王娟 韋芳 曹陽 田敏 呂紅彬

1西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院眼科，瀘州 646000；2上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院眼科 上海市眼底病重點實驗室，上海 200080

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病的一種常見微血管并發(fā)癥，早期防治是防止DR致盲的重要手段之一[1]。研究表明糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)功能損傷早于血管損傷[2]。臨床研究也證實了糖尿病患者尚未出現(xiàn)視網(wǎng)膜結構改變時，其視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram，ERG)的b波及振蕩電位已出現(xiàn)振幅下降，并且隨著病程延長及病情加重，ERG振幅進一步下降，潛伏期延長[3]，充分說明糖尿病患者早期視網(wǎng)膜神經(jīng)功能即已出現(xiàn)異常。因此，早期保護和恢復DR中視網(wǎng)膜神經(jīng)元的功能對于防止DR致盲有重要意義。叔丁基對苯二酚(tert-butylhydroquinone，tBHQ)分子式為C10H14O2，是一種合成的酚類抗氧化劑，常被用作食品添加劑以防止油脂食品氧化變質(zhì)，屬于Ⅱ相酶誘導劑之一，可有效防止氧化應激誘導的細胞功能障礙[4]。研究表明tBHQ可通過激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)途徑促進蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)磷酸化[5]；而磷酸化的Akt及其活化通路可對阿爾茲海默癥等神經(jīng)退行性疾病發(fā)揮抗細胞凋亡及抗氧化應激作用[6]，證實了tBHQ在保護神經(jīng)元方面具有一定作用。在DR中，PI3K/Akt途徑受到抑制，并參與高糖誘導的視網(wǎng)膜細胞損傷[7]。因此恢復PI3K/Akt通路的活性將對防治DR起到關鍵作用。既往研究結果表明，tBHQ可通過促進Akt的下游靶蛋白內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)活化發(fā)揮抵抗內(nèi)皮功能損害和eNOS解偶聯(lián)的作用[8]；而tBHQ能否恢復糖尿病誘導的eNOS活性尚未可知。本研究擬建立糖尿病動物模型和細胞高糖模型，觀察tBHQ對DR早期視網(wǎng)膜結構和功能的作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 選取8周齡清潔級雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量180～200 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境為12 h/12 h循環(huán)明暗光照，溫度為22～25 ℃，濕度為40%～70%。實驗動物的飼養(yǎng)、使用與處死方法均遵循西南醫(yī)科大學實驗動物管理條例，研究方案經(jīng)西南醫(yī)科大學實驗動物倫理審查委員會審查批準(批文號：201711189)。

1.1.2實驗細胞 大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞系rMC-1(美國西北大學Vijay Sarthy實驗室)。將細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為體積分數(shù)5% CO2、飽和濕度，溫度為37 ℃。當細胞培養(yǎng)至80%～90%融合時，進行傳代培養(yǎng)，取第3～8代細胞進行實驗。

1.1.3主要試劑及儀器 tBHQ、鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)(美國Sigma公司)；PI3K抑制劑LY294002(美國Merck公司)；無糖DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；RIPA裂解液、蛋白上樣緩沖液、超敏型增強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑、一抗及二抗稀釋液(上海碧云天生物技術有限公司)；小鼠抗大鼠eNOS抗體(ab76198，美國Abcam公司)；兔抗大鼠p-eNOS ser1179抗體(12454-2，美國SAB公司)；兔抗大鼠p-Akt ser473(4060s)、兔抗大鼠Akt(4685s)、β-actin、HRP標記單克隆抗體(5125s)(美國CST公司)；TUNEL凋亡檢測試劑盒(瑞士Roche公司)。Ganzfeld ERG System(美國Phoenix-Micron公司)；NANO DROP分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)；激光掃描共聚焦熒光顯微鏡(TCS SP8，德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組及模型建立 將45只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為正常對照組、糖尿病模型組和tBHQ干預組，每組15只。適應性喂養(yǎng)1周后，糖尿病模型組和tBHQ干預組大鼠腹腔內(nèi)注射質(zhì)量分數(shù)1% STZ溶液(6.5 ml/kg)建立糖尿病大鼠模型，正常對照組大鼠腹腔內(nèi)注射等容量枸櫞酸鈉緩沖液。正常對照組和糖尿病模型組大鼠喂食普通飼料(上海帆泊生物技術有限公司)，tBHQ干預組自STZ注射前2周開始一直喂食質(zhì)量分數(shù)1% tBHQ添加飼料(上海帆泊生物技術有限公司)。造模后72 h，大鼠尾靜脈采血測量空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)，以FPG>16.7 mmol/L為建模成功，以后每2周檢測1次隨機血糖并記錄。

