彭利君，劉立賓，王靜，方婷婷，蔡龍(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中心，杭州 310003)

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的結(jié)核病 (tuberculosis，TB)仍然是威脅全球人類(lèi)健康的主要傳染病之一[1]。肺部是臨床最常見(jiàn)的TB發(fā)病部位，早期診斷對(duì)于傳染控制、減緩疾病進(jìn)展及改善患者預(yù)后至關(guān)重要。痰涂片鏡檢經(jīng)濟(jì)、易于操作，但其敏感性較低，且不能區(qū)分MTB和非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)感染。分枝桿菌培養(yǎng)敏感性較高，一直作為T(mén)B的金標(biāo)準(zhǔn)，但其檢測(cè)周期長(zhǎng)，不利于肺結(jié)核的快速診斷。隨著分子診斷技術(shù)的進(jìn)步，核酸擴(kuò)增試驗(yàn)極大地促進(jìn)了TB的診斷。痰是常用于診斷肺結(jié)核的樣本。然而，一些活動(dòng)性肺結(jié)核患者可能無(wú)法咳出痰，這被稱為無(wú)痰或少痰的肺結(jié)核。研究表明，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)較痰標(biāo)本改善了肺結(jié)核的診斷[2-4]。

博奧結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)(DNA-TB)、結(jié)核分枝桿菌RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)(simultaneous amplification and testing forMycobacteriumtuberculosis，SAT-TB)和Xpert MTB/RIF檢測(cè)(Xpert)這3種分子檢測(cè)方法在臨床TB診斷中廣泛運(yùn)用，但這些方法在BALF樣本中的診斷價(jià)值尚未得到全面評(píng)估。因此，本研究以分枝桿菌培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，旨在通過(guò)大樣本量數(shù)據(jù)分析，評(píng)價(jià)DNA-TB、SAT-TB和Xpert 3種分子檢測(cè)方法對(duì)BALF樣本TB的診斷價(jià)值，為臨床醫(yī)生選擇檢測(cè)方法時(shí)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1研究對(duì)象 收集2016年7月至2021年9月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院就診并使用同一份BALF樣本進(jìn)行涂片、培養(yǎng)、DNA-TB、SAT-TB和Xpert 5項(xiàng)檢測(cè)的9 617名門(mén)診和住院患者的醫(yī)療記錄，排除688名診斷不明確的患者，最終共納入8 929名患者，其中5 357名(占60.0%)男性，3 572名(占40.0%)女性，年齡(59.9±19.6)歲。本研究經(jīng)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院人體研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[批準(zhǔn)文件號(hào)：2021快審(42)號(hào)]，免除患者知情同意。

1.2儀器及試劑 抗酸染色試劑(珠海貝索公司)；Bactec MGIT 960液體培養(yǎng)儀及培養(yǎng)和藥敏配套試劑(美國(guó)BD公司)；Xpert實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)儀及配套試劑(美國(guó)Cepheid公司)；實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)儀(SLAN-96S，上海宏石公司)；結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒(RNA恒溫?cái)U(kuò)增法，上海仁度公司)；結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒(PCR熒光探針?lè)?，博奧公司)；Lowenstein-Jensen固體培養(yǎng)基(杭州創(chuàng)新公司)；固體藥敏及配套試劑(珠海貝索公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集和處理 通過(guò)纖維支氣管鏡進(jìn)行異常肺段灌洗以獲得BALF標(biāo)本，將標(biāo)本分成五等份，每份1～3 mL，分別用于涂片、培養(yǎng)、DNA-TB、SAT-TB和Xpert檢測(cè)。

1.3.2涂片 采用抗酸染色試劑對(duì)每份BALF樣本行3張Ziehl-Neelsen抗酸染色鏡檢，其中1張涂片鏡檢陽(yáng)性則為涂片陽(yáng)性。MTB和NTM由于其菌體特性，涂片顯示為抗酸染色陽(yáng)性。

