劉文蘭 王莉 楊揚(yáng) 閆瑾 何媛

1西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，西安 710021；2西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科，西安 710077

糖尿病是一種嚴(yán)重危害人類健康的內(nèi)分泌疾病，其在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率呈上升趨勢。糖尿病性白內(nèi)障(diabetic cataract，DC)是糖尿病患者的主要眼部并發(fā)癥之一，其發(fā)病年齡較早，進(jìn)展較快[1-2]。糖尿病患者的白內(nèi)障發(fā)病率是非糖尿病人群的2～5倍，成為導(dǎo)致視力損害的主要原因[3]。研究表明晶狀體上皮細(xì)胞凋亡在白內(nèi)障的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[4]；此外，人晶狀體細(xì)胞主要通過自噬降解衰老的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)以維持晶狀體的透明度[5]。高糖誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡可能是DC形成的原因之一，但是具體的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為21～23個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，通過靶向mRNA分子的3'-非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)，以mRNA降解或翻譯抑制的方式沉默基因表達(dá)[6-7]。越來越多的研究表明miRNA在白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，如先天性白內(nèi)障、后發(fā)性白內(nèi)障以及DC[8-10]。miR-23b-3p已被證實在晶狀體組織中高度表達(dá)[11]，然而miR-23b-3p是否參與DC的發(fā)病仍不清楚。因此，本研究擬探討miR-23b-3p對高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞自噬和凋亡的調(diào)節(jié)作用，為DC的防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本及細(xì)胞來源 收集2019年9月至2020年10月在西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院行白內(nèi)障手術(shù)的DC患者30例30眼和單純白內(nèi)障患者30例30眼的晶狀體前囊膜組織，分別作為DC組和單純白內(nèi)障組，置于凍存管中液氮保存?zhèn)溆?。DC組中男19例19眼，女11例11眼，年齡61～81歲，平均(64.1±6.9)歲。對照組中男17例17眼，女13例13眼，年齡61～79歲，平均(62.2±9.2)歲。DC患者診斷為2型糖尿病，術(shù)前空腹血糖<7.8 mmol/L，病程為4～7年；單純白內(nèi)障患者為無糖尿病病史的白內(nèi)障患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)除糖尿病外其他原因造成的白內(nèi)障患者；(2)合并青光眼、玻璃體積血等其他眼部疾病者；(3)患者臨床資料不完善、不配合治療者；(4)有嚴(yán)重心、腦、肝、腎功能障礙者。2個組患者性別構(gòu)成比、年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。本研究方案經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)(批文號：LSL2019037)。每位患者及家屬均被告知實驗?zāi)康牟⒑炇鹬橥鈺Ｈ司铙w上皮細(xì)胞系HLEB3來自中國科學(xué)院ATCC細(xì)胞庫。

1.1.2主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(美國Sigma公司)；Trizol試劑、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)；TaqMan microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)；PrimeScript RT-PCR試劑盒、SYBR Green試劑盒(日本Takara公司)；RIPA裂解液(上海碧云天公司)；BCA蛋白含量測定試劑盒(美國Thermo公司)；ECL試劑盒(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)；兔抗人原鈣黏附蛋白17(protocadherin 17，PCDH17)抗體(HPA026817)(美國Sigma公司)；兔抗人c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)抗體(ab199380)、兔抗人磷酸化(p-)JNK抗體(ab47337)、兔抗人c-Jun抗體(ab40766)、兔抗人p-c-Jun抗體(ab32385)、兔抗人微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3B)抗體(ab192890)、兔抗人哺乳動物ATG6同源蛋白(a mammalian homolog of yeast Atg6/Vps30，Beclin-1)抗體(ab207612)、兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體(ab32503)、兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體(ab32124)、山羊抗兔二抗(ab205718)(美國Abcam公司)；雙熒光素酶報告基因載體pGL3、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega公司)；miR-23b-3p擬似物、陰性對照(negative control，NC)擬似物(深圳華大基因公司)。紫外分光光度計(美國Lab Tech公司)；實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；Thermo VarioskanTMLUX多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國賽默飛世爾公司)；倒置普通光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；電子顯微鏡(日本電子JEOL公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 將人晶狀體上皮細(xì)胞系HLEB3接種于DMEM/F12培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%青霉素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鏈霉素)6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到80%融合時，棄掉培養(yǎng)液，將其分為正常對照組和高糖組，分別于含5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基和含25 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基中37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。隨后取高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞，隨機(jī)分為miR-23b-3p擬似物組、NC擬似物組、NC-siRNA組、PCDH17-siRNA組、miR-23b-3p擬似物+Vector組、miR-23b-3p擬似物+pcDNA-PCDH17組，根據(jù)LipofectamineTM2000試劑盒說明書分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)實驗。

