陳盈泰 吳昊 張森 李文放 王慮

膿毒癥是臨床急危重癥患者的常見病死原因[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥的病理生理進(jìn)程中，胃腸道發(fā)揮著重要作用。在嚴(yán)重感染情況下，致病因素造成腸黏膜屏障損害，可以使腸道微生物和內(nèi)毒素遷移到腸系膜淋巴結(jié)、血液以及某些腸外臟器，發(fā)生腸源性膿毒癥[2]。腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)和功能的維持主要依賴腸黏膜微循環(huán)及微血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。血管結(jié)構(gòu)的維持有賴于血管內(nèi)皮細(xì)胞，起到分隔組織和血液的作用，防止血液里的蛋白和細(xì)胞透入血管壁[3]。血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活和增殖有賴于血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），是開啟和形成新生血管過程中的重要分子。神經(jīng)遷移因子Slit 及其受體Robo 蛋白屬于分泌蛋白家族。研究發(fā)現(xiàn)，亞型Slit2 蛋白有促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移及體外血管生成的作用，Robo4 具有血管表達(dá)特異性，在血管新生活躍區(qū)域附近的血管內(nèi)皮細(xì)胞上高表達(dá)，因此Slit2/Robo4 信號在血管新生及內(nèi)皮細(xì)胞遷移過程中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，slit2/Robo4可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、成管，增加內(nèi)皮細(xì)胞完整性，增強(qiáng)血管穩(wěn)定性，減少血管通透性，從而使腸黏膜屏障得到保護(hù)[4]。本研究通過Slit2/Robo4 蛋白在膿毒癥模型大鼠腸黏膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)及其與血管內(nèi)皮生長因子的關(guān)系，探討其維護(hù)腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能和保護(hù)腸黏膜屏障的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

清潔級成年健康雄性SD 大鼠16 只，體質(zhì)量230～250 g，由海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供（動物許可證號：Sc2k 滬2020-016）。隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=8）、膿毒癥組（n=8），膿毒癥組模型制備采用盲腸末端結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）法。制模前大鼠先予12 h 的禁食，不禁水。腹腔麻醉使用1%戊巴比妥溶液（30 mg/kg）。大鼠予放置仰臥位，在腹部手術(shù)部位備皮。等麻醉藥物起效后，取下腹部正中切口，切開約1 cm，逐層分離直至進(jìn)入腹腔，整個手術(shù)過程嚴(yán)格遵循無菌原則。找到并確認(rèn)盲腸后，細(xì)致游離盲腸腸系膜，使用鑷子將腸內(nèi)容物推向盲腸遠(yuǎn)端，使用手術(shù)絲線游離盲腸總長度的50%左右，隨后予以結(jié)扎。在已結(jié)扎的盲腸的游離端用針頭對穿一次，同時擠出少量腸內(nèi)容物。假手術(shù)組不進(jìn)行盲腸結(jié)腸及穿孔操作，余操作方法同膿毒癥組。24 h 后處死大鼠，用4%多聚甲醛固定實(shí)驗(yàn)用回腸末端組織約5 cm。