1.2.2細胞分組及模型建立 將Müller細胞系分為5個組，其中正常對照組細胞于含5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h；甘露醇對照組細胞于含5.5 mmol/L葡萄糖及24.5 mmol/L甘露醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h；高糖組細胞于含30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h；tBHQ干預組細胞先于含5 μmol/L tBHQ的正常糖培養(yǎng)基中預處理24 h，然后于含5 μmol/L tBHQ的高糖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)72 h；PI3K抑制劑組細胞先于含5 μmol/L LY294002的正常糖培養(yǎng)基中預處理6 h，然后于含5 μmol/L LY294002及5 μmol/L tBHQ的正常糖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，最后于含5 μmol/L LY294002及5 μmol/L tBHQ的高糖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。每天更換培養(yǎng)基。實驗重復5次。

1.2.3ERG檢測大鼠視網(wǎng)膜功能 造模后4周，剔除發(fā)生糖尿病性白內(nèi)障的大鼠，各組選取6只，暗適應至少12 h，使用質(zhì)量分數(shù)10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射(3 ml/kg)麻醉，復方托吡卡胺滴眼液充分擴瞳，將大鼠俯臥位固定于實驗臺上，給予保溫。采用Ganzfeld ERG系統(tǒng)記錄暗適應視網(wǎng)膜反應。安裝電極：角膜電極垂直于角膜頂點放置，充分接觸角膜，使光線充分進入眼內(nèi)；參考電極置于枕后矢狀縫與兩眼連線的交點處皮下；接地電極置于尾根部背側皮下。根據(jù)前期預實驗結果，刺激條件設置為：背景光強為0 cd/m2，閃光強度分別為-1.3、-0.3、0.7 log cd·s/m2，刺激間隔分別為30、40、50 s，單次刺激持續(xù)時間為10 μs，每個光強度記錄5次得出平均值，換另一只眼再進行上述步驟。全部實驗均在紅光微弱照射下完成。記錄數(shù)據(jù)，分析各組大鼠不同刺激光強度下ERG a波、b波振幅的差異。