1.2.2實時熒光定量PCR法檢測各組細(xì)胞中miR-23b-3p、PCDH17相對表達(dá)量 收集前囊膜組織及轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，使用Trizol試劑提取總RNA，采用紫外分光光度計測定提取的RNA濃度和純度。根據(jù)PrimeScript RT-PCR試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，檢測miR-23b-3p表達(dá)時，按照TaqMan microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green進(jìn)行熒光定量PCR。miR-23b-3p正向引物序列為5'-GAGCATCACATTGCCAG GG-3'，反向引物序列為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6正向引物序列為5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物序列為5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；PCDH17正向引物序列為5'-CTTGCCGATGTTGCCTA T-3'，反向引物序列為5'-CCATCTGTTGCTGCTTTC-3'；GAPDH正向引物序列為5'-TGACTTCAACAGCGACA CCCA-3'，反向引物序列為5'-CACCCTGTTGCTGTAGC CAAA-3'。引物均由大連Takara公司設(shè)計合成。PCR反應(yīng)體積為25 μl，引物1 μl，cDNA 2 μl。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火及延伸30 s，共40個循環(huán)。GAPDH和U6分別作為mRNA和miRNA的內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算每個樣本中目標(biāo)基因的相對表達(dá)量。

1.2.3雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證miR-23b-3p與靶基因PCDH17的關(guān)系 將含有miR-23b-3p結(jié)合位點(diǎn)的野生型(wild type，WT)和突變型(mutant type，MUT)PCDH17 3'-UTR克隆到pGL3載體中，得到熒光素酶報告載體。將細(xì)胞以1×104/ml的密度接種至96孔板中，分為NC擬似物組、miR-23b-3p擬似物組，待細(xì)胞密度達(dá)到70%融合時，將WT和MUT PCDH17分別與miR-23b-3p擬似物、NC擬似物共轉(zhuǎn)染到各組細(xì)胞中，放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用雙熒光素酶分析系統(tǒng)檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性。設(shè)置3個復(fù)孔，取平均值，實驗重復(fù)3次。

1.2.4Western blot法檢測各組細(xì)胞中JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、LC3B、Beclin-1、Bax及Bcl-2蛋白表達(dá) 收集各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解液提取蛋白，使用BCA蛋白分析試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度。取30 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，并轉(zhuǎn)印至甲醇活化的PVDF膜，用5%脫脂奶粉在室溫條件下封閉PVDF膜1 h；加入JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、LC3B、Beclin-1、Bax、Bcl-2、GAPDH一抗(均1∶ 1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次；加入相應(yīng)二抗(1∶ 2 000)37 ℃孵育1 h，TBST漂洗3次；采用ECL試劑盒進(jìn)行顯色，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測，使用ImageJ軟件對條帶進(jìn)行量化分析。以GAPDH作為內(nèi)參照，計算各目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測HLEB3細(xì)胞凋亡率 取正常對照組、高糖組、miR-23b-3p擬似物組、NC擬似物組、NC-siRNA組、PCDH17-siRNA組轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗2次；調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至1×105個/孔，加入195 μl的Annexin V-FITC結(jié)合液，反復(fù)輕輕吹打細(xì)胞，用移液管將細(xì)胞充分混合成單細(xì)胞懸液。在單細(xì)胞懸液中加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的碘化丙啶，混合均勻，放入暗盒中孵育10 min。將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞儀專用離心管中，流式細(xì)胞儀上樣檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 單純白內(nèi)障組和DC組前囊膜組織中miR-23b-3p相對表達(dá)量比較

DC組患者晶狀體組織中miR-23b-3p相對表達(dá)量為0.35±0.15，明顯低于單純白內(nèi)障組患者的1.00±0.09，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=44.627，P<0.01)(圖1)。

圖1 各組患者前囊膜組織中miR-23b-3p相對表達(dá)量比較 與單純白內(nèi)障組比較，aP<0.01(獨(dú)立樣本t檢驗，n=30) miR：微小RNA；DC：糖尿病性白內(nèi)障Figure 1 Comparison of the relative expression level of miR-23b-3p in anterior capsular membrane between two groups Compared with simple cataract group，aP<0.01 (Independent samples t test，n=30) miR：microRNA；DC：diabetic cataract