1.2 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.2.1 Slit2/Robo4、VEGF mRNA表達(dá)量檢測 采用聚合酶聯(lián)反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的方法，首先進(jìn)行DEPC水（DEPC處理水，基爾頓生物R1600）配置：在1 000 mL的ddH2O中加入1 mL DEPC原液，磁力攪拌器攪拌過夜。高壓滅菌備用。隨后進(jìn)行總RNA提取，將大鼠腸組織放入1 mL的Trizol勻漿管中勻漿（電動勻漿機(jī)FLUKO PRO200）20 s，隨后溫育5 min，離心10 min，靜止后吸取上清液，在上清液中加入600 μL異丙醇（國藥集團(tuán)，貨號：80109218）混合均勻，室溫靜置15 min，4℃，12 000 r/min，離心15 min，棄上清，加入1 mL 75%無水乙醇（國藥集團(tuán)，貨號：100092680）漂洗沉淀、靜止和離心，重復(fù)一次后，棄去上清液后添加DEPC水40 μL，放入冰箱（-80℃）備用。接著進(jìn)行第一條cDNA的合成，先去除總RNA中的DNA，隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（試劑盒購自Fermentas，貨號：#K1622）。最后將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（試劑盒購自Thermo，貨號：#K0223）。以Primer F 5' CTTGTGCTGATGGGTTTG3'；Primer R 5'AGTTCGCCTGTGTATTCC 3'作為上下引物擴(kuò)增Slit2 mRNA，擴(kuò)增大小為142 bps；以Primer F 5' GAGGTCGGGAACTTACTGTG3'；Primer R 5' GGAAGGAGCCATCAGAAGAG 3'為上下引物擴(kuò)增Robo4 mRNA，擴(kuò)增大小為148 bps；以Primer F 5' AGACCCTGGTGGACATCTTC3'；Primer R 5' TGTGCTGGCTTTGGTGAG 3'為上下引物擴(kuò)增VEGF mRNA，擴(kuò)增大小為183 bps。以Primer F 5' GGAGTCTACTGGCGTCTTCAC3'；Primer R 5' ATGAGCCCTTCCACGATGC 3'為上下引物擴(kuò)增GAPDH，擴(kuò)增大小為237 bps。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析：ABI Prism 7300 SDS Software。

1.2.2 Slit2/Robo4 蛋白的表達(dá) 采用Western 印跡法，首先將大鼠腸組織放入裂解液中進(jìn)行裂解，隨后勻漿離心（4℃，1 200 r/min，15 min），靜止后取上清，蛋白質(zhì)定量后保存于冰箱（-80℃）。細(xì)胞樣品用PBS 液洗滌兩次，離心取上清，蛋白質(zhì)定量后備用。其次進(jìn)行蛋白定量（BCA 蛋白定量試劑盒Thermo，PICPI23223），吸光度在波長562 nm 處測定，采用橫坐標(biāo)為吸光值，縱坐標(biāo)為蛋白濃度（μg/μL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測定樣品吸光值，計(jì)算出樣品實(shí)際濃度。隨后選取不同的凝膠濃度制備PAGE 膠。緊接著進(jìn)行上樣及電泳、半干轉(zhuǎn)膜、膜上蛋白檢測。隨后進(jìn)行膜的封閉，根據(jù)說明書Slit（abcam ab134166）1∶1 000、robot（Santa Cruz sc-166872）1∶500、GAPDH（CST#5174）1∶1 000稀釋抗體，制備一抗。隨后稀釋HRP（羊抗小鼠HRP 標(biāo)記二抗：中山金橋ZB-2305；羊抗兔HRP 標(biāo)記二抗：中山金橋ZB-2301）標(biāo)記的二抗，與膜同時37℃孵育1 h。用TBST 洗滌3 次，完成抗體孵育。最后進(jìn)行ECL 化學(xué)發(fā)光顯色（發(fā)光液：Millipore WBKLS0100），放入成像系統(tǒng)（Tanon Tanon-5200）進(jìn)行掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，Slit2/Robo4 蛋白表達(dá)與VEGF 表達(dá)的相關(guān)性采用Pearson 秩相關(guān)檢驗(yàn)，以α=0.05 作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Slit2 的表達(dá)量

通過PCR 及Western 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Slit2 蛋白在膿毒癥組及假手術(shù)組均有表達(dá)，膿毒癥組蛋白表達(dá)量明顯低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[CT值：（25.51±0.33）vs.（2 4.4 3±0.2 5），t=-7.679，P＜0.001；mRNA：（0.020±0.004）vs.（0.040±0.008），t=6.168，P＜0.001；灰度值：（10 601.15±1 438.07）vs.（16 482.38±1 671.07），t=-5.830，P＜0.001]，見圖1～4。

