矯 巖，李 丹，劉文東，韓文超

(青島市市立醫(yī)院兒科，山東 青島 266000)

肺炎是全世界兒童死亡的第二大原因。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)提出出現(xiàn)臨床體征和癥狀(包括咳嗽、發(fā)燒、進食不良、發(fā)紺、呼嚕聲、鼻腔擴張、呼吸急促及下胸壁內(nèi)陷)合并放射學(xué)結(jié)果進行肺炎診斷[1]，但病例個體差異及檢測手段不同往往會影響肺炎的診斷，而且約9%肺炎兒童易出現(xiàn)復(fù)發(fā)。因此，及時發(fā)現(xiàn)并積極治療對提高患者生活質(zhì)量意義重大。靶向篩查及治療近年來應(yīng)用廣泛，微小RNA(microRNA，miRNA)是小非編碼單鏈RNA，約22～24個核苷酸組成，在基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，miRNA表達失調(diào)影響細胞活動和疾病進展[2]。Huang等[3]提出，在肺炎發(fā)病機制中存在miRNA表達失調(diào)。炎癥因子可激活疾病過程中炎癥反應(yīng)，一定程度反映肺炎嚴重程度及免疫反應(yīng)進程[4]，因此，本項目主要研究血清中miR-147a和miR-217表達變化與炎癥指標及肺功能指標的相關(guān)性，旨在尋找兒童肺炎無創(chuàng)性生物標志物，改善肺炎診斷及治療效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年1月至2021年12月于青島市市立醫(yī)院接受治療的100例肺炎患兒為研究對象(肺炎組)。納入標準：①本研究要求肺炎病原體為肺炎支原體，符合《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識(2015年版)》診斷標準；②無其他肺部相關(guān)炎癥疾病；③無哮喘、心肌相關(guān)炎癥等疾?。虎芪唇邮苓^其他衛(wèi)生單位治療及無自行用藥；⑤患者家屬溝通順暢，并簽署知情同意書。排除標準：①伴有其他呼吸道感染疾病；②存在免疫缺陷問題；③臨床資料不全。肺炎組年齡1～9歲，平均年齡(5.33±1.37)歲，男54例，女46例。并選取同一時期來院做健康體檢的41例兒童作為對照組，年齡1～10歲，平均年齡(6.21±1.29)歲，男21例，女20例。本研究經(jīng)我院倫理委員會審查通過。

1.2 研究方法

1.2.1靜脈血檢測

所有研究對象均抽取空腹靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心10 min后將血清取出置于-80℃保存待用。利用RNA提取試劑盒(Invitrogen，貨號為10296010)提取總RNA，再按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen，貨號為4368813)操作說明制備cDNA，以U6為內(nèi)參，RT-PCR分析miR-147a和miR-217相對表達水平，引物序列：miR-147a正向引物為ATTGGCAAGATGTTCCTTGC，反向引物為GTGTGTGGAAATGCTTCTGC；miR-217正向引物為GCCGTACTGCATCAGGAAC，反向引物為GCAGGGTCCGAGGTATTC；U6正向引物為TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC，反向引物為GTGCAGGGTCCGAGGT。通過2-△△Ct法進行相對表達水平的量化分析。

1.2.2肺功能檢測

采用COSMEDPFT4型肺功能儀檢測肺功能指標，主要包括呼氣流量(peak expiratory flow，PEF)，第一秒用力呼氣容積(force expiratory volume in the first second，F(xiàn)EV1)，用力肺活量(force vital capacity，F(xiàn)VC)及FEV1/FVC，25%、50%、75%肺活量的呼氣流速V25、V50、V75。

1.2.3炎癥因子檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清中白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-1β和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)含量，具體操作按照ELISA試劑盒要求進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清miR-147a和miR-217表達水平比較

肺炎組血清miR-147a、miR-217表達量均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為4.302、5.322，P<0.05)，見表1。

表1 兩組兒童血清miR-147a和miR-217表達水平比較

2.2 兩組兒童肺功能比較

肺炎組兒童PEF、FEV1、FEV1/FVC、V25、V50、V75水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為5.921、6.035、8.392、5.772、7.274、9.926，P<0.05)，見表2。

表2 兩組兒童肺功能比較

2.3 兩組兒童血清炎癥因子水平比較

肺炎組IL-6、IL-1β、TNF-α水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為28.372、9.372、11.285，P<0.05)，見表3。

表3 兩組兒童血清炎癥因子表達水平比較

2.4 肺炎組兒童血清miR-147a、miR-217表達水平與肺功能和炎癥因子相關(guān)性分析

miR-147a、miR-217與肺功能指標(PEF、FEV1、FEV1/FVC、V25、V50、V75)呈正相關(guān)(r值介于0.654～0.772之間，P<0.05)，與炎癥因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)呈負相關(guān)(r值介于-0.811～-0.784之間，P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