表1 各組細(xì)胞中miR-23b-3p相對表達(dá)量比較(x±s)Table 1 Comparison of relative expression of miR-23b-3pamong different groups (x±s)組別樣本量miR-23b-3p相對表達(dá)量正常對照組31.00±0.11高糖組30.39±0.08aNC擬似物組30.42±0.07miR-23b-3p擬似物組31.63±0.16bF值21.325P值<0.001 注:與正常對照組比較,aP<0.05;與NC擬似物組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) miR:微小RNA;NC:陰性對照 Note:Compared with normal control group,aP<0.05;compared with NC mimics group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) miR:microRNA;NC:negative control

2.2 各miRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-23b-3p相對表達(dá)量及細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)蛋白比較

正常對照組、高糖組、NC擬似物組、miR-23b-3p擬似物組細(xì)胞中miR-23b-3p及LC3B Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、細(xì)胞凋亡率、Bcl-2、Bax蛋白相對表達(dá)量總體比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=21.325，P<0.001；F=28.318，P=0.002；F=17.634，P=0.007；F=26.537，P=0.003；F=15.482，P=0.001；F=22.325，P<0.001)。與正常對照組比較，高糖組中miR-23b-3p表達(dá)量顯著降低，細(xì)胞凋亡率升高，LC3B Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin-1以及Bax蛋白表達(dá)量顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；與NC擬似物組比較，miR-23b-3p擬似物組細(xì)胞中miR-23b-3p表達(dá)量顯著升高，細(xì)胞凋亡率降低，LC3 Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin-1以及Bax蛋白表達(dá)量顯著下降，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(圖2，表1、2)。

圖2 各組細(xì)胞凋亡率以及凋亡、自噬蛋白的表達(dá) A：各組細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖 B：各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖 C：各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖 1：正常對照組；2：高糖組；3：NC擬似物組；4：miR-23b-3p擬似物組 NC：陰性對照；miR：微小RNA；Bcl-2：B淋巴細(xì)胞瘤-2；Bax：B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；LC3B：微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；Beclin-1：哺乳動物ATG6同源蛋白Figure 2 Apoptosis rate and expression of apoptotic and autophagy-related proteins in different groups A：Flow cytometry of cell apoptosis B：Electrophoretogram of apoptotic proteins C：Electrophoretogram of autophagy-related proteins 1：normal control group；2：high glucose group；3：NC mimics group；4：miR-23b-3p mimics group NC：normal control；miR：microRNA；Bcl-2：B-cell lymphoma-2；Bax：Bcl-2 associated X protein；GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；LC3B：microtubule-associated protein 1 light chain 3；Beclin-1：a mammalian homolog of yeast Atg6/Vps30

2.3 miR-23b-3p靶向結(jié)合PCDH17驗證

生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-23b-3p直接靶向結(jié)合PCDH17 3'-UTR。miR-23b-3p擬似物組WT-PCDH17熒光素酶活性為1.00±0.11，明顯低于NC擬似物組的0.42±0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.306，P=0.004)；miR-23b-3p擬似物組與NC擬似物組MUT-PCDH17熒光素酶活性分別為1.00±0.09和0.98±0.08，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.314，P=0.952)。miR-23b-3p擬似物組細(xì)胞中PCDH17 mRNA相對表達(dá)量為0.41±0.04，明顯低于NC擬似物組的1.00±0.09，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.483，P=0.001)(圖3)。

圖3 miR-23b-3p靶向PCDH17驗證 A：miR-23b-3p與野生型PCDH17基因存在靶向結(jié)合位點(diǎn) B：各組細(xì)胞野生型熒光素酶活性比較 與NC擬似物組比較，aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗，n=3) C：各組細(xì)胞突變型熒光素酶活性比較 與NC擬似物組比較，P=0.952(獨(dú)立樣本t檢驗，n=3) D：各細(xì)胞轉(zhuǎn)染組PCDH17 mRNA相對表達(dá)量比較 與NC擬似物組比較，aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗，n=3) WT：野生型；PCDH17：原鈣黏附蛋白17；miR：微小RNA；MUT：突變型；NC：陰性對照Figure 3 Validation of miR-23b-3p targeting PCDH17 A：Targeted binding sites of miR-23b-3p and wild-type PCDH17 B：Comparison of wild luciferase activity between two groups Compared with NC mimics group，aP<0.05 (Independent samples t test，n=3) C：Comparison of mutant luciferase activity between two groups Compared with NC mimics group，P=0.952 (Independent samples t test，n=3) D：Comparison of the relative expression of PCDH17 mRNA between different transfection groups Compared with NC mimics group，aP<0.05 (Independent samples t test，n=3) WT：wild type；PCDH17：protocadherin 17；miR：microRNA；MUT：mutant type；NC：negative control

