熊流新，黃志偉，鐘建輝，陸麗苗，梁啟蘭，潘朝勇，李淑英，蘇樂斌(1. 肇慶市第二人民醫(yī)院a. 檢驗科，b. 重癥監(jiān)護室，廣東肇慶 56060；. 肇慶市疾病預防控制中心微生物檢驗科，廣東肇慶 56060)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KP)是臨床上常見的條件致病菌之一，可引起患者肺炎、尿路感染、血流感染等一系列感染性疾病[1]。該菌對多種抗菌藥物有著廣泛的耐藥機制，近幾十年來多重耐藥KP和泛耐藥KP相繼出現(xiàn)，使得在治療醫(yī)院獲得性感染時選擇適當?shù)目咕幬镌絹碓诫y[2-3]。研究表明此類“超級細菌”感染人體后，會引起嚴重的并發(fā)癥，病情嚴重者會引起死亡[4]。而具有泛耐藥表型的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)更是為臨床用藥帶來了巨大的挑戰(zhàn)[5]。近年來，基于全基因組測序(whole gene sequencing, WGS)的分子流行學分析技術已被廣泛應用于病原細菌的遺傳進化、種群遷移和流行分析中[6]，同時在爆發(fā)疫情的調(diào)查、菌株分子特征鑒別、傳播途徑識別等方面均發(fā)揮了重要的作用[7]。因此，本研究基于WGS技術對肺炎患者和外環(huán)境分離的KP進行測序與分析，以探明其分子病原學和流行病學特征，揭示種群發(fā)育進化關系和優(yōu)勢型別的流行趨勢，為本地區(qū)KP分子數(shù)據(jù)庫的建立提供必要數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源和病例信息分析 根據(jù)《中國成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南(2019版)》、《兒童社區(qū)獲得性肺炎指南(2019版)》標準，收集2021年肇慶市第二人民醫(yī)院臨床肺炎患者KP分離株49株和懷疑院感爆發(fā)病例相關的醫(yī)院外環(huán)境KP分離株2株，同時對患者進行流行病學調(diào)查。

1.2試劑與儀器 腸道菌群藥敏試劑A1板(珠海迪爾公司)，QIAamp DNA Mini Kit(德國凱杰公司)。Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司)，全自動飛行質(zhì)譜儀(重慶中元匯吉公司)，NanoDrop1000超微量分光光度計、Qubit DNA-HS(美國賽默飛世爾公司)，Miseq、Nextera XT DNA Libray Preparation Kit(美國因美納公司)。

1.3菌株鑒定及藥敏試驗 所有收集的菌株分離培養(yǎng)后使用Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)和全自動飛行質(zhì)譜儀進行鑒定。使用商品化腸道菌群藥敏試劑A1板測定菌株對23種抗菌藥物的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)，結(jié)果按照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)2021 M100進行折點判斷。生化鑒定和藥敏試驗的質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603。

1.4菌株DNA提取、測序和組裝 菌株基因組的DNA提取采用QIAamp DNA Mini Kit，按說明書操作，使用NanoDrop1000超微量分光光度計測定基因組DNA純度，用Qubit DNA-HS檢測試劑盒進行定量，基因組DNA的平均濃度為135 ng/μL，最終體積為100 μL。提取好的基因組測序在Miseq基因測序儀平臺上完成，構(gòu)建文庫采用Nextera XT DNA Libray Preparation Kit，按說明書操作，獲得的測序reads在CLC Genomics Workbench version 9.5.3新一代測序數(shù)據(jù)分析軟件(德國凱杰公司)平臺上進行質(zhì)控和去除重復reads，并按de novo方式拼接、組裝，獲取contings。

1.5質(zhì)粒、分子血清型的鑒定和多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST) 將菌株全基因組提交至Pathogenwatch(https://pathogen.watch/)[8]進行質(zhì)粒、分子血清型的鑒定，并對KP的7個管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB)進行匹配對比，以獲得株菌的序列型別(sequence type，ST)。

1.6毒力基因和耐藥基因 將菌株全基因組提交至VFBD(http://www.mgc.ac.cn/VFs/)[9]和CARD(https://card.mcmaster.ca/home)[10]，對菌株的基因組進行毒力因子、耐藥基因的鑒定與分析。

