蔡興龍，耿林玉，紀玥玥，賈佳，高碩，周萬青(南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院 . 檢驗科，. 風濕免疫科，南京 210008)

哥倫比亞分枝桿菌(Mycobacteriumcolombiense)屬非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)，為緩慢生長分枝桿菌，是鳥分枝桿菌復合群(M.aviumcomplex，MAC)中新發(fā)現(xiàn)的一個種[1]。該菌可致免疫缺陷患者或免疫功能正?；颊吡馨徒Y炎和皮膚播散性感染[2]。通過常規(guī)的細菌培養(yǎng)、生化反應甚至質(zhì)譜技術，很難對分枝桿菌進行準確鑒定，尤其是一些新發(fā)現(xiàn)的菌種，常需借助分子生物學技術實現(xiàn)菌種水平鑒定。本研究報道1例哥倫比亞分枝桿菌致系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者體表感染案例，通過全基因組測序(whole-genome sequencing，WGS)技術結合平均核苷酸一致性(average nucleotide identity，ANI)分析實現(xiàn)菌種鑒定。

1 材料與方法

1.1患者資料及菌株來源 患者女，52歲，因“間斷發(fā)熱，全身乏力，右膝破潰流膿加重兩月余”于2021年11月18日收住南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院風濕免疫科。患者既往于2009年診斷為系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病和類風濕關節(jié)炎。入院查體：雙手關節(jié)變形，右手食指末端缺如，右腕關節(jié)腫脹，表面可見1 cm×2 cm大小包塊，皮溫稍高，觸之有波動感；右膝關節(jié)上下可見數(shù)處皮膚缺損，周圍紅腫，表面滲液，右膝關節(jié)外側可見一大小約3 cm×4 cm缺損，中間呈黑色結痂，滲液較多，有臭味；右側小腿有2 cm×1 cm破潰，右側大腿內(nèi)側1 cm×1.5 cm破潰。實驗室檢查：WBC 2.90×109/L，Neu 94.8%，CD3+CD4+細胞22×106/L，B淋巴細胞7×106/L，C反應蛋白112.10 mg/L，降鈣素原(PCT)0.81 ng/mL，白細胞介素-6(IL-6)70.21 pg/mL，血糖6.69 mmol/L，糖化血紅蛋白7.6%，結核T細胞γ干擾素陰性，G試驗9.40 pg/mL，GM試驗0.10，巨細胞病毒DNA<500 IU/mL，EB病毒DNA 2.27×104IU/mL。分泌物行革蘭染色、抗酸染色及培養(yǎng)，抗酸染色陽性，培養(yǎng)獲得菌株經(jīng)WGS結合ANI分析鑒定為哥倫比亞分枝桿菌。右膝破潰處清創(chuàng)，碘伏消毒后高錳酸鉀濕敷，隔日換藥。異煙肼(0.6 g，qd)+利福平(0.45 g，tid)+阿奇霉素(0.5 g，qd)+乙胺丁醇(0.75 g，qd)+莫西沙星(0.4 g，qd)抗感染治療。12月13日，患者右膝關節(jié)數(shù)處破潰均無滲出及膿液，疼痛稍好轉(zhuǎn)，后應家屬要求辦理出院。

1.2主要儀器及試劑 CO2培養(yǎng)箱、哥倫比亞血瓊脂平板(Thermo scientific公司)；Vitek MS微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)及配套試劑(法國生物梅里埃公司)；革蘭染色液、抗酸染色液(珠海貝索公司)；磁珠法細菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物公司)；Illumina HiSeq 2000高通量測序系統(tǒng)(美國Illumina公司)。

1.3細菌培養(yǎng) 患者于11月18日和12月7日先后2次采集分泌物，右膝破潰處常規(guī)消毒處理破潰處后，用無菌拭子取深部分泌物送檢；分泌物標本接種哥倫比亞血瓊脂平板置35 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，同時進行涂片制備、革蘭染色與抗酸染色。

1.4質(zhì)譜鑒定 采用Vitek MS(V3.2)進行鑒定。將培養(yǎng)菌落刮取并涂布在靶板上，滴加0.5 μL甲酸，干燥后滴加1 μL基質(zhì)液后行質(zhì)譜鑒定。

1.5WGS及ANI分析 采用磁珠法提取細菌總DNA，參照試劑說明書操作。委托上海生工生物公司使用Illumina HiSeq 2000測序系統(tǒng)進行WGS。提取核酸經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及濃度檢測合格后進入文庫構建，對樣本DNA進行雙向測序(paired-end，PE)構建450 bp文庫；對測序結果進行質(zhì)量剪切后，用SPAdes v3.13.0軟件(https://www.patricbrc.org/app/Assembly2)將序列進行拼接，以得到最優(yōu)化組裝結果。采用RAST tool kit(RASTtk)(https://www.patricbrc.org/app/Annotation)進行基因組注釋。采用ResFinder-4.1 Sever檢索耐藥基因攜帶情況(https://cge.food.dtu.dk/services/ResFinder/)。采用OrthoANI方法(https://www.ezbiocloud.net/tools/ani)進行菌種鑒定[3]。