2.4 各siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中PCDH17 mRNA相對表達(dá)量比較

正常對照組、高糖組、NC-siRNA組、PCDH17-siRNA組細(xì)胞中PCDH17 mRNA相對表達(dá)量分別為1.00±0.04、3.42±0.16、3.35±0.13和1.42±0.09，總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=41.183，P=0.001)；其中高糖組細(xì)胞中PCDH17 mRNA相對表達(dá)量高于正常對照組，PCDH17-siRNA組細(xì)胞中PCDH17 mRNA相對表達(dá)量低于NC-siRNA組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(圖4)。

圖4 各組細(xì)胞中PCDH17 mRNA相對表達(dá)量比較 F=41.183，P=0.001.與正常對照組比較，aP<0.05；與NC-siRNA組比較，bP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗，n=3) PCDH17：原鈣黏附蛋白17；NC：陰性對照Figure 4 Comparison of the relative expression level of PCDH17 mRNA among different groups F=41.183，P=0.001.Compared with normal control group，aP<0.05；compared with NC-siRNA group，bP<0.05 (One-way ANOVA，LSD-t test，n=3) PCDH17：protocadherin 17；NC：negative control

2.5 各siRNA轉(zhuǎn)染組凋亡率、細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較

與NC-siRNA組相比，PCDH17-siRNA組細(xì)胞凋亡率降低，LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin-1以及Bax蛋白相對表達(dá)量顯著下降，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.116，P=0.001；t=12.413，P=0.004；t=5.349，P=0.006；t=3.273，P=0.001;t=8.419，P<0.001)(圖5，表3)。

圖5 各組細(xì)胞凋亡及自噬和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況 A：各組細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖 B：各組自噬和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖 NC：陰性對照；PCDH17：原鈣黏附蛋白17；siRNA：小干擾RNA；Bax：B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白；Beclin-1：哺乳動物ATG6同源蛋白；LC3B：微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；Bcl-2：B淋巴細(xì)胞瘤-2；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶Figure 5 Cell apoptosis and the expression of autophagy- and apoptosis-related proteins in two groups A：Flow cytometry of cell apoptosis B：Electrophoretogram of autophagy- and apoptosis-related proteins NC：normal control；PCDH17：protocadherin 17；siRNA：small interfering RNA;Bax：Bcl-2 associated X protein；Beclin-1：a mammalian homolog of yeast Atg6/Vps30；LC3B：microtubule-associated protein 1 light chain 3；Bcl-2：B-cell lymphoma-2；GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

表2 各組細(xì)胞中自噬與凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)量及凋亡率比較(x±s)Table 2 Comparison of apoptosis rate and the relative expression levels of autophagy-related and apoptotic protein amongdifferent groups (x±s)組別樣本量LC3B Ⅱ/ⅠBeclin-1Bcl-2Bax凋亡率(%)正常對照組31.02±0.061.00±0.051.24±0.071.01±0.084.49±0.69高糖組33.12±0.13a2.89±0.04a0.53±0.013.47±0.22a19.18±1.13aNC擬似物組33.01±0.092.82±0.110.51±0.033.29±0.1620.61±1.05miR-23b-3p擬似物組31.76±0.12b1.41±0.03b1.04±0.021.54±0.13b5.83±0.52bF值28.31817.63415.48222.32526.537P值0.0020.0070.001<0.0010.003 注:與正常對照組比較,aP<0.05;與NC擬似物組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) LC3B:微管相關(guān)蛋白1輕鏈3;Beclin-1:哺乳動物ATG6同源蛋白;Bcl-2:B淋巴細(xì)胞瘤-2;Bax:B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白;NC:陰性對照;miR:微小RNA Note:Compared with normal control group,aP<0.05;compared with NC mimics group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) LC3B:mi-crotubule-associated protein 1 light chain 3;Beclin-1:a mammalian homolog of yeast Atg6/Vps30;Bcl-2:B-cell lymphoma-2;Bax:Bcl-2 associated X protein;NC:negative control;miR:microRNA