1.7全基因組進化分析 使用kSNP 3.0軟件[11]對KP肺炎患者分離株中的優(yōu)勢流行血清型和ST的菌株和全球該型的參考對比菌株構(gòu)建core-SNPs發(fā)育進化樹。首先使用kSNP 3.0的Kchooser工具采用kmer算法，其他參數(shù)默認，對42株菌株的全基因組進行計算，得出k-mer值為k19，再以k19為計算參數(shù)，鑒定出core-SNPs，同時以core-SNPs組成序列，采用最大似然法構(gòu)建進化樹，并分析菌株的進化發(fā)育特征。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0對菌株進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以百分比(%)表示，使用Graphad prism 9.0對整理好的數(shù)據(jù)作統(tǒng)計圖。

2 結(jié)果

2.1流行病學資料分析 49例感染KP的肺炎患者中，87.76%(43/49)的患者有基礎病，89.80%(44/49)的患者年齡大于50歲，好轉(zhuǎn)出院者占95.21%(47/49)。感染來源方面，屬于院內(nèi)感染的患者占61.22%(30/49)，屬于社區(qū)感染的患者占38.78%(19/49)。

2.2藥物敏感性試驗 51株KP中有27株為CRKP，8株產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌，12株其他類型的多重耐藥肺炎克雷伯菌。耐藥譜以氯霉素+萘啶酸+復方磺胺甲噁唑+頭孢噻肟+美羅培南+頭孢他啶+厄他培南+環(huán)丙沙星+阿米卡星+氨芐西林/舒巴坦+四環(huán)素為優(yōu)勢譜型(24株)。有4株KP(ZQKP012、ZQKP033、ZQKP037和ZQKP038)對替加環(huán)素中介，51株KP全部對多黏菌素E敏感。見圖1。

注：耐藥；中介；敏感。圖1 51株KP藥物敏感性試驗耐藥譜熱力圖

2.3質(zhì)粒、分子血清型的鑒定和MLST 共檢出20種質(zhì)粒，分別屬于Col質(zhì)粒家族、incF質(zhì)粒家族、IncH質(zhì)粒家族、IncB質(zhì)粒、IncR質(zhì)粒、IncX質(zhì)粒、IncY質(zhì)粒和pSM22質(zhì)粒。51株KP中incF質(zhì)粒家族的攜帶率最高，為94.11%(48/51)，而且該質(zhì)粒家族檢測的亞型質(zhì)粒也最多(7種)。在這20種質(zhì)粒中，攜帶率最高的質(zhì)粒是IncR和ColRNAⅠ(均為58.82%，30/51)，其次為IncFⅡ(pHN7A8)(攜帶率為52.94%，27/51)，其他質(zhì)粒的攜帶率并不高，在1.96%～15.69%之間(見圖2)。進一步對IncFⅡ(pHN7A8)進行質(zhì)粒多位點序列分型(pMLST)，結(jié)果均為F33：A-：B-型。分子血清型和MLST結(jié)果顯示，共檢測到19種血清型和19個ST，其中主要的優(yōu)勢血清型和ST分別為O2aK64(27株)、ST11(27株)。最小生成樹顯示，19個ST呈多態(tài)性分布，而組成優(yōu)勢ST(ST11)的菌株分離自9個科室，以神經(jīng)外科(12株)和ICU(12株)分離的菌株為主，見圖3。

圖2 51株KP質(zhì)粒攜帶情況

圖3 51株KP MLST最小生成樹

2.4毒力基因和耐藥基因鑒定 51株KP菌株共攜帶61個毒力基因，彼此都攜帶的毒力基因有60個。存在攜帶差異的基因為脲酶基因ureB(有2株菌株攜帶，分別為ZQKP045、ZQKP052)。根據(jù)VFBD上對編碼蛋白的注釋，所有毒力基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物分屬7個功能組，分別為依附功能組(adherence)、抗吞噬功能組(antiphagocytosis)、外排泵功能組(efflux pump)、鐵攝取功能組(iron uptake)、調(diào)節(jié)功能組(regulation)、分泌系統(tǒng)功能組(secretion system)和抗酸功能組(acid resistance)。在51株KP中未檢出黏液表型調(diào)控基因rmpA和大腸桿菌素基因組(colibactin)。耐藥基因的結(jié)果顯示，51株KP共檢出60個耐藥基因，分屬于14個抗菌藥物耐藥性(AMR)基因家族(見圖4A)。在這些耐藥基因中，菌株攜帶最多的基因是屬于對β-內(nèi)酰胺類滲透性降低的一般細菌性孔蛋白基因家族的KlebsiellapneumoniaeOmpK37和OmpA基因(49株攜帶)，而檢測的耐藥基因最多家族則是β-內(nèi)酰胺酶基因家族，有24個耐藥基因(占40%，24/60)(見圖4B)，分屬于10種不同亞型的β-內(nèi)酰胺酶基因家族(blaCTX-M，blaampC，blaOXA，blaLAP，blaKPC，blaLEN，blaSHV，blaSRT，blaTEM，blaOKP)。耐藥表型為CRKP的菌株均全部檢出blaKPC-2基因，同時所有菌株也檢出6種blaCTX-M基因和9種blaSHV基因。

