劉治華，彭 穎，孫崇智，李曉波

? 藥理與臨床 ?

基于體外人源胃腸道代謝評(píng)價(jià)烏梅粉和水煎劑對(duì)克羅恩大鼠的治療作用

劉治華，彭 穎#，孫崇智，李曉波*

上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240

評(píng)價(jià)烏梅粉和水煎劑對(duì)消化性潰瘍的療效。采用2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS）誘導(dǎo)的克羅恩病大鼠模型，比較烏梅粉和水煎劑的抗炎活性；分別采用超高效液相色譜-電噴霧電離四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（ultra-high performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MSE）法、苯酚-硫酸法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法比較烏梅粉和水煎劑的體外胃腸道代謝前及不同時(shí)間點(diǎn)孵育液中化學(xué)成分、總糖含量及短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）變化，以揭示其可能活性物質(zhì)。與對(duì)照組比較，克羅恩病大鼠體質(zhì)量顯著降低（＜0.01），脾臟腫大（＜0.01），胸腺萎縮（＜0.05），結(jié)腸縮短且伴有結(jié)腸損傷和潰瘍（＜0.01）；與模型組比較，烏梅粉和水煎劑均有緩解結(jié)腸損傷的作用（＜0.05、0.01）。烏梅粉對(duì)結(jié)腸髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性的抑制效果優(yōu)于烏梅水煎劑（＜0.05），而烏梅水煎劑降低克羅恩病大鼠血清中炎癥因子白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和一氧化氮（nitric oxide，NO）水平優(yōu)于烏梅粉（＜0.01）。腸道菌孵育液中，與烏梅水煎劑相比，烏梅粉中的化學(xué)成分及其代謝產(chǎn)物的含量更高且保留時(shí)間更久；與空白菌液相比，0～12 h烏梅粉總糖降解率降低，而烏梅水煎劑總糖降解率增加；同時(shí)，烏梅水煎劑增加腸道菌孵育液中SCFAs的含量，而烏梅粉相反。烏梅粉可能對(duì)結(jié)腸MPO活性的抑制作用更好，而烏梅水煎劑可能更有利于降低機(jī)體循環(huán)炎癥因子IL-6和NO水平，原因在于烏梅粉中有效成分的含量更高；但烏梅粉可能對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定損傷，導(dǎo)致胃腸道中有抗炎活性的SCFAs含量降低，進(jìn)而可能導(dǎo)致吸收進(jìn)入血液循環(huán)的SCFAs含量低于烏梅水煎劑。

烏梅；粉劑；水煎劑；克羅恩?。晃改c道代謝；UPLC-QTOF-MSE；短鏈脂肪酸

“中藥湯劑”最早在夏商時(shí)代《甲乙經(jīng)》序中，有“湯液始于伊尹”的記載，是中醫(yī)臨床治療疾病最古老、最常用的劑型之一。由于中藥“煎煮”成湯劑費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且不容易保存，現(xiàn)代應(yīng)用中常將中藥提取液濃縮制成顆粒劑[1]；或藥材凈選除雜后干燥、粉碎成一定粒度的顆?；蚍勰?，供臨床調(diào)配入藥[2]。2種方法都有配伍靈活、質(zhì)量可控、免煎高效的特點(diǎn)。

烏梅是薔薇科植物梅(Sieb.) Sieb. et. Zucc.的近成熟果實(shí)經(jīng)低溫烘干，悶至色變黑制成，具有斂肺、澀腸、生津、安蛔的功效，可用于肺虛久咳、久瀉久痢、虛熱消渴、蛔厥嘔吐腹痛[3]。烏梅炮制歷史悠久，有凈烏梅、烏梅肉、醋烏梅、蜜制烏梅、烏梅炭等[4]。現(xiàn)代只有烏梅（個(gè)子或打碎）、烏梅肉、烏梅炭（取肉或連核炒）應(yīng)用于臨床[5]，亦可用烏梅水煎劑或者烏梅粉口服治療腹瀉、克羅恩?。–rohn’s disease，CD）等[6-7]。已有研究表明，烏梅水煎劑可提高葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠病變組織的超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛含量[8]。本課題組前期研究也表明，烏梅水煎劑和醇提物均可改善2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitro-benzenesulfonic acid，TNBS）誘導(dǎo)的CD大鼠癥狀[9]。但烏梅粉對(duì)CD的藥效以及烏梅水煎劑和烏梅粉干預(yù)CD的藥效差異尚不明確。

中醫(yī)臨床上烏梅水煎劑或者烏梅粉均為口服使用，因此它們所含化學(xué)成分不可避免地要經(jīng)過胃腸道代謝。在胃腸道環(huán)境中，中藥的多種成分發(fā)生生物轉(zhuǎn)化而發(fā)揮生物活性。例如，烏梅中羥基肉桂酸類的咖啡?？崴峥稍谛∧c保持完整，但在腸道菌中酯酶的作用下發(fā)生降解，生成咖啡酸被吸收利用[10]。為了闡釋烏梅粉和烏梅水煎劑應(yīng)用的科學(xué)性以及二者的差異，本研究比較了烏梅粉和烏梅水煎劑在TNBS誘導(dǎo)CD大鼠體內(nèi)的藥效差異，并分析二者在人工胃腸液及人源腸道菌中的代謝情況，為烏梅的臨床應(yīng)用提供科學(xué)支撐。

1 材料

1.1 動(dòng)物

CL級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量（160±10）g，6周齡，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)2015000551519。動(dòng)物于室溫飼養(yǎng)，模擬12 h光照12 h黑暗，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)上海交通大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)A2017044）。

1.2 藥材

梅果于2017年采自云南大理，經(jīng)上海交通大學(xué)李曉波教授鑒定為梅(Sieb.) Sieb. et. Zucc.的果實(shí)。烏梅由梅果加工，按本課題組報(bào)道方法[9]制備，即采用傳統(tǒng)曬干悶黑的方式干燥而成。烏梅樣品（樣品號(hào)為YanMei201707）儲(chǔ)藏在上海交通大學(xué)藥學(xué)院藥品儲(chǔ)藏柜。