2.2 Robo4 的表達(dá)量

PCR及Western實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Robo4蛋白在膿毒癥組及假手術(shù)組均有表達(dá)，在膿毒癥組蛋白表達(dá)量明顯低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[CT值：（25.80±0.62）vs.（2 4.5 3±0.2 9），t=-4.737，P＜0.001；mRNA：（0.016±0.004）vs.（0.037±0.006），t=8.330，P＜0.001；灰度值：（12 206.99±129.52）vs.（20 089.75±1 535.14），t=8.462，P＜0.001]，見圖1～4。

圖1 slit2、robo4 蛋白Western 表達(dá)

2.3 VEGF 的表達(dá)量

同樣采用PCR 的方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF 蛋白在膿毒癥組及假手術(shù)組均有表達(dá)，在膿毒癥組蛋白表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[CT 值：（23.81±0.35）vs.（25.34±0.31），t=13.217，P＜0.001；mRNA：（0.064±0.018）vs.（0.021±0.003），t=-6.338，P＜0.001），見圖3～4。

圖2 slit2、robo4 蛋白灰度表達(dá)

圖3 slit2、robo4、VEGF 蛋白CT 值

圖4 slit2、robo4、VEGF 蛋白mRNA

2.4 Slit2/Robo4 與VEGF 蛋白表達(dá)量的相關(guān)性

在PCR 實(shí)驗(yàn)中Slit2 蛋白表達(dá)量與VEGF 蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（CT 值：r=-0.744，P=0.001；mRNA 值：r=-0.688，P=0.003），Robo4 蛋白表達(dá)量與VEGF 蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（CT 值：r=-0.674，P=0.004；mRNA 值：r=-0.836，P＜0.001），見表1。Slit2 蛋白表達(dá)量與Robo4 蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)（CT 值：r=0.814，P＜0.001；mRNA 值：r=0.805，P＜0.001），見表2。

表1 Slit2/Robo4 與VEGF 蛋白表達(dá)量之間的相關(guān)性

表2 Slit2/Robo4 蛋白表達(dá)量之間的相關(guān)性

3 討論

膿毒癥的病理、生理學(xué)機(jī)制復(fù)雜，涉及炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)控、凝血障礙和神經(jīng)/內(nèi)分泌系統(tǒng)等[5]。腸道作為全身重要的消化吸收器官，具有豐富的微生物群體，這也是機(jī)體從感染發(fā)展到膿毒癥重要因素。腸道微血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能的破壞是腸源性膿毒癥發(fā)生機(jī)制之一[6]。目前研究發(fā)現(xiàn)Slit2/Robo4 具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、成管，增加內(nèi)皮細(xì)胞完整性，增強(qiáng)血管穩(wěn)定性，降低血管通透性的作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)Slit2/Robo4 在膿毒癥模型大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在表達(dá)，提示Slit2/Robo4蛋白可以保護(hù)膿毒癥模型大鼠腸黏膜屏障，避免腸源性膿毒癥的發(fā)生。

目前在膿毒癥治療新方法的研究中，London 等[8]研究發(fā)現(xiàn)Slit 蛋白對滲漏的血管具有超級黏膠樣作用，從而加強(qiáng)機(jī)體承受其自身免疫攻擊的能力。同樣在袁熙等[9]研究中提示Slit 蛋白與其受體Robo 結(jié)合可以穩(wěn)定血管系統(tǒng)，避免過度的炎癥反應(yīng)對正常組織的損傷。Weng 等[10]在輸血相關(guān)的急性肺損傷模型研究中發(fā)現(xiàn)Slit2/Robo4 蛋白在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞上有表達(dá)，且表達(dá)量明顯降低。本研究發(fā)現(xiàn)，Slit2/Robo4 蛋白在膿毒癥組及假手術(shù)組腸道血管內(nèi)皮細(xì)胞上均有表達(dá)。結(jié)果顯示Slit2/Robo4 蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)，并且在膿毒癥組表達(dá)量明顯下降（P＜0.05），提示該蛋白參與了腸源性膿毒癥的病理、生理過程，其減少原因可能存在消耗性減少。Qin 等[11]在內(nèi)毒素導(dǎo)致的膿毒癥模型研究中發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象與本研究結(jié)果相似，證實(shí)了本研究的結(jié)果和推測。