1.2.4蘇木精-伊紅染色法觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài)結構 造模后4周，各組分別取5只大鼠，使用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉后并處死，取右眼置于質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛溶液中固定24 h。常規(guī)石蠟包埋，以平行于視神經(jīng)方向行5 μm厚連續(xù)切片。取各組視網(wǎng)膜組織石蠟切片，依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ和梯度乙醇中脫蠟水化，蘇木素染色3～5 min，體積分數(shù)1%鹽酸乙醇溶液浸泡5 s，體積分數(shù)1%氨水返藍5 s，梯度乙醇脫水各5 min，體積分數(shù)0.5%伊紅溶液復染5 min，無水乙醇脫水透明后中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5TUNEL法觀察視網(wǎng)膜組織細胞凋亡情況 造模后4周，各組分別取5只大鼠，使用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉并處死，取右眼置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)制作冰凍切片，以平行于視神經(jīng)方向行12 μm厚連續(xù)切片。取各組視網(wǎng)膜冰凍切片室溫風干，4%多聚甲醛室溫固定20 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)清洗30 min，0.1% Triton X-100 4 ℃透膜2 min，PBS清洗，將配制好的TUNEL檢測混合液滴于切片上，37 ℃孵育1 h；DAPI復染核并PBS洗滌后抗熒光淬滅封片劑封片。使用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察并拍照，當紅色熒光與細胞核重合時則該細胞為凋亡細胞，使用ImageJ軟件分析整張視網(wǎng)膜圖片，記錄每張圖片上的細胞總數(shù)及TUNEL染色陽性細胞數(shù)，凋亡指數(shù)=凋亡陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.2.6Western blot法檢測視網(wǎng)膜組織及細胞中p-Akt、Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表達 取各組10只大鼠的左眼，沿角鞏膜緣剪開去除晶狀體，分離出視網(wǎng)膜組織，同時收集各組細胞，凍存于-80 ℃冰箱。利用RIPA裂解液提取視網(wǎng)膜組織和細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，采用NANO DROP軟件檢測蛋白質(zhì)濃度，并加入上樣緩沖液煮沸后制備蛋白質(zhì)樣本。取各組蛋白樣本30 μg上樣于質(zhì)量分數(shù)7.5% SDS-PAGE凝膠泳道中，80～120 V電壓下電泳1.5 h，恒定電流0.36 A冰浴1.5 h轉印至PVDF膜；將PVDF膜置于含質(zhì)量分數(shù)5%脫脂奶粉TBST中，室溫下?lián)u床上封閉1.5 h；TBST漂洗3次，每次15 min，根據(jù)蛋白分子大小裁膜，分別加入抗eNOS(1∶ 200)、p-eNOS(1∶ 200)、p-Akt(1∶ 1 000)、Akt(1∶ 1 000)、β-actin(1∶ 1 000)一抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次后，加入HRP標記二抗(1∶ 5 000)，室溫下?lián)u床上孵育1.5 h；TBST洗膜3次后，采用超敏型ECL發(fā)光法顯影。采用ImageJ軟件測定各條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參照，計算各蛋白相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠造模后一般情況及不同時間點血糖濃度比較

5只模型大鼠血糖不達標被剔出實驗，最終成功造模25只，糖尿病模型組及tBHQ干預組分別為15只和10只，飼養(yǎng)過程中未出現(xiàn)死亡大鼠。造模后72 h，糖尿病模型組大鼠已開始出現(xiàn)尿量增多、飲水增加的變化，隨著病程延長，出現(xiàn)毛發(fā)粗糙、枯黃，精神萎靡，反應遲鈍，多食、多尿、多飲癥狀明顯；而tBHQ干預組大鼠多食、多尿、多飲癥狀較糖尿病模型組大鼠輕，精神狀況較好，伴有一定程度的毛發(fā)粗糙和枯黃；正常對照組大鼠毛發(fā)順滑、精神佳、反應靈敏。

造模后72 h、2周和4周各組間大鼠血糖濃度總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=100.80，P<0.01；F=77.38，P<0.01；F=73.94，P<0.01)。糖尿病模型組造模后72 h、2周和4周大鼠血糖均較正常對照組及tBHQ干預組升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)(表1)。

表1 各組大鼠不同時間點血糖濃度比較(x±s,mmol/L)Table 1 Comparison of blood glucose concentration at differenttime points among various groups (x±s,mmol/L)組別樣本量造模后72 h造模后2周造模后4周正常對照組106.01±1.37a6.18±1.10 a6.70±3.06 a糖尿病模型組1530.70±2.3532.49±4.0533.73±4.25tBHQ干預組1025.87±1.34a26.39±3.10a25.84±3.64aF值100.8077.3873.94P值<0.01<0.01<0.01 注:與同時間點糖尿病模型組比較,aP<0.01(單因素方差分析,LSD-t檢驗) tBHQ:叔丁基對苯二酚 Note:Compared with diabetic model group at corresponding time points,aP<0.01 (One-way ANOVA,LSD-t test) tBHQ:tert-butyl-hydroquinone

表2 各組不同刺激光強度下大鼠ERG振幅比較(x±s,μv)Table 2 Comparison of ERG amplitudes of rats in different groups under different stimulus light intensities (x±s,μv)組別樣本量-1.3 log cd·s/m2光強度下-0.3 log cd·s/m2光強度下0.7 log cd·s/m2光強度下a波b波a波b波a波b波正常對照組611.23±10.75138.50±81.2133.68±10.80173.00±100.7092.37±31.95a270.60±134.70a糖尿病模型組614.27±13.4662.02±37.9221.60±7.1569.37±33.3244.72±18.8194.65±37.25tBHQ干預組616.73±11.11123.20±52.0137.10±17.00152.80±76.2986.92±36.65a242.90±106.70aF值0.332.752.613.184.515.21P值0.730.100.110.070.030.02 注:與糖尿病模型組比較,aP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) tBHQ:叔丁基對苯二酚 Note:Compared with diabetic model group,aP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) tBHQ:tert-butylhydroquinone