1.3.3培養(yǎng)及利福平的表型藥敏檢測(cè) 按試劑說(shuō)明書(shū)操作，使用Lowenstein-Jensen固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基對(duì)BALF樣本進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)和利福平藥敏試驗(yàn)。固體培養(yǎng)在37 ℃溫箱進(jìn)行，液體培養(yǎng)使用BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)儀。固體培養(yǎng)65 d未長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的菌落判為陰性，液體培養(yǎng)42 d儀器檢測(cè)信號(hào)未達(dá)到陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)且人工復(fù)核陰性則判為陰性。陽(yáng)性培養(yǎng)菌株經(jīng)DNA-TB檢測(cè)鑒定為MTB培養(yǎng)陽(yáng)性，若鑒定為NTM則視為MTB培養(yǎng)陰性。固體或液體培養(yǎng)均陰性視為MTB培養(yǎng)陰性。利福平的表型藥敏檢測(cè)是將從BALF分離得到的MTB菌株在已知利福平濃度的固體或液體培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)狀況，同時(shí)與不加任何藥物的對(duì)照管比較，若菌株在對(duì)照及藥物培養(yǎng)管中均生長(zhǎng)，為利福平耐藥；若只在對(duì)照管中生長(zhǎng)，則認(rèn)為該菌株對(duì)利福平敏感。

1.3.4Xpert MTB/RIF 按試劑說(shuō)明書(shū)操作，在1～2 mL未離心BALF中加入2倍體積的處理液，渦旋振蕩15～30 s并室溫放置15 min，取2 mL處理過(guò)的樣本緩慢添加到Xpert實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)儀反應(yīng)盒中，然后將反應(yīng)盒置于檢測(cè)模塊。2 h后系統(tǒng)可自動(dòng)讀出MTB檢測(cè)結(jié)果與利福平耐藥情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MTB檢出極低、檢出低、檢出中等和檢出高為陽(yáng)性，MTB未檢出為陰性。

1.3.5DNA-TB檢測(cè) 按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，樣品預(yù)處理并提取DNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)MTB特異性多拷貝重復(fù)插入序列IS6110和分枝桿菌屬共有基因hsp65基因。若基因的擴(kuò)增曲線呈S型，且Ct值<40，判定為陽(yáng)性，否則為陰性。hsp65陽(yáng)性IS6110基因陽(yáng)性為MTB陽(yáng)性，hsp65陽(yáng)性IS6110基因陰性為NTM陽(yáng)性。hsp65陰性為MTB和NTM均陰性。

1.3.6SAT-TB檢測(cè) 按照說(shuō)明書(shū)操作。用實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)儀(SLAN-96S)擴(kuò)增MTB的16S rRNA基因，根據(jù)Ct值判斷結(jié)果：Ct≤35為陽(yáng)性；3540為陰性。

1.4數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析 利用Python語(yǔ)言和Pandas包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用wilson計(jì)算兩側(cè)95%置信區(qū)間(CI)。敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(positive predictive value，PPV)、陰性預(yù)測(cè)值(negative predictive value，NPV)使用sklearn包的metrics.confusion_matrix函數(shù)計(jì)算。配對(duì)數(shù)據(jù)(敏感性、特異性)通過(guò)McNemar檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)，使用statsmodels包stats.contingency_tables.mcnemar函數(shù)計(jì)算。PPV和NPV比較采用χ2檢驗(yàn)，使用scipy包stats.chi2_contingency函數(shù)計(jì)算。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。幾種檢測(cè)方法與培養(yǎng)結(jié)果一致性分析采用Kappa檢驗(yàn)，kappa≥0.75說(shuō)明一致性較好，kappa<0.4說(shuō)明一致性較差，0.4≤kappa<0.75說(shuō)明一致性一般，使用sklearn包 metrics.cohen_kappa_score函數(shù)計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1納入數(shù)據(jù)的處理流程和結(jié)果 按圖1流程納入患者資料進(jìn)行分析，在8 929份樣本中，涂片、MTB培養(yǎng)、DNA-TB、SAT-TB和Xpert結(jié)果陽(yáng)性率分別為10.5%(941/8 929)、22.6%(2 019/8 929)、32.5%(2 902/8 929)、27.1%(2 419/8 929)和34.1%(3 048/8 929)。