本研究結(jié)果顯示，VEGF 在兩組實(shí)驗(yàn)大鼠中均有表達(dá)，且在膿毒癥組表達(dá)量明顯增加（P＜0.05）。因?yàn)閂EGF 可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，保持內(nèi)皮細(xì)胞的活性，提高血管通透性，在新生血管形成和開啟過程中有著重要作用。當(dāng)膿毒癥發(fā)生時，血管內(nèi)皮功能遭受破壞，血管通透性增加，從而發(fā)生血管滲漏。因此在膿毒癥模型大鼠腸黏膜血管組織中VEGF 蛋白表達(dá)量明顯增加，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，進(jìn)一步加重內(nèi)皮損傷，增加血管的通透性，這與本研究結(jié)果相吻合。

本研究結(jié)果還顯示，Slit2/Robo4 蛋白表達(dá)量與VEGF 蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)Slit2/Robo4 在體外能抑制VGEF、FGFs 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移，同時在體內(nèi)可以抑制血管的新生和滲透[12]，有研究表明[13]，增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的血管膜中VEGF 和Robo4 共表達(dá)，Robo4 對于血管的生成起促進(jìn)作用。本研究中，Robo4 蛋白表達(dá)量下降，VEGF 蛋白表達(dá)量增加，兩者之間呈負(fù)相關(guān)。同樣，目前有學(xué)者認(rèn)為Slit2/Robo4 信號能對抗VEGF/VEGF 受體信號，血管新生及內(nèi)皮細(xì)胞遷移，減少血管通透性，保持血管內(nèi)平衡。因此從Slit2/Robo4 蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)、與VEGF 蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)這一結(jié)果，可以推斷在膿毒癥模型大鼠腸黏膜上存在Slit2/Robo4 蛋白抑制VEGF 所產(chǎn)生的血管新生、內(nèi)皮遷移和血管通透性增加的作用，從而保護(hù)腸黏膜屏障功能，防止腸源性膿毒癥的發(fā)生。目前已有研究證實(shí)Slit2 能降低VEGF 誘導(dǎo)的血管通透性上調(diào)[14]，有研究發(fā)現(xiàn)Slit2 蛋白依賴Robo4 發(fā)揮功能，且Robo4 通過一種非導(dǎo)向機(jī)制，抑制促血管生成因子誘導(dǎo)的新生血管芽及內(nèi)皮通透性增加來維持成熟血管網(wǎng)的屏障功能[15]，從而佐證本研究的推斷。

在下一步的研究中，擬構(gòu)建膿毒癥Slit2 基因敲除動物模型和人重組Slit2 組動物模型，進(jìn)一步探討Slit2/Robo4 蛋白能否通過抑制血管內(nèi)皮生長因子，減少因炎癥細(xì)胞因子所致的血管滲漏，保持血管系統(tǒng)的穩(wěn)定性。同時，擬在膿毒癥動物模型上檢測多個時間點(diǎn)內(nèi)Slit2/Robo4 蛋白和VEGF 蛋白的表達(dá)水平，以動態(tài)觀察其變化趨勢，探索其在膿毒癥中的表達(dá)規(guī)律。

綜上所述，通過在膿毒癥模型大鼠中檢測腸黏膜血管組織中Slit2/Robo4 與VEGF 的蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在膿毒癥模型大鼠的腸黏膜血管組織中Slit2、Robo4 蛋白表達(dá)量明顯下降，VEGF 蛋白表達(dá)量明顯增加。同時Slit2/Robo4 蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)，VEGF 蛋白表達(dá)量與Slit2/Robo4 蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。膿毒癥模型大鼠腸黏膜血管中Slit2/Robo4 與VEGF 蛋白表達(dá)量的變化，與腸黏膜屏障系統(tǒng)的穩(wěn)定性密切相關(guān)，這為探討腸黏膜屏障保護(hù)機(jī)制提供了研究方向。