1.3 藥品與試劑

對(duì)照品5-咖啡酰奎寧酸（批號(hào)wkq16052705）、4-咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)wkq16081903）、3-咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)wkq16050805）、山柰酚（批號(hào)wkq20042613）購自維克奇生物技術(shù)有限公司；對(duì)照品熊果酸（批號(hào)DST180606-019）、4-香豆酸（批號(hào)DST190406-057）、表兒茶素（批號(hào)DST190308-035）、咖啡酸（批號(hào)DSTDK001301）購自成都德斯特生物技術(shù)有限公司；對(duì)照品沒食子酸（批號(hào)MUST-13040103）、丁香酸（批號(hào)MUST19041920）購自成都曼斯特生物科技有限公司；對(duì)照品白藜蘆醇（批號(hào)111535-201703）、香草酸（批號(hào)110776-201805）購自中國食品藥品檢定研究院。以上對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。美沙拉嗪（0.4 g/片，批號(hào)1611171）購自恒誠制藥集團(tuán)淮南有限公司；腸炎寧（0.4 g/片，批號(hào)1707006）購自江西天施康弋陽制藥有限公司；甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純購自德國Merck公司；其他試劑均為分析純，購自上海國藥化學(xué)試劑公司；TNBS（批號(hào)SLBT1675）購自美國Sigma-Aldrich公司；BCA蛋白測定試劑盒（批號(hào)16K03A46）購自博士德生物科技有限公司；髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒（批號(hào)201905）、一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒（批號(hào)201909）購自南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（批號(hào)A301BHS-02）、IL-6 ELISA試劑盒（批號(hào)A306H11123）、IL-10 ELISA試劑盒（批號(hào)A310H10409）、IL-17 ELISA試劑盒（批號(hào)A317H10824）均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；豬胰蛋白酶（批號(hào)Gibco27250-018）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；胃蛋白酶（批號(hào)RM18Y403）、厭氧菌肉湯（anaerobic broth，GAM）、維生素K1（批號(hào)RW18Q404）、氯化血紅素（批號(hào)RS17B1108）購自上海瑞永生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器

Milli-Q超純水純化系統(tǒng)（德國Millipore公司）；SK5200H-T型超聲儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；LE225D型電子分析天平（德國Sartorius公司）；5417R型低溫高速離心機(jī)（德國Eppendoff公司）；Vortex-2型渦旋混勻器（美國Scientific Industies）；800-DT型厭氧孵育箱（美國Plas-Labs Lansing公司）；DM2000型LED顯微鏡（德國Leica公司）；Acquity UPLC超高效液相色譜儀、Vion ims QTOF質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；7890A-5975C型GC-MS儀（美國安捷倫公司）。

2 方法

2.1 烏梅粉及水煎劑的制備

2.1.1 烏梅粉的制備 烏梅潤濕去核，再經(jīng)50 ℃烘制24 h得到烏梅肉。烏梅肉打成細(xì)粉（按照《中國藥典》2020年版，細(xì)粉全部通過5號(hào)篩，通過6號(hào)篩不少于95%）備用。

2.1.2 烏梅水煎劑的制備 精密稱取干燥的烏梅肉，加10倍量的蒸餾水，100 ℃回流提取3次，每次2 h，抽濾后，合并濾液，減壓濃縮至適當(dāng)體積，然后經(jīng)冷凍干燥制成凍干粉，用前加入溶劑搖勻，提取率為12.9%（以生藥量計(jì)）。

2.2 CD造模及給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組、美沙拉嗪（0.1 g/kg）組、腸炎寧（0.34 g/kg）組及烏梅粉低、高劑量（1.08、3.24 g/kg，分別相當(dāng)于臨床劑量的1、3倍）[11]組和烏梅水煎劑低、高劑量（1.08、3.24 g/kg，分別相當(dāng)于臨床劑量的1、3倍）組，每組8只。在造模前未發(fā)現(xiàn)明顯的飲食、飲水變化。除對(duì)照組外，大鼠禁食12 h后，ip 3%戊巴比妥鈉麻醉，用內(nèi)徑2 mm左右的軟聚氯乙烯管，將含2% TNBS的40%乙醇溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配），以80 mg/kg的劑量推至大鼠結(jié)腸腔內(nèi)8 cm處。為防止藥液流出，灌腸后，大鼠倒置1 min[12]。CD造模后6 h，各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig等體積的生理鹽水，1次/d，連續(xù)10 d。

2.3 大鼠體質(zhì)量及免疫器官指數(shù)測定

每2天記錄各組大鼠造模前、后的體質(zhì)量變化。大鼠末次給藥后，禁食12 h，腹主動(dòng)脈取血（血清和全血各1管）。血清于4 ℃靜止12 h后，4 ℃、3000 r/min離心15 min，在無菌操作臺(tái)中取血漿至無菌EP管中，于?80 ℃保存。大鼠處死后，取胸腺、脾，稱定質(zhì)量，計(jì)算免疫器官指數(shù)。取大鼠結(jié)腸段，拍照待用；結(jié)腸縱向切段，于?80 ℃保存待用。

免疫器官指數(shù)＝免疫器官質(zhì)量/體質(zhì)量

2.4 大鼠結(jié)腸損傷評(píng)分及病理觀察

測定各組大鼠結(jié)腸長度，觀察結(jié)腸整體形態(tài)，按照文獻(xiàn)方法[9]進(jìn)行整體結(jié)腸損傷評(píng)分。取各組大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸5 mm，于中性多聚甲醛中固定，石蠟包埋，制備0.7 μm厚的切片，脫臘、水化后，進(jìn)行HE染色，于顯微鏡下觀察并拍照，并按本課題組前期報(bào)道方法[9]進(jìn)行評(píng)分。

2.5 大鼠結(jié)腸組織MPO活性的測定

取各組大鼠結(jié)腸組織，用冷的生理鹽水清洗后，加入50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）勻漿提取蛋白，采用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度，按照MPO試劑盒說明書測定結(jié)腸組織MPO活性。

2.6 大鼠血清中細(xì)胞因子水平的測定

取各組大鼠血清，按照試劑盒說明書測定NO、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-17水平。

2.7 烏梅粉及水煎劑在體外人工胃液、腸液孵育和體外人源腸道菌孵育

2.7.1 人工胃液孵育 參照《中國藥典》2020年版三部配制人工胃液[13]?！吨袊幍洹?020年版一部烏梅的日用量為6～12 g[3]，取最大量12 g。人正?；A(chǔ)胃液量為10～100 mL，取最大值100 mL。取人工胃液10 mL，在37 ℃水浴鍋中溫浴30 min，然后加入相當(dāng)于1.2 g生藥的烏梅粉或水煎劑的凍干粉末，根據(jù)胃排空時(shí)間為2～4 h，分別于0、1、2、4 h取樣1 mL。

2.7.2 人工腸液孵育 參照《中國藥典》2020年版三部配制人工腸液[13]。取10 mL人工腸液，在37 ℃水浴鍋中溫浴30 min，然后加入相當(dāng)于1.2 g生藥的烏梅粉或水煎劑的凍干粉末，根據(jù)腸排空時(shí)間為6 h，分別于0、2、4、6 h取樣1 mL。

