董平，易宇文，唐紅梅，程利思，蒲慧，吳華昌，鄧靜*

(1.四川旅游學(xué)院 食品學(xué)院，成都 610100；2.四川省雅士科技有限公司，成都 610042)

生香酵母是一類能夠合成令人愉悅的香氣成分的酵母，在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生酯、醇、醛、酚、酮、有機酸以及芳香烴類等香味物質(zhì)，對發(fā)酵食品特殊風(fēng)味與質(zhì)地的形成具有重要作用。研究表明，在各類酒、調(diào)味品、發(fā)酵蔬菜、功能飲料等食品發(fā)酵過程中加入生香酵母能夠顯著提升發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味[1-3]。然而生香酵母在長期培養(yǎng)過程中往往會因分裂次數(shù)過多而退化，并增加污染的概率[4]。因此，將具有優(yōu)良性狀的生香酵母制備成活性酵母凍干菌劑可以有效避免上述問題。同時，酵母凍干菌劑還具有使用安全、穩(wěn)定性高、長期儲存不失活等優(yōu)點[5-6]。

真空冷凍干燥技術(shù)是制備微生物活性菌劑最常用的方法，通過將菌懸液預(yù)冷凍、升華干燥、解吸干燥幾個步驟去除水分，達到干燥的目的[7]，目前在酵母[8-9]、乳酸菌[10-11]以及復(fù)合菌種[12-13]凍干菌劑的制備過程中普遍使用真空冷凍干燥技術(shù)。然而冷凍干燥過程往往會引起細胞膜通透性改變、蛋白質(zhì)變性失活以及DNA損傷，從而對微生物有一定的傷害甚至導(dǎo)致其死亡，影響細胞存活率[14]。為了減少冷凍干燥對微生物的不良影響，通常會在菌劑制備過程中添加冷凍保護劑，如王憲斌等[15]在酵母凍干菌劑制備過程中以葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、脫脂奶粉以及谷氨酸鈉作為保護劑，發(fā)現(xiàn)每種保護劑都能不同程度地增加酵母的凍干存活率，并通過正交試驗優(yōu)化明確了使用5%海藻糖∶9%乳糖∶9%蔗糖為3∶5∶4的復(fù)配保護劑，酵母的存活率最高，為85.17%，說明這些保護劑對冷凍干燥過程中的酵母具有一定的保護作用，且復(fù)配保護劑的保護效果優(yōu)于單一保護劑。此外，甘油、葡聚糖、吐溫80、可溶性淀粉等也能夠顯著提高微生物的冷凍存活率[16]。然而冷凍保護劑種類繁多，不同保護劑針對不同微生物的保護效果也有差異，且往往要考慮保護劑的價格。綜合多種因素，選擇合適的保護劑才能盡可能提高微生物的冷凍存活率[17]。

芫根(BrassicarapaL.)在高海拔地區(qū)廣泛種植，是藏民最主要的蔬菜來源。芫根不僅營養(yǎng)豐富，還具有多種保健功效[18]。近年來，有研究者將芫根經(jīng)鹽腌、自然發(fā)酵后制成腌菜[19]，風(fēng)味獨特，口感爽脆，不僅延長了芫根的儲藏期，而且豐富了芫根相關(guān)產(chǎn)品。然而自然發(fā)酵的蔬菜往往產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定[20]，且風(fēng)味也需要進一步提升。因此，進一步增加芫根腌菜的產(chǎn)品穩(wěn)定性，提高產(chǎn)品風(fēng)味是目前亟需解決的問題。

本實驗將前期從川南腌菜中分離得到的耐鹽生香酵母YC14經(jīng)過增殖培養(yǎng)，從離心條件、保護劑兩個方面入手，以酵母存活率為指標，確定活性酵母凍干菌劑最優(yōu)離心條件及最佳保護劑配方，明確真空冷凍干燥對YC14產(chǎn)酯能力的影響。同時將自制YC14凍干菌劑應(yīng)用于芫根的發(fā)酵，探究耐鹽生香酵母在腌菜發(fā)酵中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

自篩耐鹽生香酵母菌株YC14 (Candidaparapsilosis)：由實驗室前期分離并保存；新鮮芫根：購自四川白玉縣；葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油、吐溫80、蛋白胨、Vc、酵母膏、PDA培養(yǎng)基：購自成都金山化學(xué)試劑有限公司；海藻糖：購自上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司；谷氨酸鈉：購自上海源葉生物科技有限公司。