注： A,AMR基因家族的AAC為氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶；ANT為氨基糖苷核苷酸轉(zhuǎn)移酶；CAT為氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶；MPH為大環(huán)內(nèi)酯類磷酸轉(zhuǎn)移酶；APH為氨基糖苷類磷酸轉(zhuǎn)移酶；RND抗生素外排泵為耐藥性結(jié)節(jié)細胞分裂抗生素外排泵；MATE轉(zhuǎn)運蛋白為多藥和有毒化合物擠出轉(zhuǎn)運蛋白；MFS抗生素外排泵為主要促進劑超家族抗生素外排泵。圖中顏色代表耐藥機制。B，汽泡大小表示AMR基因家族包含的基因在全部檢出基因中的占比(%)。圖4 51株KP耐藥基因攜帶情況

2.5基于core-SNPs的菌株發(fā)育進化分析 有26株菌株與我國瀘州、衡陽的分離株在一個進化分支上，親緣關系十分密切，屬于一個克隆體。與北京、成都、巴黎的分離株處于一個大進化節(jié)點上，屬于一個克隆群。見圖5。

圖5 O2aK64-ST11 CRKP與不同地區(qū)來源 O2aK64-ST11 CRKP的core-SNPs系統(tǒng)進化樹

3 討論

KP是常見的條件致病菌，該菌在機體免疫力低下或長期大量使用抗菌藥物導致菌群失調(diào)時，容易引起機會性感染。出現(xiàn)的感染癥狀主要為肺炎、菌血癥、泌尿系統(tǒng)和尿路發(fā)炎等[12]。在本研究中，通過收集感染KP的肺炎患者的臨床資料可知，存在基礎病和中老年人(>50歲)非常容易感染該菌。而從院內(nèi)感染的患者人數(shù)和社區(qū)感染的患者人數(shù)對比表明，感染該菌的肺炎患者主要來自院內(nèi)感染，這于我國其他地區(qū)的感染情況一致[13]。

通過Pathogenwatch分析，肺炎患者的KP菌株中IncF質(zhì)粒家族的質(zhì)粒攜帶率最高，而該質(zhì)粒家族廣泛存在于腸桿菌科中，主要攜帶超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因和碳青霉烯酶基因，這揭示了為何引起肺炎的KP耐藥情況嚴重，且感染者抗菌藥物治療效果不佳的一個重要原因。同時，我們通過對IncFⅡ(pHN7A8)質(zhì)粒進一步進行pMLST發(fā)現(xiàn)，該質(zhì)粒為F33：A-：B-型，是我國FⅡ質(zhì)粒流行傳播的主要型別，可攜帶blaTEM-1(β-內(nèi)酰胺類耐藥基因)、emrE(紅霉素耐藥基因)、aadA2(氨基糖苷類耐藥基因)、dfrA12(甲氧芐啶耐藥性)等耐藥基因[14]。IncR質(zhì)粒主要存在于沙門菌中，能攜帶多種耐藥基因且賦予宿主多個耐藥表型[15]。該質(zhì)粒的高攜帶性現(xiàn)象說明這些質(zhì)粒在該院中已經(jīng)出現(xiàn)跨菌種水平轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，且IncR質(zhì)粒已廣泛存在KP中,并賦予菌株多個耐藥表型。分子血清型和MLST顯示，該院KP肺炎患者分離株已經(jīng)出現(xiàn)了優(yōu)勢流行菌株，為O2aK64-ST11，而該型常見的耐藥表型為耐碳青霉烯類抗菌藥物。而藥敏試驗的結(jié)果也證明該院的優(yōu)勢流行菌株O2aK64-ST11全部為CRKP。

