林 源 ，譚 磊，何世成，唐小明，王衛(wèi)國，王昌建

（1.湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南 長沙 410014；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長沙 410128）

豬偽狂犬病病毒（pseudorabies virus, PRV）屬于皰疹病毒科成員，該病原宿主范圍廣泛，可感染多種哺乳動(dòng)物（包括家畜和野生動(dòng)物），并導(dǎo)致偽狂犬病（pseudorabies, PR）。PR主要以發(fā)熱、腦炎或奇癢等臨床癥狀為特征，不同動(dòng)物感染PR后所表現(xiàn)的臨床癥狀差異較大[1]。其中毛皮動(dòng)物（如牛、羊、兔和狐貍等）以瘙癢、神經(jīng)癥狀等為主，且死亡率高達(dá)100%；但豬感染不會(huì)出現(xiàn)瘙癢，可出現(xiàn)腦炎、腹瀉和發(fā)熱等，且死亡率相對(duì)較低。豬（包括家豬和野豬）是PRV的自然宿主，在自然環(huán)境下豬群感染PR的主要途徑是通過口鼻直接或間接接觸病原而感染。不同日齡豬群感染該病后表現(xiàn)的臨床癥狀差異較大，2周齡內(nèi)的新生仔豬表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀、腹瀉等，且死亡率較高；肥育豬感染后僅出現(xiàn)輕微的呼吸道癥狀及食欲不振等；妊娠母豬則出現(xiàn)嚴(yán)重的繁殖障礙疾病[2]。

得益于PRV-gE基因缺失疫苗（如Bartha株），我國的PR流行情況得到有效的抑制，甚至部分地區(qū)豬場將PR進(jìn)行了成功凈化。2011年末，我國河南地區(qū)部分已免疫PRV疫苗的豬場仍然暴發(fā)了PR，其后該病以河南地區(qū)為中心，在我國各省市豬場廣泛報(bào)道。研究人員對(duì)致病原進(jìn)行分離鑒定后，發(fā)現(xiàn)其病原特征與PRV相同，且進(jìn)一步進(jìn)行基因序列特征性分析發(fā)現(xiàn)此類毒株的某些基因（gB、gE和gD等）與PRV傳統(tǒng)株（如Ea和Fa株）、PRV疫苗株（如Bartha株）對(duì)應(yīng)基因序列有很大的差異，如連續(xù)氨基酸序列缺失或插入、單個(gè)氨基酸突變等，部分變異區(qū)域處于病原的抗原區(qū)域，故研究人員又將新發(fā)的PRV毒株稱為PRV變異株[3]。

隨著PR在我國各地區(qū)豬場的廣泛流行，導(dǎo)致PRV接觸其它哺乳動(dòng)物的幾率提高，特別是一些偏遠(yuǎn)地區(qū)農(nóng)戶將豬和其它PRV易感動(dòng)物（如牛、羊和狗）混養(yǎng)，這導(dǎo)致其它動(dòng)物感染PR的幾率提高。此外，也有越來越多食肉動(dòng)物食用感染PRV的豬肉或豬內(nèi)臟而感染PR的案例被報(bào)道，且這些報(bào)道在山東、河南等地區(qū)較為常見。此外，近年來PRV可感染人這一事實(shí)也逐漸引起國內(nèi)外專家學(xué)者的廣泛關(guān)注[3]。

1 我國PRV血清學(xué)流行情況

自2011年以來，國內(nèi)學(xué)者進(jìn)行了大量的工作以監(jiān)測PRV血清學(xué)流行情況，但不同地區(qū)數(shù)據(jù)質(zhì)量差異較大。湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)Tan等曾對(duì)2011—2019年期間全國各地區(qū)豬PRV-gE抗體檢測結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，全國共29個(gè)省市開展過PRV野毒血清學(xué)調(diào)查研究，其調(diào)查數(shù)據(jù)共包括256 326份血清樣本，其中76 553份樣品檢測為PRV-gE抗體陽性，平均陽性率近30%（29.87%），其中9個(gè)省市被調(diào)查樣品PRV-gE抗體陽性率超過30%[2]。楊漢春等曾于2016—2018年對(duì)我國規(guī)?；i場偽狂犬病病毒血清學(xué)感染情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2016—2018年被調(diào)查地區(qū)PRV-gE抗體場陽性率分別為80.93%、81.92%和75.75%，樣品陽性率分別為36.03%、34.52%和32.45%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)樣品陽性率存在很大差異，以2018年為例，黑龍江、天津、湖南和內(nèi)蒙古等地區(qū)陽性率較低，但北京、安徽和遼寧等地區(qū)陽性率則較高。此外，PRV野毒感染與豬群生產(chǎn)模式、種公豬是否感染等具有一定關(guān)系[4]；王昌建等調(diào)查結(jié)果表明，2018年湖南省規(guī)?；i場PRV-gE場陽性率為38.9%，樣品陽性率為21.0%，其中不同規(guī)?；i場中以母豬存欄量高于1 000頭的豬場PRV-gE陽性率最高（22.9%），且夏季豬群PRV-gE抗體陽性率最高（25.1%）[5]；Zheng等調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2018—2019年河南省被調(diào)查豬群血清PRV-gE抗體陽性率為30.14%（1 419/4 708），其中不同發(fā)育階段豬群中以肥育豬陽性率最高[6]。