產(chǎn)酯培養(yǎng)基：葡萄糖8 g，酵母膏1 g，蛋白胨2 g，蒸餾水100 mL。

FD-1-50真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；Universal 320冷凍離心機 德國Hettich公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化與酵母培養(yǎng)液的制備

挑取酵母培養(yǎng)物置于YPD培養(yǎng)基中活化，活化后的菌株接種至PDA培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)20 h制得酵母培養(yǎng)液。

1.2.2 菌體離心分離條件研究

根據(jù)文獻報道[21]，取10 mL酵母培養(yǎng)液裝入已滅菌的離心管中，在4 ℃下分別以轉(zhuǎn)速1500，3000，4500，6000 r/min，離心時間3，5，10，15 min的條件進行離心，收集離心后的菌體，以離心存活率為指標，探究離心條件對菌株YC14的影響，以期選擇合適的離心條件。

離心活菌率的計算方式參照文獻[15]。

1.2.3 真空冷凍干燥菌劑的制備流程

菌種增殖培養(yǎng)→離心分離→菌體洗滌→添加保護劑→分裝至培養(yǎng)皿→預(yù)凍→真空冷凍干燥→成品低溫密封保存[22]。

1.2.4 保護劑的選擇

1.2.4.1 凍干菌劑的制備

選擇蔗糖、海藻糖、乳糖、脫脂乳粉、甘油、吐溫80、谷氨酸鈉、Vc 8種凍干保護劑。試驗前各保護劑按質(zhì)量濃度配制成相應(yīng)濃度的水溶液，用0.22 μm的微孔濾膜對各保護劑過濾備用。將酵母離心后得到的菌泥與保護劑按1∶2的比例混勻制成菌懸液。取2 mL菌懸液分別裝入無菌帶塞的凍干瓶中。將上述保護劑與菌體混合物平衡30 min，于-30 ℃預(yù)凍12 h。預(yù)凍完成后，轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機中凍干，條件為：-37 ℃，真空度18 Pa，時間12 h。凍干樣品置于-4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。對照樣添加同等體積無菌水。以凍干存活率為檢測指標，確定最佳凍干保護劑。

凍干活菌率的計算方式參照文獻[15]。

1.2.4.2 保護劑的單因素試驗

8種冷凍保護劑在單因素試驗中所采用的濃度梯度見表1。

1.2.4.3 復(fù)配保護劑響應(yīng)面優(yōu)化試驗

綜合考慮單因素方差分析結(jié)果、凍干保護劑協(xié)同增效途徑及各保護劑成本等方面因素，選取乳糖、脫脂乳粉、吐溫80 3種保護劑，利用響應(yīng)面試驗設(shè)計方法進行復(fù)配保護劑配方探究，見表2。

表2 Box-Behnken Design試驗因素與水平表

1.2.5 總酯的測定

取0.1 g凍干菌劑溶于100 mL無菌水，取1 mL加入50 mL產(chǎn)酯培養(yǎng)基，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)；取2.2 mL酵母培養(yǎng)液，加入50 mL產(chǎn)酯培養(yǎng)基，在同樣的條件進行培養(yǎng)。收集2～7 d的產(chǎn)酯培養(yǎng)基，采用皂化回流法檢測總酯含量[23]。

1.2.6 酵母凍干菌劑應(yīng)用于腌菜發(fā)酵的研究

1.2.6.1 芫根腌菜的制作

預(yù)處理：將新鮮芫根洗凈并去除頭尾，切成后0.5 cm3的芫根丁，晾曬2 d。

腌漬：在晾曬后的芫根丁中按比例添加9%的食鹽，拌勻裝壇，腌漬7 d。

發(fā)酵：將腌漬后的芫根丁脫水，按0.05%的比例接種酵母凍干菌劑，或接入相同數(shù)量的YC14活酵母，空白組不接種。將接種拌料后的芫根丁裝入消毒后的發(fā)酵罐中，置于自然環(huán)境(冬日，平均溫度14 ℃左右)與28 ℃的恒溫環(huán)境中發(fā)酵30 d，發(fā)酵過程中定期搖晃罐體放氣。

1.2.6.2 指標的測定

總酯的測定：參考國標GB/T 10345—2007，采用指示劑法進行總酯測定，每個樣品做3組平行。

總酸的測定：參考國標GB/T 12456—2008，采用酸堿滴定法進行總酸測定，每個樣品做3組平行。

感官評價：本試驗初步探究酵母凍干菌劑對芫根發(fā)酵的影響，因此感官主要考察香氣指標，感官評價標準見表3。

表3 芫根感官評價指標

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert軟件進行試驗設(shè)計，SPSS軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析討論