2.7.3 人源腸道菌孵育 參照本課題組前期方法配制人源腸道菌菌液[14]，根據(jù)健康人24 h內(nèi)的正常糞便量為100～300 g（平均200 g），擬定烏梅與人糞便等效比例為12∶200，即12 g生藥∶200 g糞便。200 g糞便對(duì)應(yīng)的GAM肉湯培養(yǎng)基為5 L，即烏梅水煎液與腸道菌液比為12∶5。取生藥量120 mg的烏梅粉或水煎劑的凍干粉末，溶于50 mL腸道菌液中，37 ℃厭氧孵育，分別于0、3、6、12、24、36、48 h取樣1 mL。同時(shí)設(shè)定空白菌液對(duì)照（腸道菌在培養(yǎng)基中孵育，不加待測物）和待測成分＋GAM肉湯培養(yǎng)基（不加入腸道菌液）對(duì)照。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣3份，分別用于酚酸等小分子、總糖以及糞便短鏈脂肪酸的測定。

2.8 化學(xué)成分分析

2.8.1 超高效液相色譜-電噴霧電離四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（ultra-high performance liquid chromatography-electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MSE）分析

（1）樣品制備：采用蒸餾水混懸烏梅細(xì)粉，制備烏梅混懸液。取烏梅粉混懸液和水煎劑，以及各時(shí)間點(diǎn)烏梅粉和水煎劑的體外孵育液1 mL，立即用1倍量水飽和的正丁醇萃取3次，收集正丁醇萃取液，于40 ℃氮?dú)庀麓蹈?，加?.5 mL甲醇復(fù)溶，4800 r/min離心10 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)行UPLC-QTOF-MSE檢測。

（2）色譜條件：Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫：0～2 min，99% A；2～3 min，99%～85% A；3～9 min，85%～70% A；9～11 min，70%～50% A；11～15 min，50%～0 A；15～18 min，100% B；18～18.1 min，0～99% A；18.1～20 min，99% A。進(jìn)樣量1 μL；體積流量0.4 mL/min；柱溫35 ℃。

（3）質(zhì)譜條件：電噴霧電離，離子源為負(fù)離子模式（ESI?）；毛細(xì)管電壓為2.5 kV；錐電壓為40 kV；離子源溫度為100 ℃；去溶劑化溫度為450 ℃；錐孔氣體積流量為50 L/h；脫溶劑氣體體積流量為900 L/h；碰撞能量為20～45 eV；掃描范圍/50～1000。使用Unifi 1.8.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2.8.2 總糖含量測定 分別取烏梅粉混懸液和水煎劑，以及各時(shí)間點(diǎn)烏梅粉和水煎劑的人源腸道菌孵育液1 mL，根據(jù)苯酚-硫酸法[15]測定總糖含量，間接考察孵育液中腸道菌代謝生長速率的變化。

2.8.3 短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）含量測定 參照文獻(xiàn)方法[16]及本課題組前期建立的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）方法測定腸道菌孵育液中SCFAs含量。

（1）樣品制備：取各時(shí)間點(diǎn)的烏梅腸道菌厭氧孵育液1 mL，5000 r/min離心20 min，取上清0.4 mL，加入0.1 mL 50%硫酸，再加入0.5 mL內(nèi)標(biāo)（二甲基戊酸，100 μg/mL），渦旋混勻，12 000 r/min離心10 min，4 ℃放置30 min，取上層乙醚溶液供GC-MS分析。

（2）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取醋酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸各0.25 g，于25 mL量瓶中，用50 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液定容，配成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的對(duì)照品母液。將對(duì)照品母液用內(nèi)標(biāo)溶液梯度稀釋成含對(duì)照品各1000、400、200、100、50、10、5 μg/mL的系列溶液（含內(nèi)標(biāo)50 μg/mL），進(jìn)樣分析。

（3）GS-MS條件：DB-5MS色譜柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；柱溫100 ℃保持5 min，以20 ℃/min升至190 ℃，以3 ℃/min升至260 ℃，以10 ℃/min升至300 ℃，保持10 min。進(jìn)樣溫度280 ℃；進(jìn)樣量1 μL；分流比5∶1；載氣為氦氣（99.999%）；體積流量1.0 mL/min；接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；電離方式為電子轟擊離子源正離子模式（ESI＋），70 eV；檢測器電壓1471 V；掃描方式為全掃描模式，掃描范圍/33～600；溶劑延遲5 min；采用NIST2011譜庫進(jìn)行分析。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用Graphpad prism 9軟件的單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 烏梅粉及水煎劑中的化學(xué)成分分析

采用UPLC-Q-TOF-MSE方法對(duì)烏梅粉和水煎劑中的化學(xué)成分進(jìn)行指認(rèn)和鑒定，共鑒定了47個(gè)化合物，包括脂肪酸類（fatty acids，F(xiàn)A）成分8個(gè)、多酚類（polyphenols，Pp）成分25個(gè)、糖苷類（glycosides，Gly）成分12個(gè)以及三萜類（triterpenoids，Tp）成分2個(gè)。烏梅粉和水煎劑中檢測到的化學(xué)成分無明顯差別，具體信息見表1（均為共有成分）。代表性的UPLC-Q-TOF-MSE質(zhì)譜基峰圖見圖1。

表1 基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)的烏梅粉和水煎劑中主要化學(xué)成分的表征

Table 1 Characterization of chemical constituents of powder and water decoction by UPLC-QTOF-MS