2 我國PRV分子流行病學(xué)情況

為確切知曉PRV在豬群的分子生物學(xué)流行情況，很多研究人員針對(duì)PRV的特定基因（如gE、gD和gC等）設(shè)計(jì)相應(yīng)的病原診斷方法（如PRV、realtime PCR法等）對(duì)PRV核酸進(jìn)行檢測。誠然，由于PRV核酸檢測過程相對(duì)復(fù)雜，且檢測過程需要專業(yè)的儀器和工作人員，這導(dǎo)致PRV的分子流行病學(xué)研究相對(duì)血清學(xué)研究較少。湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)Tan等曾對(duì)2011—2019年國內(nèi)發(fā)病豬群PRV分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，27個(gè)具有代表性的研究報(bào)告中采集了16 256份組織樣品用于PRV核酸檢測，其中有4 742份（約8.0%比例）樣品為陽性[2]。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)Sun等[7]在2012—2017年對(duì)我國27個(gè)省市送檢病料進(jìn)行PRV核酸檢測，調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)16 256份組織樣品中有1 345份樣品為陽性，其平均陽性率為8.27%，且2012—2017年被檢樣品PRV核酸陽性率分別為11.92%、12.19%、6.70%、11.10%、5.57%和6.90%；不同地區(qū)中以山東、江蘇、福建等東部省份檢出率相對(duì)較高（平均檢出率為11.60%），而北部省份（如青海、新疆和甘肅等）檢出率相對(duì)較低，平均陽性率為6.97%。汪一平等[8]對(duì)豫西地區(qū)采集的臨床病料進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，2016—2020年該地區(qū)PRV病原檢出率為13.82%（21/152），其中以2017年和2018年檢出率相對(duì)較高，分別為20.69%和19.05%。周莉媛等于2019—2020年對(duì)四川省11個(gè)地區(qū)送檢病料進(jìn)行PRV核酸檢測發(fā)現(xiàn)，466份病料中有51份為陽性，平均陽性率為10.94%，且不同發(fā)育階段豬群陽性率存在較大差異，其中肥育豬、保育豬、妊娠母豬陽性率均超過11%，分別為17.96%、11.26%和13.41%；哺乳仔豬、種公豬陽性率較低，分別為4.76%和2.63%[9]。從以上調(diào)查數(shù)據(jù)來看，我國豬群送檢病料中PRV核酸平均檢測陽性率為10%左右，雖然在地區(qū)上有很大的差異，但病原檢出率始終低于基于PRV-gE的血清學(xué)檢出率。這是由于豬群感染PRV后可終生帶毒，這導(dǎo)致豬群體內(nèi)PRV-gE抗體可長時(shí)間保持陽性；且PRV在潛伏感染時(shí)可存在于三叉神經(jīng)節(jié)和扁桃體，這時(shí)豬群既不會(huì)發(fā)病，也不會(huì)排毒，病原學(xué)監(jiān)測過程中不容易檢測到PRV核酸的存在。

3 PRV基因組多樣性

PRV屬于DNA病毒，其基因組較為穩(wěn)定，雖然PRV廣泛流行于世界各地，但其僅存在一種血清型，盡管不同毒株的毒力或致病力存在很大的差異。根據(jù)PRV基因組（如gC基因）特征，可將全世界流行的PRV毒株分為2個(gè)基因型，分別為genotype Ⅰ和genotype Ⅱ型，其中大部分國外（如歐洲、美國等地區(qū)）流行PRV毒株屬于genotype Ⅰ型，而大部分國內(nèi)和亞洲部分地區(qū)（如日本）流行PRV毒株屬于genotype Ⅱ型。此外，當(dāng)前國內(nèi)流行的毒株中存在genotype Ⅰ、genotype Ⅱ型，且genotype Ⅲ毒株可再次分為genotype Ⅱ-A和genotype Ⅱ-B亞型，其中，國內(nèi)2011年以前流行的PRV毒株主要屬于genotypeⅡ-A，而2011年以后流行的毒株則主要屬于genotypeⅡ-B型。此外，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院Su等比較了國內(nèi)流行PRV變異株、傳統(tǒng)株和疫苗株之間的氨基酸序列遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)變異株（Qihe547毒株）與國內(nèi)流行變異株、傳統(tǒng)株和疫苗株氨基酸序列同源性分別為99.54%、98.84%和95.06%，其中在某些基因序列中變異株與疫苗株存在很多的氨基酸差異，其中包括有氨基酸插入或缺失。以gC基因?yàn)槔?，與國外genotype Ⅰ基因型流行株相比，國內(nèi)變異株和傳統(tǒng)株氨基酸序列中第63～69位均存在7個(gè)氨基酸連續(xù)插入（63AAASTPA69）。