2.1 離心條件選擇

由圖1可知，隨著離心時間的延長，YC14存活率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中3000 r/min及以上的轉(zhuǎn)速條件下，離心時間為5 min時，YC14存活率最高，而1500 r/min轉(zhuǎn)速條件下離心10 min達到最高存活率，可見離心條件對YC14存活率有明顯影響。在幾種不同的離心條件下，3000 r/min離心5 min時YC14存活率最高，為93.46%。

圖1 離心條件對酵母存活率的影響

2.2 保護劑單因素試驗

結(jié)合表1和表4可知，8種保護劑對YC14的冷凍干燥都有保護作用，但保護效果不同，其中，蔗糖添加量為13%時，凍干存活率最高，為46.93%；海藻糖添加量為11%時，凍干存活率最高，為71.04%；乳糖添加量為3%時，凍干存活率最高，為61.15%；脫脂乳粉添加量為6%時，凍干存活率最高，為85.74%；甘油添加量為5%時，凍干存活率最高，為55.92%；吐溫80添加量為5%時，凍干存活率最高，為86.47%；谷氨酸鈉添加量為4%時，凍干存活率最高，為78.59%；Vc添加量為1.2%時，凍干存活率最高，為46.32%。不論哪種保護劑，濃度過高或過低都會影響其保護效果。

表4 耐鹽生香酵母冷凍保護劑單因素試驗結(jié)果

2.3 單一保護劑選擇

利用SPSS軟件進一步對單因素試驗結(jié)果進行方差分析，判斷各保護劑對YC14凍干存活率的影響情況，以期選擇合適的保護劑，為后期保護劑復(fù)配試驗奠定基礎(chǔ)。

由表5可知，幾種保護劑對YC14凍干存活率的影響均具有顯著性，影響作用由大到小為乳糖>海藻糖>谷氨酸鈉>吐溫80>甘油、脫脂乳粉>Vc>蔗糖。從凍干存活率的角度分析，幾種保護劑對YC14凍干的保護效果由強至弱為吐溫80>脫脂乳粉>谷氨酸鈉>海藻糖>乳糖>甘油>蔗糖>Vc。單一保護劑不足以達到理想的效果，一般采用大分子保護劑與小分子保護劑結(jié)合、滲透性保護劑與非滲透性保護劑結(jié)合、糖類保護劑與蛋白質(zhì)類保護劑結(jié)合的模式復(fù)配形成復(fù)合保護劑，以達到協(xié)同、增效的作用[24]。綜合考慮保護劑對YC14凍干存活率影響的顯著性、保護效果、成本、復(fù)配模式等方面因素，選擇乳糖、脫脂乳粉、吐溫80進行下階段復(fù)配試驗。

表5 各保護劑保護效果及顯著性分析

2.4 BBD響應(yīng)面試驗結(jié)果

利用Design Expert 8.0.6.1 進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，試驗結(jié)果見表6。以乳糖(A)、脫脂乳粉(B)、吐溫80(C)為自變量，凍干存活率為響應(yīng)值進行回歸擬合，得到回歸方程為：凍干存活率=-202.16725+92.25350A+12.41675B+42.49625C+1.95000AB+0.085000AC+1.92417BC-16.79475A2-2.09803B2-5.54725C2。

表6 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

續(xù) 表 %

由表7可知，整體模型達極顯著水平(P<0.0001)，表明該二次模型高度顯著，模型的失擬項不顯著(P>0.05)，說明該方程對試驗擬合較好，能真實解釋實際響應(yīng)結(jié)果。模型C.V.為1.48%，遠小于10%，說明模型的穩(wěn)定性良好。決定系數(shù)R2為0.9981，說明該方程能較好地反應(yīng)各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。信噪比為57.184>4，說明該模型有足夠的分辨能力，能反映試驗結(jié)果。

表7 響應(yīng)面試驗回歸方程方差分析

由方差分析結(jié)果可知，A、B、AB、BC、A2、B2、C2對凍干保護效果的影響極顯著(P<0.0001)，C對凍干保護效果的影響顯著(P<0.05)，AC的交互作用影響不顯著(P>0.05)，各因素對凍干保護效果的響應(yīng)面圖見圖2，與方差分析結(jié)果一致。由各因素對試驗指標的影響程度F值可知，各因素對凍干保護效果的影響程度為B>A>C，即脫脂乳粉>乳糖>吐溫80，該結(jié)論與單一保護劑選擇的結(jié)論“幾種保護劑對YC14凍干存活率均具有顯著性，影響作用大小為乳糖>海藻糖>谷氨酸鈉>吐溫80>甘油>脫脂乳粉>Vc>蔗糖”不同，可能是因為單一保護劑復(fù)配成混合體系后對菌株凍干存活率的顯著性影響會發(fā)生改變。