2 結果

2.1培養(yǎng)及涂片結果 11月18日采集患者腿部分泌物樣本直接涂片行革蘭染色，可見大量革蘭陽性球菌和革蘭陰性桿菌；抗酸染色見抗酸桿菌：3條/300個視野；經(jīng)培養(yǎng)分離鑒定出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。12月7日送檢分泌物直接涂片抗酸染色陽性，革蘭染色未見明確菌體；接種哥倫比亞血瓊脂平板培養(yǎng)至7 d可見無色粗糙扁平小菌落生長(編號MC230)(圖1)，培養(yǎng)物涂片抗酸染色呈陽性(圖2)，革蘭染色不易著色；麥康凱平板不生長，巧克力平板生長。

圖1 哥倫比亞分枝桿菌血平板菌落形態(tài)(培養(yǎng)7 d)

圖2 菌落涂片抗酸染色(×1 000)

2.2質(zhì)譜鑒定 純菌落經(jīng)質(zhì)譜鑒定，未獲得鑒定結果。

2.3WGS、組裝和ANI分析 MC230基因組大小為5 671 138 bp，GC含量為67.93%，總基因數(shù)為5 399個，64條Contigs，N50：307 543 bp，N75：213 155 bp；47個tRNA，5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA各1個；全基因組序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，GenBank號為JALPSB000000000。經(jīng)ResFinder-4.1 Sever檢索分枝桿菌耐藥相關基因結果顯示，MC230基因組存在鏈霉素耐藥相關基因rrsg.462C>T。將MC230菌株全基因組序列進行ANI分析，結果顯示與哥倫比亞分枝桿菌模式菌株CECT 3035的OrthoANI值為98.05%。

3 討論

哥倫比亞分枝桿菌最早于2006年由Murcia等[4]在哥倫比亞波哥大4名艾滋病患者的血液和痰標本中分離并報道，為緩慢生長型。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該菌廣泛分布于水環(huán)境和土壤中，并作為機會性感染病原菌累及患者淋巴結、肺部、皮膚、骨髓等部位[5]。本例患者患有多種自身免疫病及糖尿病，有糖皮質(zhì)激素、多種免疫抑制劑和廣譜抗生素使用史，上述均是感染NTM的高危因素。該患者右下肢出現(xiàn)多處相似的淺表性潰瘍，分泌物標本直接涂片抗酸染色陽性，推測可能發(fā)生了體表接觸性感染或者血流播散性感染。由于感染的經(jīng)久性，難免會混合細菌性感染。本患者首次采樣涂片可見抗酸染色菌體，但培養(yǎng)時因大量銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的生長很難搜尋分枝桿菌的菌落。在外科清創(chuàng)及消毒處理后再次采樣，去除細菌的干擾，并目標性延長培養(yǎng)時間，終獲哥倫比亞分枝桿菌菌落。目前，尚無關于哥倫比亞分枝桿菌的推薦用藥，只能參考MAC的用藥指南，經(jīng)驗性聯(lián)合使用克拉霉素、乙胺丁醇、利福平、異煙肼和阿奇霉素[6-7]。在1例兒童哥倫比亞分枝桿菌引起的皮膚感染患者治療過程中，使用克拉霉素0.5 g/d，利福平0.75 g/d，莫西沙星0.3 g/d，持續(xù)3個月，獲得很好改善[2]，與本病例使用方案相仿。

分枝桿菌的鑒定手段包括涂片抗酸染色、蛋白質(zhì)譜鑒定及分子鑒定。本例患者臨床標本直接涂片抗酸染色呈陽性，提示存在分枝桿菌感染。后續(xù)首先采用質(zhì)譜技術進行菌種鑒定，但未獲得鑒定結果。經(jīng)核實，現(xiàn)使用的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫缺乏哥倫比亞分枝桿菌鑒定譜，可見數(shù)據(jù)庫的完備性影響NTM的準確鑒定[8]。當然，正確的菌落預處理，包括破壁處理環(huán)節(jié)，也是獲得準確鑒定的前提。依靠16S rRNA基因序列分析在分枝桿菌的菌種鑒別上有時無法獲得確切種的信息，時常需增補rpoB或hsp65基因。基于hsp65基因多態(tài)性分析、rpoB基因分析、DNA雜交和分枝桿菌細胞壁成分高效液相色譜法分析均有助于哥倫比亞分枝桿菌與其他MAC相鑒別[5,9]。而基于WGS結合ANI分析可獲得DNA雜交相似的菌種鑒定能力[10-11]。本研究對該分離菌株進行基因組測序發(fā)現(xiàn)，其基因大小、GC含量及所編碼蛋白基因數(shù)量等均與已報道哥倫比亞分枝桿菌相似[12]?；贏NI分析，發(fā)現(xiàn)其與哥倫比亞模式菌株CECT 3035的OrthoANI值為98.05%，高于94%閾值[3]，由此可將MC230菌株鑒定為哥倫比亞分枝桿菌。在免疫抑制劑使用、免疫功能低下或艾滋病人群中遇到淺表皮膚難治性感染時，需考慮NTM和結核分枝桿菌的感染可能。對于NTM的實驗室診斷，可采取臨床標本直接涂片抗酸染色獲得快速病原方向，而確切的菌種信息仍需經(jīng)培養(yǎng)后的蛋白分析或分子生物學手段獲得。