此外，雖然DNA病毒基因組較為穩(wěn)定，但大量不同基因型的PRV毒株流行也容易導(dǎo)致PRV重組毒株的出現(xiàn)（雖然重組可能性較低）。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)Zhia等對(duì)我國2017—2019年流行的PRV毒株部分序列進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，2株來自于福建地區(qū)的毒株（FJ-W2和FJ-ZXF）gD和gE基因序列與國內(nèi)流行的變異株（genotype-Ⅱb）同源性最高，但其gB基因卻與國外流行的疫苗株（genotype Ⅰ）在進(jìn)化樹上位于同一分支，提示這兩個(gè)毒株在不同基因型之間發(fā)生了重組。此類報(bào)道還有很多，其中中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所Liu等研究發(fā)現(xiàn)，基于MCC法構(gòu)建的PRV基因組全長的系統(tǒng)進(jìn)化樹HLJ-2013毒株位于genotype Ⅰ和genotype Ⅱ之間，其分支雖然也是在genotype Ⅱ之中，但與genotype Ⅱ其它毒株（如傳統(tǒng)株Ea和變異株HN1201）均不在一個(gè)分支上；且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該毒株基因組多區(qū)域出現(xiàn)重組，其UL27和UL36基因位于兩種基因型毒株之間，UL17和UL37基因位于genotype Ⅰ基因型，但US4和US6基因則與genotype Ⅱ毒株中傳統(tǒng)株相距最近。雖然當(dāng)前已經(jīng)有很多PRV重組毒株被鑒定出來，但與PRV變異株或疫苗株相比，這些重組毒株的毒力和致病性是否發(fā)生了變化還有待進(jìn)一步的研究探索。

4 PRV實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)研究進(jìn)展

4.1 血清學(xué)診斷技術(shù)

血清學(xué)檢測技術(shù)是基于抗原與抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，同時(shí)結(jié)合相應(yīng)的可視化檢測方法。動(dòng)物感染病原后可針對(duì)病原結(jié)構(gòu)蛋白而產(chǎn)生特異性的抗體，且這些特異性抗體存在于血清中。因此，研究人員可通過靜脈采集血液，其后分離血清，應(yīng)用血清學(xué)診斷技術(shù)對(duì)特定病原抗體進(jìn)行檢測。

針對(duì)PRV的血清學(xué)診斷技術(shù)較為特殊，PRV基因組龐大，可編碼多種蛋白，其中部分基因（如TK）僅與病毒毒力相關(guān)，而與病毒的免疫原性無關(guān)。目前絕大部分PRV疫苗是gE基因或多基因缺失疫苗，豬群免疫接種此類疫苗后可產(chǎn)生針對(duì)PRV的中和抗體，但不會(huì)產(chǎn)生gE蛋白抗體，而野毒感染后的豬群可產(chǎn)生gE蛋白抗體，因此靶向gE抗體設(shè)計(jì)的血清學(xué)檢測方法可區(qū)分野毒感染和疫苗接種豬群。目前很多企業(yè)或科研單位開發(fā)了系列針對(duì)PRV的血清學(xué)診斷技術(shù)，根據(jù)原理主要可分為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、間接免疫熒光技術(shù)（IFA）和血清中和試驗(yàn)（IHA）等。