序號(hào)tR/min分子離子(m/z)偏差(×10?6)分子式MS/MS碎片 (m/z)化學(xué)成分歸屬 C10.70134.020.55C4H6O5133.015 9, 96.960 4蘋果酸FA C20.91174.02?0.08C6H6O6173.008 9, 111.008 7烏頭酸FA C30.94192.031.48C6H8O7191.019 6, 111.008 7, 87.008 7檸檬酸FA C41.29220.06?0.77C8H12O7265.056 5, 219.050 8, 111.008 71,5-檸檬酸二甲酯FA C5std1.49170.021.52C7H6O5169.014 1, 111.024 7, 191.056 0沒食子酸Pp C62.39206.04?5.31C7H10O7205.035 3, 111.008 72-檸檬酸甲酯FA C73.12154.031.46C7H6O4153.019 2, 108.251 53,4-二羥基苯甲酸Pp C83.52270.11?0.22C13H18O6315.107 1, 269.102 6芐基-β-D-葡萄糖苷Gly C9std3.56354.102.76C16H18O9353.087 0, 191.055 6, 135.044 73-咖啡酰奎寧酸Pp C103.63182.060.78C9H10O4181.050 8, 109.029 7, 163.040 4二羥基苯丙酸Pp C11std3.72354.103.69C16H18O9353.087 1, 191.055 7, 135.045 4, 179.034 75-咖啡?？鼘幩酨p C123.75488.15?0.33C21H28O13487.145 2, 145.029 6對(duì)香豆酰-3-O-蔗糖酯Pp C133.83300.05?0.58C12H12O9299.040 5, 173.009 1, 111.008 9mumefuralFA C143.87354.10?0.30C16H18O9353.087 5, 179.034 8, 135.045 0, 173.045 44-咖啡酰奎寧酸Pp C153.94300.05?0.58C12H12O9299.040 5, 111.008 9, 87.008 1, 67.018 7mumefural異構(gòu)體FA C163.95368.111.28C17H20O9367.103 4, 191.056 0, 173.009 23-咖啡?？鼘幩峒柞セ?-阿魏酰奎寧酸Pp C17std3.99180.042.11C9H8O4179.034 8, 173.009 1, 135.045 1咖啡酸Pp C18std4.00290.082.87C15H14O6289.071 8, 109.029 5, 245.081 9表兒茶素Pp C194.04457.16?1.57C20H27NO11511.109 4, 502.156 6, 111.008 7苦杏仁苷Gly C204.04346.130.37C15H22O9391.124 93,4,5-三甲氧基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷Gly C214.05530.160.02C23H30O14529.155 7, 145.029 5mumeose APp C22std4.06168.041.21C8H8O4167.034 5, 151.040 2, 108.021 5香草酸Pp C234.08402.152.77C18H26O10447.150 5, 401.145 0, 269.102 8苯甲醇櫻草糖苷Gly C244.09368.11?0.05C17H20O9367.103 3, 161.024 2, 191.055 93-咖啡酰喹酸甲酯異構(gòu)體Pp C254.14270.11?0.22C13H18O6315.108 7, 145.029 7芐基-β-D-葡萄糖苷異構(gòu)體Gly C264.16402.152.77C18H26O10447.151 0, 401.145 3苯甲醇櫻草糖苷異構(gòu)體Gly C27std4.18198.050.05C9H10O5197.045 5, 173.045 6丁香酸Pp C284.46296.13?1.42C15H20O6295.117 9, 133.029 4香茅醇-β-D-葡萄糖苷Gly C294.47295.11?0.89C14H17NO6340.104 1, 295.117 9野黑櫻苷Gly C304.48336.080.04C16H16O8335.077 8, 161.024 05-O-咖啡酰莽草酸Pp C31std4.56164.05?1.18C9H8O3163.040 3, 119.050 3, 111.008 84-香豆酸Pp C324.60336.092.25C16H16O8335.077 3, 191.056 0, 161.024 44-O-咖啡酰莽草酸Pp C334.73610.151.41C27H30O16609.145 1, 300.027 6, 302.037 5蘆丁Gly C344.75336.092.96C16H16O8381.082 4, 335.0780, 145.029 6, 191.056 33-咖啡酰莽草酸Pp C354.94166.061.45C9H10O3165.056 1, 147.045 2, 119.050 23-羥苯基丙酸Pp C364.94464.10?0.37C21H20O12509.093 1, 463.088 2槲皮素3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷Gly C375.30420.180.10C22H28O8419.171 3, 271.060 5南燭木樹脂酚Pp C385.36336.08?0.32C16H16O8381.082 4, 269.081 5, 191.056 0, 173.045 43-咖啡酰莽草酸異構(gòu)體Pp C395.57248.090.40C10H16O7247.082 3, 111.008 8, 173.009 21,5-檸檬酸二乙酯FA C40std6.40228.08?0.51C14H12O3227.071 2, 143.050 4白藜蘆醇Pp C416.77434.12?1.92C21H22O10433.114 4, 219.065 3, 152.011 4, 108.021 5柚皮素7-O-β-D-葡萄糖Gly C426.80326.14?0.72C16H22O7371.135 0, 191.055 4,丁子香苷Gly C43std7.45302.040.47C15H10O7301.035 2, 111.008 5槲皮素Pp C448.28656.200.73C29H36O17655.186 7, 145.029 8, 574.323 7prunose IIPp C45std8.97286.052.18C15H10O6285.040 4, 116.928 7, 159.045 2山柰酚Pp C4613.23472.35?0.67C30H48O4471.347 8, 539.331 6科羅索酸Tp C47std14.58456.36?1.08C30H48O3455.352 6, 523.340 1熊果酸Tp

std：與對(duì)照品比對(duì)

std: compared with reference substances

圖1 烏梅粉 (A) 和水煎劑(B) 中化學(xué)成分的代表性基峰色譜圖

3.2 烏梅粉及水煎劑對(duì)TNBS誘導(dǎo)CD大鼠體質(zhì)量、免疫器官指數(shù)、整體結(jié)腸損傷評(píng)分及結(jié)腸病理變化的影響

如表2所示，給藥第9天，與對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，美沙拉嗪組、烏梅粉低劑量組和烏梅水煎劑低、高劑量組大鼠體質(zhì)量均明顯升高（＜0.05、0.01）。與對(duì)照組比較，模型組大鼠胸腺指數(shù)顯著降低（＜0.05），脾臟指數(shù)顯著升高（＜0.01），表明胸腺萎縮同時(shí)伴有脾臟腫大；與模型組比較，烏梅粉低劑量組和烏梅水煎劑低劑量組大鼠胸腺指數(shù)明顯升高（＜0.05、0.01），腸炎寧組、烏梅粉高劑量組和烏梅水煎劑低、高劑量組脾臟指數(shù)明顯降低（＜0.05、0.01）。與對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸整體損傷評(píng)分明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠結(jié)腸整體損傷評(píng)分明顯降低（＜0.05、0.01）。

進(jìn)一步采用HE染色方法觀察結(jié)腸組織形態(tài)及炎癥情況，如圖2所示，對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)正常，柱狀細(xì)胞清晰，杯狀細(xì)胞排列有序，固有層、黏膜肌層和黏膜下層連接緊密，黏膜肌層較薄，肌層和質(zhì)膜層皆完整；而模型組大鼠結(jié)腸組織上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，固有層與黏膜肌層裂隙增大，TNBS甚至透過黏膜肌層，使肌層和質(zhì)膜層結(jié)構(gòu)改變；此外，模型組大鼠炎癥細(xì)胞的數(shù)量和分布范圍也較對(duì)照組明顯增多。烏梅粉和水煎劑組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞完整，結(jié)腸損傷程度較模型組明顯改善（＜0.01）。

