苑 蘅，苗亞琪，顧晨程，迮思露，孔雅琪，于楠楠，陳學紅

(徐州工程學院 食品與生物工程學院，江蘇 徐州 222018)

黑蒜是大蒜在高溫高濕條件下，各種物質(zhì)相互作用而形成的新型深加工食品.與大蒜相比，黑蒜外觀變黑、辛辣味消失、韌性增強、具有甜中帶酸的獨特風味，具有更加豐富的營養(yǎng)和生物活性[1-5].

5-HMF是焦糖化和美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物，是黑蒜色澤形成的關(guān)鍵物質(zhì)[6-9].但是目前學術(shù)界對5-HMF的安全性存在爭議：一方面研究表明5-HMF具有抗氧化、抗炎等生物活性，即使5-HMF含量較高的食品，正常食用劑量下不會對人體健康造成不良影響；另一方面也有研究表明5-HMF具有基因毒性，應(yīng)限制食用[10-12].

目前，測定5-HMF的方法主要有高效液相色譜法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[13-14].盡管有較多關(guān)于5-HMF檢測方法的報道，但黑蒜是一個高糖微酸的復(fù)雜食品體系，為了提高檢測的準確性，需要先對樣品進行純化.本課題根據(jù)黑蒜的特點，利用高效液相色譜法結(jié)合固相微萃取技術(shù)建立黑蒜中5-HMF的提取、純化和檢測方法，對科學地認識黑蒜的營養(yǎng)性和安全性、控制其加工品質(zhì)具有重要意義.

1 材料與儀器

購買的黑蒜樣品分別為云南獨頭黑蒜，云南多瓣黑蒜和山東多瓣黑蒜.

純凈水，中國杭州娃哈哈集團有限公司；5-HMF，98%，北京百靈威科技有限公司；甲醇、甲酸，色譜純 99.9%，北京百靈威科技有限公司.

LE204E/02電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；GE Ultrospec 7000/7000PC紫外-可見光分光光度計，英國柏楉有限公司；UltiMate 3000高效液相色譜儀，賽默飛世爾科技有限公司；Sepax HP-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱，美國賽分科技有限公司；SBEQ-CG1012 管固相萃取真空裝置，上海安普實驗科技股份有限公司；Universal 320R臺式高速冷凍離心機，廣州深華公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；TM-1F渦旋振蕩器(Turbo Mixer Vortex)，德國維根公司(WIGGENS)；B101思樂誼攪拌器,冠鑫興業(yè)股份有限公司；Scientz-18N冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；UA22MFD超聲清洗機，德國維根公司(WIGGENS).

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 HPLC參數(shù)確定

2.1.1 5-HMF最大吸收波長的確定

用電子天平準確稱取0.097 5 g的5-HMF標準品，用純凈水定容至10 mL容量瓶內(nèi)，配置成質(zhì)量濃度為9.75 mg/mL的5-HMF水溶液，用移液器取100 μL該溶液，定容至100 mL容量瓶內(nèi)，配置成9.75 μg/mL的5-HMF水溶液.在紫外-可見光分光光度計上設(shè)定檢測范圍為190～400 nm，掃描間隔為0.2 nm，將純凈水作為空白對照，進行檢測.5-HMF標準品紫外吸收光譜如圖1所示，5-HMF最大吸收波長在283.8 nm處.

圖1 5-HMF紫外吸收光譜圖

2.1.2 5-HMF出峰時間確定

準確稱取0.113 1 g 5-HMF標準品，配置成11.31 mg/mL 5-HMF甲醇溶液，再稀釋至11.31 μg/mL 5-HMF甲醇溶液.流動相為體積分數(shù)0.1%甲酸甲醇溶液-0.1%甲酸水溶液(體積比1∶9),檢測波長為284 nm.5-HMF標準品高效液相色譜(HPLC)如圖2所示，5-HMF的出峰時間在約14 min.

圖2 5-HMF的HPLC圖

2.2 標準曲線及相關(guān)系數(shù)

用體積分數(shù)5%甲醇溶液配制質(zhì)量濃度為64.04 μg/mL的5-HMF標準溶液，并依次稀釋至32.02、16.01、8.00、4.00、2.00 μg/mL.用0.4 μm針孔過濾器過濾進行測定，計算相關(guān)參數(shù).以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制5-HMF標準曲線，如圖3所示.回歸方程為：y=1.512 0+2.295 5x(R2=0.999 96)，線性范圍：2.00～64.04 μg/mL.