藥敏試驗的結(jié)果結(jié)合毒力、耐藥基因分析發(fā)現(xiàn)，該院肺炎患者檢出的KP耐藥情況嚴重，所有菌株除對多黏菌素E敏感外，對其他抗菌藥物存在不同程度的中介或耐藥。在藥敏試驗中，我們發(fā)現(xiàn)4株KP對替加環(huán)素中介。替加環(huán)素是治療CRKP的最后手段[16]，若出現(xiàn)耐替加環(huán)素的菌株，這會使患者在進行臨床治療時陷入無藥可用的窘境。而在這51株KP中存在優(yōu)勢耐藥譜型，其耐藥表型為CRKP，且擁有該耐藥譜型的CRKP菌株彼此間分子血清型和ST高度一致，為O2aK64-ST11 CRKP。根據(jù)病例臨床質(zhì)料顯示，在感染O2aK64-ST11 CRKP的患者來源分類上，院內(nèi)感染的只比社區(qū)感染的多5例，這就提示O2aK64-ST11 CRKP菌株可能已經(jīng)在院內(nèi)和社區(qū)相互散播。進一步對所有菌株進行耐藥基因分析發(fā)現(xiàn)，本研究的菌株耐藥基因分屬8種抗性機制，與菌株展示的耐藥譜表型特征相符。值得注意的是，51株KP檢出10種不同亞型的β-內(nèi)酰胺酶基因家族的基因，其中又以blaCTX-M基因亞家族和blaSHV基因家族發(fā)現(xiàn)的子基因種類最多，該兩種基因家族的基因主要在IncF質(zhì)粒上，可水解第三代頭孢菌素及單環(huán)β-內(nèi)酰胺類，因此攜帶這兩種基因的KP存在引起院內(nèi)嚴重爆發(fā)感染的風險[17]。而在所有O2aK64-ST11 CRKP菌株中，檢測到的碳青霉烯水解A類β-內(nèi)酰胺酶基因均是blaKPC-2基因，這與我國其他地方CRKP的檢測情況相符[18]。菌株毒力基因的攜帶情況表明，由于該院KP肺炎患者分離株全部缺乏調(diào)控高黏液型莢膜的rmpA基因和大腸菌素基因，因此優(yōu)勢流行型O2aK64-ST11 CRKP菌株的毒力較其他地區(qū)高毒力 ST11-K64型菌株弱[19]。除此之外，還發(fā)現(xiàn)2株菌株(ZQKP017、ZQKP020)攜帶ureB基因，該基因一種重要的定植因子主要存在于螺桿菌中[20]。攜帶該基因的KP定植能力是否會因為該基因的攜帶和表達而提升，這需要后續(xù)進一步研究。

基于core-SNPs的菌株發(fā)育進化樹顯示，27株本地的O2aK64-ST11 CRKP菌株與香港、紐約、荷蘭和西班牙分離的菌株進化距離較遠，不屬于同一個克隆群。而在所有的27株菌株中，親緣關系高度一致，其中26株菌株(包含24株患者分離株和2株外環(huán)境分離株)屬于同一個克隆體，只有ZQKP028與其他26株不在同一進化分支上。根據(jù)MLST的最小生成樹圖顯示，神經(jīng)外科和ICU是該型菌株感染的高風險科室,2株外環(huán)境株分別是來自神經(jīng)外科床墊和ICU護士工作臺，提示該科室的外環(huán)境中已經(jīng)存在該型菌株的污染。進一步分析發(fā)現(xiàn)該院26株O2aK64-ST11 CRKP與2019年3月至5月衡陽院感染事件分離的菌株和2021年2月瀘州分離的菌株親緣高度接近，只是前者分離的菌株毒力較弱，后2個地方的分離株均為高毒力型菌株，但都同屬于1個基因克隆體，提示該克隆體菌株已在全國局部地區(qū)傳播流行。從克隆群的菌株分離地點來看，側(cè)面印證了越來越多的感染O2aK64-ST11 CRKP的病例有在更大的地理范圍內(nèi)成為優(yōu)勢流行株的趨勢[21]。本研究中O2aK64-ST11 CRKP與瀘州和衡陽分離株毒力的差別，揭示出該克隆體的菌株可能在傳播過程中存在毒力缺失的現(xiàn)象，這個需要后期的持續(xù)研究來印證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)該院的KP肺炎患者分離株中存在1種優(yōu)勢流行的強耐藥克隆體菌株(O2aK64-ST11 CRKP)，且該型菌株已經(jīng)出現(xiàn)了在院內(nèi)爆發(fā)和社區(qū)相互散播的趨勢。該O2aK64-ST11 CRKP菌株雖然毒力較弱，但其廣泛的抗菌藥物抵抗能力讓患者感染該型菌株后臨床治療變得非常困難。基于WGS的core-SNPs發(fā)育進化樹分析提示了該型菌株目前在全國局部地區(qū)已傳播流行，并有在更大的地理范圍內(nèi)成為優(yōu)勢流行株的趨勢。