表2 烏梅粉和水煎劑對(duì)TNBS誘導(dǎo)CD大鼠體質(zhì)量、免疫器官指數(shù)和整體結(jié)腸損傷評(píng)分的影響(, n = 8)

與對(duì)照組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01

< 0.05P< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group

1-上皮 2-固有層 3-黏膜肌層 4-黏膜下層 5-肌層 6-質(zhì)膜 A-對(duì)照組 B-模型組 C-美沙拉嗪組 D-腸炎寧組 E-烏梅粉低劑量組 F-烏梅粉高劑量組 G-烏梅水煎劑低劑量組 H-烏梅水煎劑高劑量組，圖3同 與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01

3.3 烏梅粉及水煎劑對(duì)CD大鼠結(jié)腸組織中MPO活性及血清中NO、IL-1β、IL-6、IL-17和IL-10水平的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中MPO活性及血清中NO、IL-1β、IL-6、IL-17水平均顯著升高（＜0.01），血清中IL-10水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠結(jié)腸組織中MPO活性及血清中NO、IL-6、IL-17水平均顯著降低（＜0.05、0.01），烏梅粉低劑量組血清中IL-10水平顯著升高（＜0.05），除烏梅粉高劑量組外，其余各給藥組血清中IL-1β水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。其中烏梅粉高劑量組對(duì)結(jié)腸組織MPO活性的抑制作用較烏梅水煎劑高劑量組更為顯著（＜0.05），烏梅水煎劑高劑量組對(duì)血清中IL-6水平的抑制作用較烏梅粉高劑量組更為顯著（＜0.01），烏梅水煎劑低劑量組對(duì)血清中NO水平的抑制作用較烏梅粉低劑量組更為顯著（＜0.01）。為探究造成上述差異的主要原因，進(jìn)一步比較烏梅粉和水煎劑中的化學(xué)成分在體外模擬人胃腸道中的代謝情況。

3.4 烏梅粉及水煎劑的化學(xué)成分在體外模擬人胃腸道中的代謝變化

采用UPLC-Q-TOF-MSE方法對(duì)烏梅粉和水煎劑在人工胃液/腸液中孵育前后的化學(xué)成分進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)隨孵育時(shí)間變化，主要化學(xué)成分相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著性變化，表明烏梅中的主要化學(xué)成分在人工胃液和腸液中是穩(wěn)定的，但在腸道菌孵育的條件下烏梅中化學(xué)成分會(huì)發(fā)生生物轉(zhuǎn)化。烏梅粉和水煎劑在正常人工胃液、腸液及人源腸道菌群中孵育的化學(xué)成分及其代謝物質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化見表3，相對(duì)于烏梅粉，烏梅水煎劑中的原型成分消耗較快，相應(yīng)地代謝產(chǎn)物生成速率也較快。相同孵育時(shí)間下，除了0 h的香草酸（C22）、3-羥苯基丙酸（C35）和南燭木樹脂酚（C37）之外，其余化合物在不同孵育時(shí)間，其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化均為烏梅粉高于水煎劑，表E明在不同時(shí)間點(diǎn)，烏梅粉的原型成分和代謝產(chǎn)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于烏梅水煎劑，可能是烏梅水煎劑在煎煮過程中部分成分損失導(dǎo)致的；同時(shí)烏梅粉中化學(xué)成分可在不同孵育時(shí)間逐漸釋放。這與烏梅粉抑制結(jié)腸組織MPO活性較好的結(jié)果吻合。

在健康人腸道菌孵育液中共指認(rèn)17個(gè)相對(duì)含量先增加再降低的化合物，該17個(gè)化合物是烏梅本身存在的化學(xué)成分，在腸道菌孵育后也可由烏梅中其他化學(xué)成分代謝生成，表明胃腸道代謝可以改變?yōu)趺分谢瘜W(xué)成分的組成比例（表3）。根據(jù)烏梅粉和水煎劑中化學(xué)成分的含量變化和已報(bào)道的化合物裂解規(guī)律，烏梅中脂肪酸類的2-甲基檸檬酸（C7）、檸檬酸甲酯（C4）和檸檬酸乙酯（C39）可水解或脫甲基生成檸檬酸（C3），然后可繼續(xù)脫水生成烏頭酸（C2）[17]，或者脫羥基、脫乙?；商O果酸（C1）（圖4），因而C4、C7、C39和C3隨孵育時(shí)間延長含量逐漸降低；C3先在3 h升高后逐漸降低，而C2和C1的相對(duì)含量則都在12 h升高后逐漸降低。羥基肉桂酸類化合物C9、C11、C14、C16、C17、C24、C30、C31、C32、C34、C38、C44中的3-咖啡酰喹酸甲酯、3-阿魏?？鼘幩幔–16、C24）發(fā)生去甲基化為咖啡?？崴酑9、C11、C14，進(jìn)而裂解生成咖啡酸（C17）。C17經(jīng)過一系列的羥基化、氧化、甲基化和還原生成中間體二氫丁香素，進(jìn)而發(fā)生二聚化生成木脂素類的南燭木樹脂酚（C37）。C17還會(huì)發(fā)生重排、脫乙烯基生成3,4-二羥基苯甲酸（C7），氧化生成沒食子酸（C5），然后繼續(xù)甲基化為丁香酸（C27）。C7也可以甲基化生成香草酸（C22）。同時(shí)，C17還會(huì)脫羥基生成對(duì)香豆酸（C31），或者發(fā)生脫羥基和還原反應(yīng)生成為3-羥苯基丙酸（C35）[18]（圖5）。糖苷類的代謝途徑如圖6所示，丁子香苷（C42）可發(fā)生去甲基化、脫氧生成香茅醇-β--葡萄糖苷（C28），然后C28仍繼續(xù)代謝，因而C28相對(duì)含量隨孵育時(shí)間延長呈現(xiàn)先增加再降低的變化趨勢。另據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，孵育液中的糖苷類，例如化合物C33、C36、C41和C23等還會(huì)發(fā)生脫糖基化[19]，生成C43、C45等黃酮苷元以及C8單糖苷，然后C8、C43和C45可繼續(xù)代謝[20-21]，因而在孵育液中含量逐漸降低。此外，推測C42和C20還能分別通過脫甲基、還原、脫丙烯基生成C8。孵育液中還檢測到三萜酸類衍生物科羅索酸（C46）和熊果酸（C47）含量增加，可能是來源于其他三萜酸衍生物的降解。此外，孵育液中乙酰蔗糖酯類對(duì)香豆酰-3--蔗糖酯（C12）和mumeose A（C21）的含量也增加，可能來源于其他乙酰蔗糖酯類的脫乙?；磻?yīng)。綜上，烏梅粉及水煎劑中的化學(xué)成分在人源腸道菌孵育液中會(huì)發(fā)生水解、脫甲基、脫羥基、還原、縮合、氧化、甲基化等代謝類型。