4.1.1 ELISA檢測技術(shù) ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）檢測技術(shù)是OIE（世界動(dòng)物衛(wèi)生組織）推薦首選的血清學(xué)診斷方法，其具有很高的簡便性和敏感性，適合大量樣品的快速檢測，因此，ELISA是目前實(shí)驗(yàn)室診斷血清抗體最常用的一種檢測方法。目前，美國愛德士（IDEXX）公司生產(chǎn)的PRV-gE和gB抗體ELISA檢測試劑盒是同類產(chǎn)品中最為權(quán)威的，該公司于20世紀(jì)80年代就已開發(fā)了此類ELISA試劑盒，并于1988年成為美國官方首個(gè)批準(zhǔn)的PRV鑒別診斷試劑盒，在美國PR凈化項(xiàng)目中發(fā)揮了重要作用。但為降低檢測成本，國內(nèi)部分單位自主研發(fā)了PRV鑒別診斷試劑盒，部分產(chǎn)品的敏感性和特異性與IDEXX公司產(chǎn)品相比不相上下。

4.1.2 間接免疫熒光技術(shù) IFA（間接免疫熒光技術(shù)）是一種實(shí)驗(yàn)室用于診斷特定病原的方法，其原理是抗原與抗體的特異性結(jié)合，但最終觀察結(jié)果需要借助熒光顯微鏡。其基本步驟是將已知抗體與病原充分結(jié)合，其后用洗滌液將未結(jié)合抗體洗去，然后用熒光標(biāo)記的抗抗體（抗IgG或IgM抗體）與抗體結(jié)合，如果已知抗體與病原發(fā)生特異性結(jié)合，則在顯微鏡下可觀察到熒光，若未結(jié)合則觀察不到熒光。因此，該方法可用于病原的檢測，且該方法也可以檢測病原在特定組織或細(xì)胞中的分布情況，具有高特異性和靈敏性。

4.1.3 血清中和試驗(yàn) IHA（血清中和試驗(yàn)）被視為血清學(xué)診斷技術(shù)中的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其原理是具有感染性的病原與中和抗體結(jié)合后失去感染力，通過倍比稀釋血清抗體，最后計(jì)算可中和病原的最低血清稀釋度，以此確定血清中是否存在特定病原的抗體及其中和能力。因此，該方法也是判定豬群免疫接種疫苗后對(duì)野毒抵抗力最準(zhǔn)確的方法。對(duì)于PRV的IHA血清學(xué)診斷而言，可將具有感染性的特定病毒載量與血清在室溫反應(yīng)2 h后，將上清液接種于單層的PRV易感細(xì)胞（如豬腎上皮細(xì)胞，PK15），其后觀察細(xì)胞是否會(huì)出現(xiàn)病變。如果細(xì)胞沒有出現(xiàn)病變，則表明血清中存在PRV的中和抗體，如果有細(xì)胞病變，則代表血清中不存在針對(duì)PRV的中和抗體。但是，該技術(shù)不適用于區(qū)分PRV野毒感染或疫苗接種豬群，只能用于判斷豬群是否產(chǎn)生針對(duì)病原的特異性中和抗體。

4.2 病原診斷技術(shù)進(jìn)展

針對(duì)PRV-gE抗體的血清學(xué)診斷技術(shù)可用于快速區(qū)分野毒和疫苗毒株感染的豬群，但為進(jìn)一步提升檢測技術(shù)的多樣性，越來越多針對(duì)PRV核酸的檢測技術(shù)被研發(fā)出來，這些核酸檢測技術(shù)都是在體外通過各種方法將特定核酸片段以指數(shù)式擴(kuò)增后，借助不同的方法判定目的片段是否存在。其中最具有代表性的檢測方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測技術(shù)等。

4.2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）方法具有操作簡單、快速等特點(diǎn)，同時(shí)也具備很高的敏感性和特異性，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原的核酸檢測。對(duì)于PRV的核酸檢測也是得益于PRV-gE基因缺失疫苗的使用，針對(duì)PRV-gE基因研發(fā)的核酸檢測技術(shù)可區(qū)分疫苗感染和野毒感染。范克偉等[10]基于PCR法建立鑒別野毒感染的雙重PCR核酸診斷方法，該方法可同時(shí)擴(kuò)增PRV-gE（400 bp）和PRV-gB（582 bp），其檢測敏感度可達(dá)10 pg/μL。由于當(dāng)前生豬養(yǎng)殖過程中多種病原混合感染現(xiàn)象十分常見，因此也有研究人員基于PCR法開發(fā)了多種病毒同時(shí)檢測的多重PCR方法。貴州大學(xué)Liu等針對(duì)6種常見病原（PRV、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬乙腦病毒）建立了多重PCR診斷方法，該技術(shù)對(duì)以上病原核酸的靈敏度分別為6.6 pg、96.0 pg、12.9 pg、10.5 pg、51 pg和46 pg，十分適合單個(gè)樣品多種病毒的同時(shí)檢測，極大地節(jié)省了時(shí)間和成本[11]。