2.6 各共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中JNK通路蛋白以及自噬和凋亡蛋白比較

NC擬似物組、miR-23b-3p擬似物組、miR-23b-3p擬似物+Vector組、miR-23b-3p擬似物+pcDNA-PCDH17組細(xì)胞中p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、LC3B Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Bcl-2、Bax蛋白相對表達(dá)量總體比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=24.724，P=0.004；F=19.319，P=0.008；F=23.418，P=0.009；F=17.562，P=0.011；F=20.263，P=0.001；F=15.249，P=0.005)；其中與NC擬似物組比較，miR-23b-3p擬似物組細(xì)胞中p-JNK/JNK比值和p-c-Jun/Jun比值顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；與miR-23b-3p擬似物+Vector組比較，miR-23b-3p擬似物+pcDNA-PCDH17組細(xì)胞中p-JNK/JNK比值和p-c-Jun/c-Jun比值升高，LC3B Ⅱ/Ⅰ比值和Beclin-1以及Bax蛋白相對表達(dá)量顯著升高，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(圖6，表4)。

表3 各siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中自噬與凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)量及凋亡率比較(x±s)Table 3 Comparison of apoptosis rate and the relative expression levels of autophagy-related and apoptotic proteinsbetween different siRNA-transfected groups (x±s)組別樣本量LC3B Ⅱ/ⅠBeclin-1Bcl-2Bax凋亡率(%)NC-siRNA組31.00±0.091.00±0.061.00±0.121.00±0.1024.05±1.48PCDH17-siRNA組30.35±0.030.39±0.043.11±0.280.41±0.046.31±0.55t值12.4135.3498.4193.2739.116P值0.0040.006<0.0010.0010.001 注:(獨(dú)立樣本t檢驗) LC3B:微管相關(guān)蛋白1輕鏈3;Beclin-1:哺乳動物ATG6同源蛋白;Bcl-2:B淋巴細(xì)胞瘤-2;Bax:B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白;NC:陰性對照;PCDH17:原鈣黏附蛋白17;siRNA:小干擾RNA Note:(Independent samples t test) LC3B:microtubule-associated protein 1 light chain 3;Beclin-1:a mammalian homolog of yeast Atg6/Vps30;Bcl-2:B-cell lymphoma-2;Bax:Bcl-2 associated X protein;NC:negative control;PCDH17:protocadherin 17;siRNA:small interfering RNA

圖6 各共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中JNK通路蛋白以及自噬和凋亡蛋白表達(dá)電泳圖 與NC擬似物組比較，miR-23b-3p擬似物組細(xì)胞中p-JNK、p-c-Jun、LC3B Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1以及Bax蛋白表達(dá)條帶較窄，強(qiáng)度較弱，Bcl-2蛋白條帶較寬，強(qiáng)度較強(qiáng)；與miR-23b-3p擬似物+Vector組比較，miR-23b-3p擬似物+pcDNA-PCDH17組細(xì)胞中p-JNK、p-c-Jun、LC3B Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1以及Bax蛋白表達(dá)條帶較寬，強(qiáng)度較強(qiáng)，Bcl-2蛋白條帶較窄，強(qiáng)度較弱 1：NC擬似物組；2：miR-23b-3p擬似物組；3：miR-23b-3p擬似物+Vector組；4：miR-23b-3p擬似物+pcDNA-PCDH17組 LC3B：微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；Beclin-1：哺乳動物ATG6同源蛋白；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；Bax：B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白；Bcl-2：B淋巴細(xì)胞瘤-2；JNK：c-Jun氨基末端激酶Figure 6 Electrophoretogram of JNK pathway proteins，autophagy-related and apoptotic proteins in different co-transfection groups Compared with NC mimics group，the expression bands of p-JNK，p-c-Jun，LC3B Ⅱ/Ⅰ，Beclin-1 and Bax were narrower and weaker，while the expression band of Bcl-2 was wider and stronger in miR-23b-3p mimics group；compared with miR-23b-3p mimics+Vector group，the expression bands of p-JNK，p-c-Jun，LC3B Ⅱ/Ⅰ，Beclin-1 and Bax were wider and stronger while the expression band of Bcl-2 was narrower and weaker in miR-23b-3p mimics+pcDNA-PCDH17 group 1:NC mimics group;2:miR-23b-3p mimics group;3:miR-23b-3p mimics+Vector group;4：miR-23b-3p mimics+pcDNA-PCDH17 group LC3B：microtubule-associated protein1 light chain 3；Beclin-1：a mammalian homolog of yeast Atg6/Vps30；GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；Bax：Bcl-2 associated X protein；Bcl-2：B-cell lymphoma-2；JNK：c-Jun N-terminal kinases