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與烏梅粉低劑量組比較：△P＜0.05；與烏梅粉高劑量組比較：■P＜0.05 ■■P＜0.01

表3 烏梅粉和水煎劑在體外人工胃腸液和人源腸道菌孵育后原型成分和代謝產(chǎn)物的相對(duì)含量(= 3)

Table 3 Relative contents of prototype components and metabolites ofpowder and water decoction after incubation with artificial gastrointestinal fluid and human intestinal bacteria(= 3)

編號(hào)化學(xué)成分類別來源tR/min相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/% 胃液腸液0 h腸道菌3 h腸道菌6 h腸道菌12 h腸道菌24 h腸道菌36 h腸道菌48 h腸道菌 C1蘋果酸原型、代謝產(chǎn)物烏梅粉0.700.170.220.180.070.090.330.210.400.24 烏梅水煎劑0.700.210.280.130.150.270.350.270.250.39 C2烏頭酸原型、代謝產(chǎn)物烏梅粉0.702.982.320.390.320.390.540.460.77— 烏梅水煎劑0.700.830.540.080.100.120.090.07—0.38 C3檸檬酸原型烏梅粉0.936.286.075.352.872.240.40——— 烏梅水煎劑0.937.045.792.11—————— C41,5-檸檬酸二甲酯原型烏梅粉1.291.221.02——————— 烏梅水煎劑1.290.510.47——————— C5沒食子酸原型、代謝產(chǎn)物烏梅粉1.490.020.020.03————0.14— 烏梅水煎劑1.490.010.01——————0.15 C62-檸檬酸甲酯原型烏梅粉2.391.631.450.05—————— 烏梅水煎劑2.390.790.30——————— C73,4-二羥基苯甲酸原型、代謝產(chǎn)物烏梅粉3.120.420.470.150.130.140.150.150.190.10 烏梅水煎劑3.120.140.140.080.090.100.110.100.100.20 C8芐基-β-D-葡萄糖苷原型烏梅粉3.520.010.01——————— 烏梅水煎劑3.520.010.01——————— C93-咖啡?？鼘幩嵩蜑趺贩?.5618.8419.0213.069.614.334.173.603.97— 烏梅水煎劑3.5617.0017.818.041.330.980.500.16—2.61 C10二羥基苯丙酸原型、代謝產(chǎn)物烏梅粉3.630.010.010.140.000.002.164.324.182.15 烏梅水煎劑3.630.000.000.170.320.541.552.102.113.74 C115-咖啡酰奎寧酸原型烏梅粉3.821.921.871.511.421.361.301.130.95— 烏梅水煎劑3.824.915.080.290.210.15———0.63 C12對(duì)香豆酰-3-O-蔗糖酯原型、代謝產(chǎn)物烏梅粉3.755.646.549.089.8811.2212.3313.9112.600.00 烏梅水煎劑3.755.746.525.270.000.000.000.000.0012.19 C13mumefural原型烏梅粉3.830.020.01——————— 烏梅水煎劑3.830.000.01——————— C144-咖啡?？鼘幩嵩蜑趺贩?.878.368.899.075.691.06———— 烏梅水煎劑3.877.567.872.640.17————— C15mumefural異構(gòu)體原型烏梅粉3.940.200.20——————— 烏梅水煎劑3.940.060.10——————— C163-咖啡?？鼘幩峒柞セ?-阿魏?？鼘幩嵩蜑趺贩?.951.011.210.630.28————— 烏梅水煎劑3.951.231.550.25—————— C17咖啡酸原型、代謝產(chǎn)物烏梅粉3.990.440.480.330.140.07——0.10— 烏梅水煎劑3.990.290.310.09—————0.13 C18表兒茶素原型烏梅粉4.000.010.02——————— 烏梅水煎劑4.000.010.01——————— C19苦杏仁苷原型烏梅粉4.040.310.300.140.100.08———— 烏梅水煎劑4.040.310.250.09—————— C203,4,5-三甲氧基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷原型烏梅粉4.040.630.780.560.18————— 烏梅水煎劑4.040.690.860.41—————— C21mumeose A原型、代謝產(chǎn)物烏梅粉4.051.541.681.191.121.441.511.561.710.65 烏梅水煎劑4.053.583.982.431.560.720.760.690.661.77 C22香草酸原型、代謝產(chǎn)物烏梅粉4.06——0.030.090.110.120.110.100.09 烏梅水煎劑4.06——0.050.110.100.110.090.090.12 C23苯甲醇櫻草糖苷原型烏梅粉4.087.957.8110.039.698.145.27——— 烏梅水煎劑4.088.237.876.34—————— C243-咖啡酰喹酸甲酯異構(gòu)體原型烏梅粉4.091.110.900.360.330.250.09——— 烏梅水煎劑4.090.570.30——————— C25芐基-β-D-葡萄糖苷異構(gòu)體原型烏梅粉4.140.140.150.230.20————— 烏梅水煎劑4.140.160.240.22—————— C26苯甲醇櫻草糖苷異構(gòu)體原型烏梅粉4.163.002.992.461.781.381.02——— 烏梅水煎劑4.163.043.110.83——————