圖2 保護劑優(yōu)化響應(yīng)面圖

由圖2響應(yīng)面試驗分析可知，當乳糖、脫脂乳粉、吐溫80的添加量分別為3.15%、6.72%、5.02%時，酵母菌株凍干存活率為91.55%。經(jīng)試驗驗證，實際凍干存活率為90.82%，見表8。相對誤差在1%以內(nèi)，說明該模型可較準確地對凍干保護劑最優(yōu)配方進行預(yù)測。

表8 驗證試驗結(jié)果

2.5 真空冷凍干燥對耐鹽生香酵母產(chǎn)酯能力的影響

為了研究真空冷凍干燥是否影響耐鹽生香酵母的產(chǎn)酯能力，分別取新鮮酵母菌液和現(xiàn)制的酵母凍干菌劑(活酵母數(shù)量約為2.6×108個)接種至50 mL產(chǎn)酯培養(yǎng)基，于28 ℃、150 r/min進行培養(yǎng)，并對其產(chǎn)酯能力進行檢測。由圖3可知，隨著時間的延長，新鮮菌液和凍干菌劑的產(chǎn)酯培養(yǎng)基中總酯含量逐漸增加，之后趨于穩(wěn)定，說明此時酯類物質(zhì)的生成與揮發(fā)(可能還有酯酶的水解作用[25])進入平衡階段。在2～4 d的時間內(nèi)，新鮮酵母產(chǎn)酯量高于凍干菌劑，主要原因可能是凍干菌劑在增殖前有一個活化的過程，增殖緩慢，酵母細胞數(shù)量較新鮮酵母培養(yǎng)液少，影響酯類物質(zhì)的生成。第5天開始新鮮酵母菌液和凍干菌劑之間的產(chǎn)酯量差別不大，說明真空冷凍干燥并不影響生香酵母酯類物質(zhì)的合成。

圖3 真空冷凍干燥對耐鹽生香酵母YC14產(chǎn)酯能力的影響

2.6 酵母凍干菌劑在芫根腌菜發(fā)酵中的應(yīng)用

為評價凍干菌劑在芫根腌菜發(fā)酵過程中的效果，選擇室溫和28 ℃恒溫發(fā)酵30 d的芫根腌菜進行理化測定及感官評分，見表9。在不同溫度發(fā)酵條件下，接種活菌與凍干菌劑發(fā)酵后腌菜總酯、總酸含量以及感官評分均比未接種發(fā)酵顯著提高，說明產(chǎn)酯酵母YC14能夠顯著改善腌菜的品質(zhì)；而接種活菌與凍干菌劑的腌菜在總酯、感官評分以及室溫發(fā)酵條件下總酸的差異并不明顯，進一步說明冷凍干燥對YC14菌株的影響較小。另外，較高的恒溫發(fā)酵條件更有利于酸與酯的形成，增加腌菜的感官評分，說明芫根腌菜的制備應(yīng)選擇較高的發(fā)酵溫度，但更精確的芫根腌菜發(fā)酵適宜溫度有待進一步深入研究。

表9 不同發(fā)酵條件下芫根腌菜理化及感官分析結(jié)果

3 結(jié)論

試驗表明，在離心轉(zhuǎn)速為3000 r/min、離心時間為5 min時耐鹽生香酵母YC14離心存活率可達93.46%；以凍干存活率為指標，結(jié)合單因素及響應(yīng)面試驗，當乳糖、脫脂乳粉、吐溫80的添加量分別為3.15%、6.72%、5.02%時，YC14預(yù)測凍干存活率最大，為91.55%，經(jīng)試驗驗證，實際存活率為90.82%，誤差較小，為0.73%，說明該模型能夠較準確預(yù)測凍干保護劑的最優(yōu)配方，具有實際應(yīng)用意義。冷凍干燥過程對YC14酯類物質(zhì)的合成并沒有顯著的影響。將自制YC14凍干菌劑接種于芫根腌菜進行發(fā)酵，對發(fā)酵30 d的腌菜進行指標測定，接種YC14的芫根腌菜總酸、總酯以及感官品質(zhì)都有一定程度的提高，在28 ℃的發(fā)酵環(huán)境下更利于芫根腌菜香氣的形成。