圖3 5-HMF標準曲線

2.3 方法的檢出限和定量限

方法檢出限(LOD)是指樣品中待檢測成分能被檢測到的最低量，一般是作為定性檢出用.而定量限(LOQ)則是指樣品中待檢測成分能被定量測定的最低量，其檢測結(jié)果需具備一定的準確性和精密度，一般在定量分析用方法中使用.信噪比為10，測得定量限；信噪比為3，測得檢出限.平行進行10次試驗，確定5-HMF測定方法的檢出限為1.2 ng/mL，定量限為4 ng/mL.

2.4 精密度試驗

精密移取標準溶液(16.01 μg/mL)20 μL，連續(xù)測定4次.精密度試驗結(jié)果如表1所示.RSD為0.66%，小于5%，精密度良好.

表1 精密度試驗結(jié)果

2.5 回收率

以黑蒜樣品為基底進行加標回收率試驗，取1 mL供試液加入10 μL的10.09 mg/mL的5-HMF標準樣品，進樣測定加標樣品中5-HMF的平均值，計算回收率.結(jié)果如表2所示.回收率在80%～120%，回收率良好.且RSD為0.7%，小于5%，穩(wěn)定性良好.

表2 5-HMF回收率考察結(jié)果

2.6 提取條件優(yōu)化

2.6.1 SPE小柱優(yōu)化

先后用3 mL甲醇和3 mL水活化安普CNWBOND LC-C18 SPE，精準加入樣品0.5 mL，分別收集以3 mL水和3 mL甲醇洗脫的溶液，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進行濃縮后以體積分數(shù)5%甲醇溶液進行復(fù)溶，定容到5 mL容量瓶中.用HPLC測定5-HMF含量，并計算得率.再重復(fù)上述步驟分別測定安普CNWBOND HC-C18 SPE，安普Poly-Sery HLB SPE的得率，得到各小柱得率.以SPE小柱種類為橫坐標，回收率為縱坐標作圖，結(jié)果如圖4所示.P<0.05，NS表示無統(tǒng)計學意義.

*:P<0.05；NS:無統(tǒng)計學意義

從圖4可知，小柱種類對回收率有統(tǒng)計學意義，且用HLB小柱過柱得到的5-HMF回收率最低，而使用HC-C18小柱得到的回收率略優(yōu)于HLB小柱，LC-C18小柱的回收率最高，效果最好，故選擇LC-C18小柱.

2.6.2 超聲時間優(yōu)化

精密稱取8 g云南獨頭黑蒜樣品，以40 mL水混合均勻，依次編號后分別超聲10、20、30 min.將超聲后的黑蒜溶液放入冷凍離心機中，在9 000 r/min，20 ℃下離心20 min.上清液經(jīng)布式漏斗抽濾后，定容至100 mL.取1 mL過LC-C18小柱，用20 mL甲醇溶液洗脫，洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋干后，以體積分數(shù)5%甲醇水溶液復(fù)溶至5 mL，經(jīng)過0.4 μm針孔過濾器過濾后，用HPLC測定，得到不同超聲時間下5-HMF濃度.

以超聲時間為橫坐標，5-HMF質(zhì)量分數(shù)為縱坐標繪制曲線，結(jié)果如圖5所示.由圖5可知，超聲時間對黑蒜中5-HMF的提取率具有顯著影響，主要呈先上升再下降的趨勢.當超聲時間為20 min時，5-HMF質(zhì)量分數(shù)最高，為0.026 13%,高于超聲時間10 min時5-HMF質(zhì)量濃度，并顯著高于超聲30 min時質(zhì)量分數(shù)，故超聲時間取20 min.