續(xù)表3

編號(hào)化學(xué)成分類別來源tR/min相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/% 胃液腸液0 h腸道菌3 h腸道菌6 h腸道菌12 h腸道菌24 h腸道菌36 h腸道菌48 h腸道菌 C27丁香酸原型、代謝產(chǎn)物烏梅粉4.180.040.040.050.05————— 烏梅水煎劑4.180.070.020.05—————— C28香茅醇-β-D-葡萄糖苷原型、代謝產(chǎn)物烏梅粉4.460.370.440.230.180.200.230.230.260.10 烏梅水煎劑4.460.220.320.100.090.090.120.110.110.26 C29野黑櫻苷原型烏梅粉4.471.031.181.010.420.180.07——— 烏梅水煎劑4.471.111.480.60—————— C305-O-咖啡酰莽草酸原型烏梅粉4.484.544.623.351.800.22———— 烏梅水煎劑4.483.452.920.73—————— C314-香豆酸原型烏梅粉4.560.270.300.08—————— 烏梅水煎劑4.560.130.17——————— C324-O-咖啡酰莽草酸原型烏梅粉4.602.562.521.560.96————— 烏梅水煎劑4.601.101.09——————— C33蘆丁原型烏梅粉4.732.812.941.31—————— 烏梅水煎劑4.732.363.07——————— C343-咖啡酰莽草酸原型烏梅粉4.750.02———————— 烏梅水煎劑4.750.010.02——————— C353-羥苯基丙酸原型、代謝產(chǎn)物烏梅粉4.940.100.010.612.213.797.7610.7711.4111.47 烏梅水煎劑4.940.050.001.154.215.779.3310.6110.8010.83 C36槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷原型、代謝產(chǎn)物烏梅粉4.940.400.44——————— 烏梅水煎劑4.940.260.34——————— C37南燭木樹脂酚原型、代謝產(chǎn)物烏梅粉5.300.030.040.040.07————— 烏梅水煎劑5.300.030.080.07——0.100.110.100.11 C383-咖啡酰莽草酸異構(gòu)體原型烏梅粉5.36—0.04——————— 烏梅水煎劑5.36————————— C391,5-檸檬酸二乙酯原型烏梅粉5.5717.8610.080.040.000.000.000.000.000.00 烏梅水煎劑5.5716.251.570.000.000.000.000.000.000.00 C40白藜蘆醇原型烏梅粉6.400.010.01——————— 烏梅水煎劑6.400.010.01——————— C41柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖原型烏梅粉6.770.220.230.05—————— 烏梅水煎劑6.770.050.06——————— C42丁子香苷原型烏梅粉6.800.320.350.04—————— 烏梅水煎劑6.800.160.19——————— C43槲皮素原型、代謝產(chǎn)物烏梅粉7.450.320.380.31—————— 烏梅水煎劑7.450.030.03——————— C44prunose II原型烏梅粉8.280.170.19——————— 烏梅水煎劑8.280.080.10——————— C45山柰酚原型烏梅粉8.970.010.01——————— 烏梅水煎劑8.97————————— C46科羅索酸原型、代謝產(chǎn)物烏梅粉13.230.470.400.640.332.002.360.530.250.27 烏梅水煎劑13.230.060.060.180.190.260.170.150.132.70 C47熊果酸原型、代謝產(chǎn)物烏梅粉14.580.190.150.791.162.892.812.310.660.53 烏梅水煎劑14.580.150.130.270.360.510.350.300.262.77

圖4 烏梅粉和水煎劑中的脂肪酸類在體外人源腸道菌孵育的代謝途徑

圖5 烏梅粉和水煎劑中的多酚類在體外人源腸道菌孵育的代謝途徑

圖6 烏梅粉和水煎劑中的糖苷類在體外人源腸道菌孵育的代謝途徑

3.5 烏梅粉及水煎劑的人源腸道菌孵育液中總糖及SCFAs含量變化

SCFAs不僅是多酚、黃酮等的代謝產(chǎn)物，也是可溶性纖維的代謝產(chǎn)物。烏梅粉和水煎劑在人源腸道菌孵育液中可溶性的總糖以及SCFAs的變化見圖7，空白菌液組的總糖降解率在6 h達(dá)峰，而烏梅水煎劑的總糖降解率約12 h達(dá)峰，烏梅粉的總糖降解率約24 h達(dá)峰。烏梅水煎劑的總糖降解率高于空白菌液組（＜0.01），但是烏梅粉的總糖降解率先低于空白菌液組（＜0.01），而后高于空白菌液組（＜0.01），最終與烏梅水煎劑的總糖降解率持平。烏梅粉在孵育開始總糖降解率低于空白菌液組，可能是烏梅粉一開始對(duì)腸道菌產(chǎn)生部分抑制所致，而最終孵育結(jié)束烏梅粉和水煎劑的總糖降解率高于空白菌液組，推測可能是烏梅中的化學(xué)成分與腸道菌群相互作用有關(guān)。

孵育48 h后，與空白菌液組比較，烏梅粉和水煎劑可增加孵育液中醋酸水平（＜0.01）；烏梅水煎劑可增加丙酸水平，而烏梅粉則相反（＜0.01）。烏梅水煎劑中丁酸、戊酸、異戊酸和己酸水平在孵育達(dá)平衡之后與空白菌液組接近，無顯著性差異，而烏梅粉中丁酸、戊酸、異戊酸和己酸水平在孵育6 h后均低于空白菌液組（＜0.01）。孵育48 h后，與空白菌液組比較，烏梅水煎劑增加孵育液總SCFAs含量（＜0.05），而烏梅粉則減少了總SCFAs含量（＜0.01），原因可能與烏梅粉中不斷溶出的化合物對(duì)腸道菌的抑制有關(guān)。SCFAs可吸收入血，發(fā)揮抗炎作用[22]，這可能是烏梅水煎劑抑制血清中IL-6和NO水平優(yōu)于烏梅粉的原因之一。

與空白菌液組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

4 討論

已有研究表明，中藥治療消化性潰瘍的療效與劑型有關(guān)，健胃愈瘍顆粒劑較健胃愈瘍片溶解快，且直接作用于胃及十二指腸潰瘍面，從而更好發(fā)揮藥效[23]。臨床上也有烏梅粉和水煎劑治療腸炎的相關(guān)報(bào)道[6-7]。但是，烏梅粉和水煎劑對(duì)腸炎的治療效果是否一致尚不清楚。本課題組前期研究表明，烏梅水煎劑和醇提物均可緩解TNBS誘導(dǎo)的CD大鼠癥狀，且烏梅水煎劑在降低血清炎癥因子方面的效果優(yōu)于醇提物[9]。此外，研究發(fā)現(xiàn)果梅提取液在增加幼雞仔胸腺指數(shù)、減少大腸桿菌菌落以及增加乳桿菌的效果優(yōu)于其凍干粉，提示果梅提取液在促進(jìn)健康幼雞仔生長方面優(yōu)于凍干粉[24]?；诖?，推測烏梅不同劑型也可能對(duì)機(jī)體調(diào)節(jié)存在一定差異。因此，本研究采用TNBS誘導(dǎo)CD大鼠模型比較烏梅粉和水煎劑干預(yù)CD的作用差異，并基于體外人源胃腸道代謝探討其差異的物質(zhì)基礎(chǔ)，為烏梅不同劑型的臨床應(yīng)用和開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