2.2 各組大鼠ERG振幅比較

當光強度為-1.3 log cd·s/m2和-0.3 log cd·s/m2時，各組大鼠暗適應ERG的a波和b波振幅總體比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；當刺激光強度為0.7 log cd·s/m2時，各組大鼠暗適應ERG的a波和b波振幅總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=4.51，P=0.03；F=5.21，P=0.02)，糖尿病模型組暗適應ERG的a波和b波振幅明顯低于正常對照組和tBHQ干預組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(表2)。

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜結構比較

光學顯微鏡下可見正常對照組大鼠視網(wǎng)膜各層結構清晰完整，內(nèi)界膜表面光滑，細胞排列整齊。糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜組織層次結構尚完整但欠清晰，細胞間質(zhì)水腫，內(nèi)界膜表面粗糙，神經(jīng)節(jié)細胞層細胞數(shù)量明顯減少，內(nèi)核層及外核層變薄、結構疏松且細胞排列紊亂。tBHQ干預組大鼠視網(wǎng)膜組織結構較完整，內(nèi)界膜輕度增厚，神經(jīng)節(jié)細胞層細胞輕度減少，內(nèi)核層及外核層結構較疏松、細胞排列輕度紊亂(圖1)。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理染色變化(HE ×400，標尺=50 μm) A：正常對照組大鼠視網(wǎng)膜各層結構清晰完整 B：糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜層次欠清晰，各層細胞數(shù)量明顯減少，層間結構疏松紊亂 C：tBHQ干預組大鼠視網(wǎng)膜結構基本完整，各層細胞數(shù)量輕度減少，層間結構較疏松 (箭頭示內(nèi)界膜) GCL：神經(jīng)節(jié)細胞層；INL：內(nèi)核層；ONL：外核層Figure 1 Histopathology of rat retinal tissues (HE ×400，bar=50 μm) A：The retinal layer structures of normal control group were clear and complete B：The retinal layers were not clear with the number of cells in each layer significantly reduced，and the interlayer structure was loose and disordered in diabetic model group C：The retinal structure was basically complete，and the number of cells in each layer was slightly reduced，and the interlayer structure was slightly loose in tBHQ intervention group (Arrows indicated the inner limiting membrane)GCL：ganglion cell layer；INL：inner nuclear layer；ONL：outer nuclear layer

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中細胞凋亡情況比較

正常對照組大鼠視網(wǎng)膜各層可見少量TUNEL紅色熒光染色的凋亡細胞；糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜中紅色熒光染色細胞較正常對照組增多，主要位于外核層；tBHQ干預組大鼠視網(wǎng)膜中紅色熒光染色細胞較糖尿病模型組減少(圖2)。正常對照組、糖尿病模型組和tBHQ干預組細胞凋亡指數(shù)分別為(7.63±6.49)%、(55.26±26.63)%、(8.59±7.98)%，總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=10.04，P=0.01)，糖尿病模型組細胞凋亡指數(shù)較正常對照組和tBHQ干預組顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.02、P<0.01)(圖3)。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織細胞TUNEL染色情況(×200，標尺=75 μm) A：正常對照組大鼠視網(wǎng)膜組織中可見少量紅色熒光染色細胞 B：糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜外核層可見大量紅色熒光染色細胞 C：tBHQ干預組大鼠視網(wǎng)膜外核層可見少量紅色熒光染色細胞 (箭頭示紅色與藍色熒光重合部分) GCL：神經(jīng)節(jié)細胞層；INL：內(nèi)核層；ONL：外核層Figure 2 TUNEL staining of rat retinal tissues (×200，bar=75 μm) A：Red fluorescent cells were rarely observed in rat retinal tissue of normal control group B：A large number of red fluorescent cells were observed in the outer nuclear layer of retina in diabetic model group C：Few red fluorescent cells were observed in the outer nuclear layer of retina in tBHQ intervention group (Arrows indicated overlapped red and blue fluorescence) GCL：ganglion cell layer；INL：inner nuclear layer；ONL：outer nuclear layer