表4 肺炎組兒童血清miR-147a、miR-217表達水平與肺功能和炎癥因子相關(guān)性分析

3 討論

肺炎是急性下呼吸道感染最嚴重的表現(xiàn)之一，是5歲以下兒童死亡的主要原因[5]。當病原微生物侵入宿主時，可刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生炎癥因子，并在局部積聚，進而引起呼吸道感染，臨床表現(xiàn)為支氣管炎、肺炎等[6]。感染早期出現(xiàn)明顯發(fā)燒、咳嗽、有痰、呼吸困難等癥狀，同時身體釋放炎癥因子、有毒代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致細胞損傷，進一步引發(fā)免疫功能紊亂[7]。兒童免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未完善，因此肺炎感染血清中miRNA表達與肺功能及炎癥因子釋放的相關(guān)性尚不清楚，需要深入探討。

3.1 肺炎患兒miR-147a和miR-127表達下調(diào)

miRNA是由基因組非編碼區(qū)產(chǎn)生的內(nèi)源性單鏈小分子RNA，研究發(fā)現(xiàn)miRNA表達異常與多種疾病發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。Chu等[8]研究提出，對比肺炎和正常兒童外周血miRNA表達譜發(fā)現(xiàn)，存在26個顯著上調(diào)miRNAs和7個顯著下調(diào)miRNA。miRNA參與肺炎病理過程，并參與肺炎免疫應(yīng)答過程。Liu等[9]在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)小鼠肺炎的動物模型中發(fā)現(xiàn)，miR-147a表達顯著下調(diào)，并靶向作用于核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)激活蛋白，進而調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥和損傷，miR-147a表達下調(diào)與小鼠IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α升高有關(guān)。miR-147a低表達參與汞誘導(dǎo)的人系膜細胞增殖、纖維化和氧化應(yīng)激，促進糖尿病腎病惡性進展[10]。另外，諸多學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-147a在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)細胞增殖、遷移、侵襲中發(fā)揮抑制作用，過表達miR-147a可抑制NSCLC進展[11-12]。Chen等[13]提出miR-217可作為新的診斷肺炎的生物標志物，在LPS誘導(dǎo)小鼠重癥肺炎模型中，發(fā)現(xiàn)LPS處理可降低miR-127表達水平，過表達miR-127后可降低LPS誘導(dǎo)的細胞炎癥因子表達，并通過靶向抑制AKT和NF-KB信號通路，進一步減輕重癥肺炎。Xie等[14]報道m(xù)iR-127可能通過靶向作用于免疫球蛋白受體減輕肺部炎癥，此外在支氣管肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)miR-127表達下調(diào)，這種異常表達可作為疾病診斷的生物標志物[15]。綜上，本研究將miR-147a和miR-127作為肺炎新興生物標志物探討其與肺炎兒童肺功能和炎癥因子表達相關(guān)性，分析miR-147a和miR-127在兒童肺炎的臨床價值。

3.2 肺炎患兒miR-147a、miR-127表達與肺功能指標呈正相關(guān)，與炎癥因子水平呈負相關(guān)

本研究結(jié)果表明，肺炎組兒童血清中miR-147a和miR-127表達顯著低于對照組，相關(guān)性分析結(jié)果表明，miR-147a和miR-127與肺功能指標呈正相關(guān)，與細胞炎癥指標呈負相關(guān)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。上述結(jié)果提示miR-147a、miR-127與肺炎進展密切相關(guān)，可能一方面為miR-147a、miR-127與抗炎因子靶基因結(jié)合，另一方面肺炎進展誘導(dǎo)miR-147a和miR-127表達下調(diào)，進而促進釋放炎癥因子。Khadzhieva等[16]分析肺炎和肺功能之間的共享基因位點，經(jīng)基因富集分析發(fā)現(xiàn)，肺炎和肺功能基因集與炎癥相關(guān)特征基因之間存在顯著重疊。肺炎與細胞炎癥有關(guān)，TNF-α是單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生的一種主要細胞因子，是一種重要的炎癥介質(zhì)[17]。TNF-α通過誘導(dǎo)局部浸潤、中性粒細胞趨化、吞噬和殺死病原體來啟動炎癥反應(yīng)[18]。IL-6和IL-1β是單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞產(chǎn)生的一種重要細胞因子，是炎癥反應(yīng)急性期的關(guān)鍵介質(zhì)[19]。本研究提示肺炎兒童患者miR-147a和miR-127表達下調(diào)與炎癥水平上升有關(guān)，與上述研究結(jié)果一致。這充分說明血清miR-147a和miR-127表達水平介導(dǎo)肺炎發(fā)生、發(fā)展的主要基質(zhì)可能與調(diào)節(jié)肺功能基因及炎癥因子密切相關(guān)。本研究不足之處在于臨床樣本收集有限，miR-147a和miR-127參與肺炎進展具體分子機制還需深入探討，后期研究將擴大樣本并結(jié)合基礎(chǔ)研究開展，為兒童肺炎診療提供可靠生物靶點。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)兒童肺炎血清中miR-147a和miR-127表達下調(diào)，且與肺功能指標呈正相關(guān)，與炎癥因子呈負相關(guān)，初步探明miR-147a和miR-127可能是潛在的肺炎診療靶點。