圖1 參與研究的患者診斷分類(lèi)流程

2.2各方法學(xué)的診斷效能比較 以MTB培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算涂片、DNA-TB、SAT-TB、Xpert的敏感性、特異性、PPV和NPV，并根據(jù)涂片陽(yáng)性和陰性對(duì)樣本分別進(jìn)行計(jì)算和比較，結(jié)果見(jiàn)表1、2。涂片的敏感性和NPV明顯低于3種分子檢測(cè)(P<0.05)，而特異性和PPV明顯高于3種分子檢測(cè)(P<0.05)。一致性分析發(fā)現(xiàn)，涂片與3種分子檢測(cè)方法的一致性均較差(kappa<0.4)。在總體組3種分子檢測(cè)的敏感性范圍為84.3%～90.3%，Xpert最優(yōu);特異性范圍為82.3%～89.6%，SAT-TB最優(yōu)。敏感性和特異性在3種分子檢測(cè)方法兩兩之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PPV范圍為59.8%～70.4%，SAT-TB最優(yōu)。NPV范圍為95.1%～96.7%，Xpert最優(yōu)。PPV和NPV在DNA-TB與Xpert兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余2種檢測(cè)方法之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。根據(jù)涂片結(jié)果進(jìn)行分類(lèi)比較發(fā)現(xiàn)：涂片陽(yáng)性組的3種分子檢測(cè)的敏感性和PPV分別在95.0%和91.0%以上，且檢測(cè)方法之間的一致性均較好(kappa>0.75)；但所有檢測(cè)方法在涂片陰性組的敏感性(77.6%～85.1%)和PPV(48.1%～59.7%)明顯低于涂片陽(yáng)性組。涂片陰性組Xpert的敏感性(85.1%)顯著高于DNA-TB(81.9%)和SAT-TB(77.6%)(P<0.05)，且與DNA-TB和SAT-TB一致性表現(xiàn)均一般(kappa=0.680、0.602)。涂片陰性組DNA-TB的敏感性顯著高于SAT-TB(P<0.05)，且兩者的一致性表現(xiàn)一般(kappa=0.695)。

表2 涂片、DNA-TB、SAT-TB、 Xpert檢測(cè)結(jié)核的診斷效能比較

2.3評(píng)估Xpert檢測(cè)利福平耐藥的診斷效能 表型藥敏結(jié)果顯示，利福平耐藥率為10.4%(165/1 580)。以表型藥敏為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert對(duì)利福平耐藥的診斷敏感性為89.7%,特異性為96.9%,PPV為77.1%,NPV為98.8%。兩者關(guān)于利福平耐藥的一致性分析較好(kappa=0.808)，見(jiàn)表3。

表3 Xpert MTB/RIF和表型藥敏關(guān)于利福平藥敏的一致性

3 討論

DNA-TB是我國(guó)開(kāi)發(fā)的一種結(jié)核DNA分子診斷技術(shù)，可同時(shí)檢測(cè) MTB和NTM感染。SAT-TB是以MTB特異的16S rRNA為靶標(biāo)，可快速準(zhǔn)確地檢測(cè)存活的MTB。Xpert檢測(cè)是一種全自動(dòng)的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，可以在2 h內(nèi)同時(shí)檢測(cè)出MTB和利福平耐藥情況，優(yōu)勢(shì)是操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠，同時(shí)檢測(cè)利福平耐藥情況以指導(dǎo)后續(xù)治療，缺點(diǎn)是成本較高。本研究表明，DNA-TB、SAT-TB、Xpert檢測(cè)在BALF樣本中對(duì)TB的診斷的敏感性分別為88.3%、84.3%、90.3%，明顯高于在痰液樣本中的診斷敏感性[5]，驗(yàn)證了BALF是較痰液更好的肺結(jié)核檢測(cè)樣本。涂片陽(yáng)性組的3種分子檢測(cè)的敏感性和PPV分別在95.0%和91.0%以上，3種檢測(cè)方法之間的較好的一致性(kappa>0.75)。但3種分子檢測(cè)方法在涂片陰性組的敏感性和PPV明顯低于涂片陽(yáng)性組。從本研究結(jié)果來(lái)看，涂片陽(yáng)性率僅為10.5%，剩余89.5%的涂片陰性患者的診斷更加需要重視。Xpert檢測(cè)MTB的敏感性高于DNA-TB和SAT-TB，在涂片陰性組更為明顯(P<0.05)，考慮到患者既然已經(jīng)通過(guò)艱難的支氣管鏡檢查獲得BALF樣本，此時(shí)使用Xpert檢測(cè)的收益更大。