圖3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織細胞凋亡指數(shù)比較 F=10.04，P=0.01.與正常對照組比較，aP<0.05；與糖尿病模型組比較，bP<0.01(單因素方差分析，LSD-t檢驗，n=5) 1：正常對照組；2：糖尿病模型組；3：tBHQ干預組Figure 3 Comparison of apoptosis index of rat retinal tissue among different groups F=10.04，P=0.01.Compared with normal control group，aP<0.05；compared with diabetic model group，bP<0.01 (One-way ANOVA，LSD-t test，n=5) 1：normal control group；2：diabetic model group；3：tBHQ intervention group

2.5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織及細胞中蛋白表達情況比較

正常對照組、糖尿病模型組、tBHQ干預組大鼠視網(wǎng)膜組織p-Akt/Akt的相對表達量分別為0.76±0.11、0.52±0.10和1.14±0.31，p-eNOS/eNOS的相對表達量分別為0.83±0.06、0.52±0.08和1.03±0.13，總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=12.77，P<0.01；F=36.88，P<0.01)；與正常對照組大鼠比較，糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS相對表達量降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)；與糖尿病模型組比較，tBHQ干預組大鼠視網(wǎng)膜組織中p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS相對表達量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)(圖4)。

圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中p-Akt、Akt、p-eNOS和eNOS蛋白表達比較 A：各組p-Akt、Akt蛋白電泳條帶 B：各組p-Akt/Akt蛋白相對表達量比較 F=12.77，P<0.01.與正常對照組比較，aP<0.01；與糖尿病模型組比較，bP<0.01(單因素方差分析，LSD-t檢驗，n=9) C：各組p-eNOS、eNOS蛋白電泳條帶 D：各組p-eNOS/eNOS蛋白相對表達量比較 F=36.88，P<0.01.與正常對照組比較，aP<0.01；與糖尿病模型組比較，bP<0.01(單因素方差分析，LSD-t檢驗，n=9) 1：正常對照組；2：糖尿病模型組；3：tBHQ干預組 Akt：蛋白激酶B；eNOS：內(nèi)皮型一氧化氮合酶Figure 4 Comparison of p-Akt，Akt，p-eNOS and eNOS protein expression in rat retinal tissues among different groups A：Protein bands of p-Akt and Akt B：Comparison of the relative expression of p-Akt/Akt protein F=12.77，P<0.01.Compared with normal control group，aP<0.01；compared with diabetic model group，bP<0.01 (One-way ANOVA，LSD-t test，n=9) C：Protein bands of p-eNOS and eNOS D：Comparison of the relative expression of p-eNOS/eNOS protein F=36.88，P<0.01.Compared with normal control group，aP<0.01；compared with diabetic model group，bP<0.01 (One-way ANOVA，LSD-t test，n=9) 1：normal control group；2：diabetic model group；3：tBHQ intervention group Akt：protein kinase B；eNOS：endothelial nitric oxide synthase

正常對照組、甘露醇對照組、高糖組、tBHQ干預組和PI3K抑制劑組細胞p-Akt/Akt的相對表達量分別為0.95±0.38、0.94±0.27、0.33±0.25、1.32±0.37和0.24±0.09，p-eNOS/eNOS的相對表達量分別為0.86±0.11、0.74±0.29、0.45±0.29、1.28±0.22和0.73±0.29，總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=12.36，P<0.01；F=7.35，P<0.01)；與正常對照組比較，高糖組細胞中p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS蛋白相對表達量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均P=0.02)；與高糖組比較，tBHQ干預組細胞中p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS相對表達量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)；與tBHQ干預組比較，PI3K抑制劑組中p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS相對表達量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)(圖5)。