ab: P=0.05水平上的顯著性差異比較；AB: P=0.01水平上的顯著性差異比較

2.6.3 提取次數(shù)優(yōu)化

精密稱取8 g云南獨頭黑蒜樣品以40 mL水混合均勻，依次編號.超聲20 min后，放入冷凍離心機中，在9 000 r/min，20 ℃下離心20 min.上清液經(jīng)布式漏斗抽濾后，收集上清液.1、2號定容至100 mL，作為提取1次的樣品.3～6號以20 mL水復(fù)溶，超聲20 min，離心20 min，抽濾后收集上清液，3、4號定容至100 mL，作為提取2次的樣品；5、6號以20 mL水復(fù)溶，超聲20 min，離心20 min，抽濾后收集上清液，定容至100 mL，作為提取3次的樣品.分別取1 mL過LC-C18小柱，用20 mL甲醇溶液洗脫，洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋干后，以體積分數(shù)5%甲醇水溶液復(fù)溶至5 mL，經(jīng)過0.4 μm針孔過濾器過濾后，用HPLC測定，得到不同提取次數(shù)下5-HMF質(zhì)量分數(shù).以提取次數(shù)為橫坐標，5-HMF質(zhì)量分數(shù)為縱坐標繪制曲線，結(jié)果如圖6所示.

abc：P=0.05水平上的顯著性差異比較；AB: P=0.01水平上的顯著性差異比較

由圖6可知，不同提取次數(shù)在5-HMF質(zhì)量分數(shù)上有統(tǒng)計學意義，且隨著提取次數(shù)的增加，5-HMF質(zhì)量分數(shù)較為明顯增長，且提取次數(shù)為3次時最大，故選擇提取次數(shù)為3次.

優(yōu)化后黑蒜樣品前處理的步驟為：精密稱取下樣品8 g，以40 mL水混合均勻.超聲20 min后，在9 000 r/min,20 ℃下離心20 min,抽濾.復(fù)溶，超聲20 min，離心20 min,抽濾.再次復(fù)溶，超聲20 min，離心20 min，抽濾后，所有溶液一起定容至100 mL.取1 mL過LC-C18小柱，用20 mL甲醇溶液洗脫，洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋干后，以體積分數(shù)5%甲醇水溶液復(fù)溶至5 mL.

2.7 不同產(chǎn)地黑蒜中5-HMF含量

分別取足量的云南獨頭黑蒜，云南多瓣黑蒜和山東多瓣黑蒜切片后，置于-20 ℃下冰凍干燥12 h.將冰凍干燥后的黑蒜放入冷凍干燥機內(nèi)，-100 ℃下冷凍干燥24 h.取出后放入研缽中，加入液氮.迅速將被液氮冷卻的黑蒜放入攪拌器中攪拌均勻至粉末狀，做好標記，密封備用.

精密稱取云南獨頭黑蒜樣品8 g，以40 mL水混合均勻.在超聲清洗機中超聲10 min后，放入冷凍離心機中，在9 000 r/min、20 ℃下離心20 min.將上清液經(jīng)布式漏斗抽濾，定容至100 mL容量瓶內(nèi).取1 mL過LC-C18小柱，用20 mL甲醇溶液洗脫，洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋干后，以體積分數(shù)5%甲醇水溶液復(fù)溶至5 mL，經(jīng)過0.4 μm針孔過濾器過濾后進行HPLC檢測.以黑蒜品種為橫坐標，5-HMF質(zhì)量分數(shù)為縱坐標繪制曲線，結(jié)果如圖7所示.

圖7 不同品種黑蒜中5-HMF質(zhì)量分數(shù)

由圖7可知，云南獨頭黑蒜，云南多瓣黑蒜和山東多瓣黑蒜的5-HMF質(zhì)量分數(shù)分別為0.025 9%、0.177 7%、0.064 4%.云南多瓣黑蒜的5-HMF含量最高，且顯著高于另外兩個品種的黑蒜，云南獨頭黑蒜的含量最低.這可能是由于黑蒜在制作過程中，多瓣黑蒜比獨頭黑蒜的比表面積大，內(nèi)部溫度更高，所以更易形成5-HMF.該方法測定黑蒜中5-HMF含量時，可以排除雜質(zhì)的干擾，較為準確地反應(yīng)出黑蒜中5-HMF的含量.

3 結(jié)語

本課題建立了高效液相色譜結(jié)合固相微萃取技術(shù)測定黑蒜中5-HMF的方法，LC-C18小柱對黑蒜樣品具有較好的純化效果，并且可以獲得較高的回收率(112.78%)和穩(wěn)定性(相對標準偏差0.66%).后期可以研究黑蒜中5-HMF的形成機制，進而闡明黑蒜色澤的形成機制.