SAT-TB的敏感性無(wú)論在總體組還是涂片陽(yáng)性、涂片陰性組均低于DNA-TB和Xpert，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SAT-TB檢測(cè)的是16S rRNA，RNA在進(jìn)行消化和提取的過(guò)程中更容易發(fā)生降解，這可能是導(dǎo)致本研究SAT-TB敏感性低的主要原因。16S rRNA的檢出可代表存活的MTB，由于本研究以培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，故SAT-TB的PPV大于DNA-TB和Xpert。Xpert應(yīng)用了半巢式熒光定量PCR技術(shù)，最低檢出限低至131 CFU/mL[6]。DNA-TB以結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特有的IS6110為靶基因，該基因?qū)儆诓迦胄蛄屑易?，在基因組可重復(fù)10～25次，提高了檢測(cè)敏感性，但最低的檢出限高于Xpert。在濃度較高的核酸樣本中，2種方法差異不大。這能很好解釋涂片陽(yáng)性組兩者完全無(wú)差異且一致性很好，而在涂片陰性組敏感性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且一致性一般。因?yàn)橥科?yáng)性的樣本的菌量較多，核酸濃度也高。

Xpert利用5個(gè)熒光探針檢測(cè)RNA聚合酶rpoB基因的81 bp耐藥決定區(qū)的突變來(lái)檢測(cè)利福平耐藥[7]。本研究Xpert檢測(cè)的利福平耐藥和表型藥敏的結(jié)果一致性較好(kappa=0.808)，敏感性和特異性分別為89.7%和96.9%，與劉立賓等[7]的研究結(jié)果相一致。引起2種方法利福平藥敏檢測(cè)結(jié)果不一致的原因可能為：存在“有爭(zhēng)議的”rpoB突變或rpoB基因發(fā)生沉默突變，這些突變并不會(huì)導(dǎo)致表型耐藥或由rpoB核心區(qū)之外區(qū)域其他基因發(fā)生突變導(dǎo)致出現(xiàn)表型耐藥[8-9]。此外，Xpert在檢測(cè)細(xì)菌載量非常低的標(biāo)本中，高比率的E探針雜交失敗也會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果[10]。然而，由于本研究屬于回顧性研究，無(wú)法通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究分析了大量BALF樣本的檢測(cè)結(jié)果，減少了標(biāo)本的異質(zhì)性，增加了結(jié)果的可靠性。但本研究對(duì)研究結(jié)果的概括方面存在一些局限性。首先，這是一項(xiàng)回顧性研究，患者選擇可能存在偏差。其次，由于本研究模型是以培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各種方法學(xué)的診斷性能，存在有的樣本培養(yǎng)陰性而將其判定為結(jié)核陰性，但是經(jīng)過(guò)分子診斷檢出陽(yáng)性的情況,導(dǎo)致本研究的3種分子診斷方法的特異性和PPV被低估，選擇臨床診斷作為金標(biāo)準(zhǔn)較培養(yǎng)可能更為合理。

在BALF樣本中3種分子檢測(cè)方法對(duì)結(jié)核病的診斷敏感性均優(yōu)于涂片。與DNA-TB和SAT-TB檢測(cè)相比，Xpert檢測(cè)BALF樣本具有高敏感性、周轉(zhuǎn)時(shí)間短、能同時(shí)檢測(cè)利福平耐藥情況、操作簡(jiǎn)單、對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求低等優(yōu)點(diǎn)。尤其是在涂片陰性的BALF樣本中采用Xpert 檢測(cè)對(duì)無(wú)痰、少痰或乏菌結(jié)核患者更有價(jià)值，在臨床值得推廣。