圖5 各組細胞中p-Akt、Akt、p-eNOS、eNOS蛋白表達比較 A：各組p-Akt、Akt蛋白電泳條帶 B：各組p-Akt/Akt蛋白相對表達量比較 F=12.36，P<0.01.與正常對照組比較，aP<0.05；與高糖組比較，bP<0.01；與tBHQ干預組比較，cP<0.01(單因素方差分析，LSD-t檢驗，n=9) C：各組p-eNOS、eNOS蛋白電泳條帶 D：各組p-eNOS/eNOS蛋白相對表達量比較 F=7.35，P<0.01.與正常對照組比較，aP<0.05；與高糖組比較，bP<0.01；與tBHQ干預組比較，cP<0.01(單因素方差分析，LSD-t檢驗，n=9) 1：正常對照組；2：甘露醇對照組；3：高糖組；4：tBHQ干預組；5：PI3K抑制劑組 Akt：蛋白激酶B；eNOS：內(nèi)皮型一氧化氮合酶Figure 5 Comparison of p-Akt，Akt，p-eNOS and eNOS protein expression in rMC-1 cell among different groups A：Protein bands of p-Akt and Akt B：Comparison of the relative expression of p-Akt/Akt protein F=12.36，P<0.01.Compared with normal control group，aP<0.05；compared with high glucose group，bP<0.01；compared with tBHQ intervention group，cP<0.01 (One-way ANOVA，LSD-t test，n=9) C：Protein bands of p-eNOS and eNOS D：Comparison of the relative expression of p-eNOS/eNOS protein F=7.35，P<0.01.Compared with normal control group，aP<0.05；compared with high glucose group，bP<0.01；compared with tBHQ intervention group，cP<0.01 (One-way ANOVA，LSD-t test，n=9) 1：normal control group；2：mannitol control group；3：high glucose group；4：tBHQ intervention group；5：PI3K inhibitor group Akt：protein kinase B；eNOS：endothelial nitric oxide synthase

3 討論

既往研究表明，tBHQ具有保護STZ誘導的糖尿病模型大鼠視網(wǎng)膜的作用，并在一定程度上降低模型大鼠的血糖，增加視網(wǎng)膜組織中HO-1、Bcl-2等抗凋亡及抗氧化應激因子的表達[9-10]。本研究結果也顯示，tBHQ干預的糖尿病大鼠血糖較糖尿病模型組顯著降低，證實了tBHQ具有對抗高血糖的作用，其機制可能是tBHQ發(fā)揮了對糖尿病模型大鼠胰島β細胞的保護作用，tBHQ干預的糖尿病模型大鼠可分泌更多的胰島素，從而達到抗高血糖的作用[11]。

臨床研究表明，DR患者出現(xiàn)眼底微血管病變之前視網(wǎng)膜功能已出現(xiàn)異常[12]，主要表現(xiàn)為色覺、對比敏感度以及暗適應能力的降低，ERG表現(xiàn)為振幅下降及潛伏期延長[13]。動物實驗也顯示糖尿病大鼠發(fā)生視網(wǎng)膜功能損害早于血管病變[14]。ERG a波和b波主要來源于視網(wǎng)膜光感受器細胞(視錐細胞、視桿細胞)及雙極細胞，反映細胞受到刺激時的電位變化。本研究結果顯示，造模后4周糖尿病模型組大鼠ERG出現(xiàn)異常，與正常對照組相比主要表現(xiàn)為a波和b波振幅下降，說明STZ誘導的糖尿病大鼠早期即出現(xiàn)ERG振幅下降，與Chesler等[15]研究發(fā)現(xiàn)的糖尿病模型大鼠早期出現(xiàn)視功能障礙的結果一致。有證據(jù)表明，tBHQ在神經(jīng)退行性病變中具有潛在的皮質(zhì)神經(jīng)元及運動神經(jīng)元的保護作用[16]。本研究結果顯示，tBHQ干預組大鼠ERG的a波和b波振幅較糖尿病模型組有所升高，推測tBHQ可在一定程度上改善糖尿病模型大鼠的視網(wǎng)膜功能，這種作用可能是tBHQ通過保護糖尿病模型大鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞產(chǎn)生的。