4.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù) 隨著科研人員和養(yǎng)殖企業(yè)對(duì)病原診斷的便捷性和靈敏性要求越來越高，近年來越來越多檢測中心或科研單位采用real-time PCR技術(shù)對(duì)病原進(jìn)行檢測，其檢測原理與PCR類似，但較PCR技術(shù)的靈敏度和便捷性更高，因?yàn)樵摷夹g(shù)不需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，且可以通過計(jì)算機(jī)分析樣品Ct值來初步判斷樣品中載毒量情況，這可以減少樣品檢測過程中的污染情況。當(dāng)前絕大部分企業(yè)或單位都普遍采用商業(yè)化的real-time PCR試劑盒對(duì)PRV病原進(jìn)行檢測，當(dāng)然也有部分院所自己研發(fā)相應(yīng)的檢測方法，且檢測效果較為理想。侯月娥等基于PRV-gE基因建立了一種可用于檢測PRV野毒的TaqMan熒光定量PCR方法，該方法對(duì)PRV野毒檢測靈敏極限為100 copies/μL，是普通PCR法的100倍，該方法可用于檢測野毒感染及PRV弱毒疫苗中是否存在野毒污染[12]。與多重PCR類似，也有研究人員建立了可同時(shí)檢測PRV和其它病毒的多重real-time PCR檢測方法，Tian 等曾建立可同時(shí)檢測PRV野毒和PCV3的real-time PCR方法，該方法對(duì)以上兩種病原的靈敏度極限分別為37.8 copies/μL和30.6 copies/μL，且同時(shí)檢測兩種病毒，則檢測極限為60 copies/μL[13]。

4.2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測技術(shù) LAMP屬于一種新型的核酸體外擴(kuò)增檢測技術(shù)，該方法的運(yùn)行原理是恒溫條件下（65 ℃左右）利用一對(duì)內(nèi)外引物和Bst DNA聚合酶與模板形成啞鈴狀DNA，并以其為模板不斷進(jìn)行復(fù)制，該技術(shù)檢測成本較低，操作方便，當(dāng)前已廣泛應(yīng)用于多種病原的核酸檢測。鄭書軒等應(yīng)用LAMP建立了一種PRV野毒的快速檢測技術(shù)，該方法僅需1 h在65 ℃恒溫條件下便可以對(duì)病原進(jìn)行檢測，且其靈敏度為1.0 copy/μL，較常規(guī)PCR技術(shù)更為敏感，且經(jīng)過染色后可直接眼觀觀察結(jié)果[14]。然而，LAMP技術(shù)引物設(shè)計(jì)難度較大，檢測靈敏度太高，在檢測過程中容易出現(xiàn)假陽性問題。

對(duì)PRV核酸檢測的技術(shù)遠(yuǎn)不止real-time PCR、PCR和LAMP這些方法，還有類似重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）、微滴式數(shù)字PCR法（ddPCR）等，且這些方法均表現(xiàn)出十分優(yōu)秀的敏感性和特異性，但是，檢測體系容易污染、檢測成本高、需要特別的儀器設(shè)備等問題限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。值得注意的是，當(dāng)前可以用二代測序（NGS）技術(shù)檢測未知病原，雖然NGS技術(shù)可全面檢測送檢樣品中所有的病原，且也有研究人員將該技術(shù)應(yīng)用于PRV核酸檢測[15]，但該技術(shù)檢測成本高、耗時(shí)長，應(yīng)用于豬場常規(guī)病原診斷較少，一般是用于科研機(jī)構(gòu)或醫(yī)院等單位。

4.2.4 病原分離結(jié)合其它實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù) 此外，對(duì)于病原診斷也有公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，即為病原分離結(jié)合后續(xù)系列鑒定。由于PRV可感染多種細(xì)胞，且很容易對(duì)病毒進(jìn)行分離，目前已有很多科研機(jī)構(gòu)將該病原分離出來。PRV的分離主要可分為以下幾個(gè)步驟：將疑似或確定PRV感染的病料無菌處理（剪碎、勻漿、離心取上清液后無菌過濾）；其后接種于單層易感細(xì)胞（如PK15細(xì)胞），直至出現(xiàn)明顯病變；最后收取上清液提取基因組DNA用于PCR檢測，或使用IFA或IHA等技術(shù)對(duì)上清液中病原進(jìn)行檢測，或可將病毒富集后用于電鏡觀察病原形態(tài)，根據(jù)病原形態(tài)對(duì)其進(jìn)行初步鑒定。但因病毒分離需要專業(yè)的儀器設(shè)備，檢測時(shí)間長，對(duì)人員的專業(yè)水平要求較高，所以一般不適用于豬場對(duì)疫病的快速診斷。