本研究結(jié)果表明，烏梅粉和水煎劑中檢測的化學(xué)成分在組成上無明顯差別，均含有檸檬酸、黃酮、多酚類等成分。其中，烏梅中的檸檬酸[25]以及多酚類[26]通常被認(rèn)為是其抗炎活性物質(zhì)。這可能是烏梅粉和水煎劑均能明顯緩解CD大鼠的體質(zhì)量減輕、免疫器官指數(shù)失衡和結(jié)腸潰瘍程度，顯著降低CD大鼠血清中NO、IL-1β、IL-6和IL-17炎癥因子的水平，以及結(jié)腸組織中MPO活性，發(fā)揮干預(yù)CD作用的原因。烏梅粉抑制結(jié)腸組織MPO活性優(yōu)于烏梅水煎劑，但抑制血清中炎癥因子水平低于烏梅水煎劑，推測可能與烏梅不同劑型在胃腸道的代謝和吸收差異有關(guān)。在胃腸道環(huán)境中，由于胃液中存在胃蛋白酶，腸液中存在胰酶，特別是腸道菌可以產(chǎn)生不同功能的代謝酶（包括各種碳水化合物酶、蛋白酶、偶氮還原酶、7-α羥基酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶、硝基還原酶等），可參與不同藥物的代謝過程[27]。烏梅粉具有緩釋的特點(diǎn)，其中的化學(xué)成分逐漸釋放，且相同孵育條件下，化學(xué)成分的相對(duì)含量高于烏梅水煎劑；相較于烏梅粉，發(fā)現(xiàn)體外孵育過程中烏梅水煎劑中的代謝產(chǎn)物SCFAs生成量較多，SCFAs可吸收入血發(fā)揮抗炎作用[22]?？赡苁菫趺贩劢档徒Y(jié)腸組織的MPO活性效果優(yōu)于烏梅水煎劑，而抑制血清中的炎癥因子IL-6和NO水平低于烏梅水煎劑的原因之一。

此外，在比較烏梅粉和水煎劑的腸道菌孵育液中總糖降解率以及代謝產(chǎn)物SCFAs的生成率變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，烏梅水煎劑在孵育的前24 h內(nèi)，總糖降解率高于烏梅粉，且在孵育期間的SCFAs的生成率也高于烏梅粉，這也反映了烏梅粉較水煎劑相比“緩釋”的特點(diǎn)?？偺墙到饴士蓚?cè)面反映菌群結(jié)構(gòu)的變化[28]，烏梅粉和水煎劑的總糖降解率變化不同，表明其不同劑型可能對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用不同。研究表明，梅果中膳食纖維可增加盲腸中產(chǎn)SCFAs菌擬桿菌和cluster IV的占比[29]，而擬桿菌和IV在炎癥性腸病患者中含量降低[30]。適當(dāng)濃度的綠原酸、咖啡酸和蘆丁等多酚類成分也可增加產(chǎn)SCFAs腸道菌如，進(jìn)而增加SCFAs含量；但是當(dāng)多酚濃度較高時(shí)，會(huì)對(duì)產(chǎn)生抑制，減少SCFAs的生成[31]。與腸道菌空白菌液組比較，烏梅水煎劑可以增加腸道菌孵育液中SCFAs含量，而烏梅粉減少了SCFAs的含量。推測烏梅水煎劑總糖降解率及SCFAs生成率較高，可能與其促進(jìn)SCFAs生成菌有關(guān)，或其在煎煮過程中增加了可溶性膳食纖維的比例，進(jìn)而增加產(chǎn)SCFAs菌的比例，增加SCFAs的生成。而烏梅粉中具有抗菌活性的有機(jī)酸[25]（如檸檬酸、蘋果酸、2-甲基檸檬酸等）以及多酚類[31]（如咖啡?？鼘幩?、對(duì)香豆酸、蘆丁等）的含量較高，使菌群受到抑制，可能是其SCFAs的生成率降低的原因之一。烏梅粉和水煎劑對(duì)腸道菌群的影響有待進(jìn)一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Evaluation of therapeutic effects ofpowder and water decoction on Crohn’s rats based onhuman gastrointestinal metabolism

LIU Zhi-hua, PENG Ying, SUN Chong-zhi, LI Xiao-bo

School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China

To evaluate the effect of powder or water decoction of Wumei () on peptic ulcer.A rat model of Crohn’s disease (CD) induced by 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) was used to compare the anti-inflammatory activities of powder or water decoction of. Ultra-high performance liquid chromatography-electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTOF-MSE) method was used to detect the chemical components, phenol-sulfuric acid method was used to detect the total sugar content, and gas chromatography-mass spectrometry method was used to determine the short-chain fatty acids (SCFAs) in thegastrointestinal incubation ofpowder and water decoction before incubation and at different incubation times to reveal their possible active components.Compared with control group, CD rats had significantly lower body weight (< 0.01), enlarged spleen (< 0.01), atrophied thymus (< 0.05), shortened colon and were associated with colon damage and ulcers (< 0.01). Compared with model group, both powder and water decoction ofhad the effect of relieving colon damage (< 0.05, 0.01).powder had a better inhibitory effect on colon myeloperoxidase (MPO) activity of CD rats (< 0.05), whilewater decoction could reduce the serum levels of inflammatory factors interleukin-6 (IL-6) and nitric oxide (NO) in CD rats (< 0.01).powder could increase the content of chemical components and their metabolites and extend the retention time in the incubation solution of intestinal bacteria.powder decreased the degradation rate of total sugar, whilewater decoction increased the degradation rate of total sugar comparing with the control intestinal bacterial solution at 0—12 h.water decoction could increase the content of SCFAs in the incubation solution of intestinal bacteria, whilepowder was on the contrary.powder might have better anti-CD effect on colon MPO, whilewater decoction might be more conducive to reduce the level of circulating inflammatory factors IL-6 and NO. The difference in efficacy might be caused by the higher content of active ingredients inpowder, however,powder may cause certain damage to the intestinal flora structure, resulting in decreased levels of SCFAs with anti-inflammatory activity in gastrointestinal tract and blood circulation.

; powder; water decoction; Crohn’s disease; gastrointestinal metabolism; UPLC-QTOF-MSE; short-chain fatty acids

R285.5

A

0253 - 2670(2022)19 - 6054 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.012

2022-05-13

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFC1707300）

劉治華，女，博士研究生，從事生藥學(xué)研究。Tel: (021)34205222 E-mail: liuzhihua-apple@sjtu.edu.cn

李曉波，女，博士，教授，從事生藥學(xué)研究。Tel: (021)34204806 E-mail: xbli@sjtu.edu.cn

#共同第一作者：彭 穎，女，博士，助理研究員，從事生藥學(xué)研究。Tel: (021)34205222 E-mail: ypeng@sjtu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]