本研究中組織病理染色結果顯示糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜外核層及內(nèi)核層變薄、細胞排列紊亂；TUNEL染色結果顯示糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜中凋亡細胞主要位于外核層，推測已有光感受器細胞和雙極細胞受到損害，并且細胞數(shù)量減少。而tBHQ干預組大鼠視網(wǎng)膜上述情況則有所改善，說明tBHQ對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜結構及神經(jīng)細胞損害均有保護作用。各組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)結構特征及細胞凋亡情況也與ERG a波和b波振幅改變一致。

高糖誘導的氧化應激被認為是導致DR發(fā)生和發(fā)展的關鍵機制之一[17]。因此各種抑制氧化應激反應的蛋白或細胞因子對防治DR進展具有積極作用。eNOS作為機體內(nèi)催化NO合成的酶之一，其在DR發(fā)病機制中有重要作用。病理情況下，eNOS來源的NO與超氧陰離子(O2-)反應，形成過氧亞硝酸鹽(ONOO-)，誘導細胞發(fā)生氧化應激反應，進而發(fā)生細胞凋亡，同時增強血管通透性[18]；大量的氧化產(chǎn)物可導致eNOS解偶聯(lián)及失活，導致氧化應激的惡性循環(huán)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型大鼠視網(wǎng)膜組織中及高糖培養(yǎng)的細胞中磷酸化eNOS表達下降，提示高糖狀態(tài)下eNOS存在失活，可能介導DR過程中高糖導致的視網(wǎng)膜結構和功能損害；在使用tBHQ干預的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜或高糖細胞中發(fā)現(xiàn)，磷酸化eNOS表達升高。Chen等[20]研究表明，eNOS ser1179位點磷酸化能提高eNOS對輔因子(L-精氨酸、BH4)的親和力，改善病理情況下的eNOS解偶聯(lián)，減少eNOS失活，提示tBHQ具有促進或恢復eNOS活性的作用，并可能由此發(fā)揮抗視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡及抗氧化應激的作用。

eNOS的上游信號通路PI3K/Akt可介導人類多種疾病，包括癌癥、糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)疾病[21-22]。既往研究表明，Akt ser473位點被磷酸化后，可激發(fā)Akt的完全酶活性，通過抑制促凋亡蛋白(如Bad)或抑制促凋亡信號(Foxo)實現(xiàn)調(diào)節(jié)作用[23]。在DR的發(fā)病過程中，PI3K/Akt通路被抑制，Akt磷酸化表達水平顯著降低，下游凋亡級聯(lián)反應被激活，引起視網(wǎng)膜神經(jīng)元的氧化應激損傷和凋亡[24]。本研究中結果顯示，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織和高糖培養(yǎng)的細胞中磷酸化Akt表達降低，而tBHQ干預的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜或高糖細胞中磷酸化Akt表達升高，表明tBHQ可能通過促進Akt蛋白ser473位點的磷酸化，使Akt活化，發(fā)揮對DR中視網(wǎng)膜的保護作用。進一步探討tBHQ的保護作用機制發(fā)現(xiàn)，PI3K抑制劑組細胞中磷酸化Akt和磷酸化eNOS表達水平較tBHQ干預組下降，表明tBHQ的促進Akt和eNOS磷酸化作用可被PI3K抑制劑阻斷，但其確切的機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究結果表明tBHQ可能通過PI3K活化Akt/eNOS途徑對早期糖尿病模型大鼠視網(wǎng)膜結構和功能發(fā)揮保護作用，為tBHQ及其衍生制品防治DR視網(wǎng)膜損傷提供了理論依據(jù)，對早期DR的防治具有重要意義。但因為視網(wǎng)膜結構的復雜性及細胞的多樣性，本研究中未對視網(wǎng)膜細胞間相互作用進行實驗，并且尚缺乏tBHQ通過Akt介導的eNOS ser1179磷酸化的直接證據(jù)，有待后續(xù)的研究進一步探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明王娟：參與選題與實驗設計、實驗操作、數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計分析、論文撰寫及修改；韋芳：參與實驗設計、實驗指導與實驗操作；曹陽、田敏：參與實驗選題、實驗設計、實驗指導；呂紅彬：參與實驗選題、實驗指導、論文修改及定稿