖9所示。從圖9可以看出,在鈣化時(shí)過(guò)表達(dá)miRNA-130b-3p將促進(jìn)BMP2和RUNX2的表達(dá),相反地，封閉miRNA-130b-3p則抑制BMP2和RUNX2的表達(dá)。隨后,通過(guò)免疫熒光分析堿性磷酸酶(ALPL)和磷酸化SMAD1/5(pi-SMAD1/5)的表達(dá),如圖10所示。與WB中RUNX2和BMP2的表達(dá)變化一致,鈣化誘導(dǎo)時(shí)mimic將促進(jìn)ALPL和pi-SMAD1/5的表達(dá),而antagomir則具有相反的效果。這些結(jié)果說(shuō)明，miRNA-130b-3p通過(guò)BMP2信號(hào)途徑和RUNX2來(lái)影響HASMCs的鈣化進(jìn)程。

圖9 RUNX2和BMP2蛋白表達(dá)、轉(zhuǎn)染mimic和antagomir

圖10 ALPL和pi-SMAD1/5的表達(dá)及平均熒光強(qiáng)度

文獻(xiàn)[20]報(bào)道HASMCs的凋亡將影響鈣化,本文采用FACS檢測(cè)當(dāng)轉(zhuǎn)染miRNA-130b-3p并鈣化誘導(dǎo)時(shí)細(xì)胞凋亡狀況,結(jié)果如圖11所示。從圖11可以看出,當(dāng)轉(zhuǎn)染mimic并鈣化處理時(shí)會(huì)促進(jìn)HASMCs的凋亡,而轉(zhuǎn)染antagomir則會(huì)抑制HASMCs的凋亡,這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明,在鈣化誘導(dǎo)處理時(shí)miRNA-130b-3p可以改變細(xì)胞的凋亡,從而影響鈣化進(jìn)程。

圖11 FACS檢測(cè)HASMCs轉(zhuǎn)染并鈣化誘導(dǎo)后的凋亡及統(tǒng)計(jì)

3 結(jié) 論

據(jù)統(tǒng)計(jì)2019年全球死于心血管疾病的人數(shù)為1 860萬(wàn),占總死亡人數(shù)的32%(數(shù)據(jù)來(lái)源Global Burden of Disease),而鈣化作為主要的病理之一,在其中扮演著重要角色,近20年來(lái),關(guān)于血管鈣化的機(jī)制不斷被發(fā)掘,目前普遍接受的觀點(diǎn)是鈣化為一個(gè)主動(dòng)的、類似骨生成的生物過(guò)程,多種信號(hào)途徑參與其中。miRNA作為非編碼RNA也在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用,為了給臨床治療血管鈣化提供更多的靶點(diǎn),本研究主要探討關(guān)于miRNA-130b-3p在血管鈣化中的作用。

在由VD3誘導(dǎo)的中膜鈣化小鼠模型中,檢測(cè)到顯著上升的miRNA-130b-3p及關(guān)鍵成骨、軟骨分化轉(zhuǎn)錄因子RUNX2和SOX9,這表明miRNA-130b-3p參與血管鈣化。通過(guò)體外誘導(dǎo)HASMCs的鈣化確定了鈣鹽的沉積(即鈣化水平)與上升的miRNA-130b-3p顯著相關(guān)，通過(guò)轉(zhuǎn)染miRNA-130b-3p的模擬物和抑制劑,確定miRNA-130b-3p是作為鈣化的上游信號(hào)來(lái)影響下游的BMP2、RUNX2、si-SMAD1/5的表達(dá),進(jìn)而影響鈣化進(jìn)程,并分析在轉(zhuǎn)染和鈣化處理時(shí)細(xì)胞的凋亡情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),模擬物能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡,而抑制劑能夠抑制細(xì)胞凋亡。

雖然本研究未能確定miRNA-130b-3p的具體靶點(diǎn),但文獻(xiàn)[21]報(bào)道的miRNA-130b-3p靶向PTEN影響細(xì)胞凋亡;文獻(xiàn)[22]發(fā)現(xiàn)PTEN參與HASMCs的鈣化進(jìn)程,結(jié)合本文的研究結(jié)果,miRNA-130b-3p靶向PTEN影響HASMCs的凋亡來(lái)影響鈣化進(jìn)程,需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證其可能性。

綜上所述,本研究的結(jié)果表明miRNA-130b-3p在鈣化中發(fā)揮關(guān)鍵作用,這一結(jié)果有望為臨床治療血管鈣化提供新的靶點(diǎn)。