表4 各共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中不同蛋白相對表達(dá)量比較(x±s)Table 4 Comparison of relative expression level of different proteins among co-transfection groups (x±s)組別樣本量p-JNK/JNKp-c-Jun/JunLC3B Ⅱ/ⅠBeclin-1Bcl-2BaxNC擬似物組31.01±0.021.00±0.061.00±0.051.00±0.081.00±0.021.00±0.03miR-23b-3p擬似物組30.43±0.03a0.31±0.01a0.33±0.03a0.39±0.04a3.14±0.13a0.31±0.01amiR-23b-3p擬似物+Vector組30.41±0.010.33±0.020.35±0.020.40±0.013.11±0.080.35±0.03miR-23b-3p擬似物+pcDNA-PCDH17組30.91±0.08b0.93±0.05b0.93±0.07b0.95±0.06b1.42±0.06b0.96±0.07bF值24.72419.31923.41817.56220.26315.249P值0.0040.0080.0090.0110.0010.005 注:與NC擬似物組比較,aP<0.05;與miR-23b-3p擬似物+Vector組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) JNK:c-Jun氨基末端激酶;LC3B:微管相關(guān)蛋白1輕鏈3;Beclin-1:哺乳動物ATG6同源蛋白;Bcl-2:B淋巴細(xì)胞瘤-2;Bax:B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白;NC:陰性對照;miR:微小RNA;PCDH17:原鈣黏附蛋白17 Note:Compared with NC mimics group,aP<0.05;Compared with miR-23b-3p mimic+Vector group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) JNK:c-Jun N-terminal kinases;LC3B:microtubule-associated protein 1 light chain 3;Beclin-1:a mammalian homolog of yeast Atg6/Vps30;Bcl-2:B-cell lymphoma-2;Bax:Bcl-2 associated X protein;NC:negative control;miR:microRNA;PCDH17:protocadherin 17

3 討論

miRNA廣泛參與細(xì)胞凋亡、增生、分化及應(yīng)激反應(yīng)等，其異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。研究報道m(xù)iRNA在白內(nèi)障發(fā)展過程中異常表達(dá)，其在DC形成的機(jī)制研究中也受到越來越多的關(guān)注[12-13]。目前研究表明，miR-23b-3p在多種組織細(xì)胞中具有重要作用，可能抑制骨肉瘤細(xì)胞的增生和侵襲，并通過下調(diào)SIX1促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。miR-23b-3p通過調(diào)控HS6ST2激活骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞中的p38 MAPK促進(jìn)基質(zhì)降解[15]。miR-23b通過靶向肌醇多磷酸多激酶(inositol phosphate multikinase，IPMK)抑制神經(jīng)炎癥，在腦溢血患者中起保護(hù)作用[16]。此外，Zhao等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-23b-3p通過SIRT1依賴性信號通路調(diào)節(jié)糖尿病視網(wǎng)膜病變中高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞代謝。在年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜組織中，circZNF292可通過海綿吸附miR-23b-3p調(diào)控晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡[18]。目前miR-23b-3p在DC中的作用及機(jī)制尚不清楚。本研究中采用高糖培養(yǎng)HLEB3細(xì)胞作為DC模型，研究miR-23b-3p在DC中的作用機(jī)制。

晶狀體上皮細(xì)胞的功能改變被認(rèn)為是白內(nèi)障發(fā)生的細(xì)胞基礎(chǔ)。最近的研究表明，晶狀體上皮細(xì)胞凋亡和自噬在白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。有研究顯示，晶狀體上皮細(xì)胞凋亡可能是DC形成的始動因素[19-20]。自噬溶酶體途徑對維持晶狀體透明至關(guān)重要。大量研究證實自噬在多種類型的白內(nèi)障發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用[21-22]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3亞家族LC3B是參與自噬形成的重要泛素化系統(tǒng)，是細(xì)胞自噬水平的重要評價標(biāo)準(zhǔn)。LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值常用來評估自噬水平。Beclin-1主要參與自噬的起始階段，是評價自噬水平的重要標(biāo)志物之一。先前的研究表明，高濃度葡萄糖可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬[23]。本研究結(jié)果也顯示，在高糖條件下培養(yǎng)的晶狀體上皮細(xì)胞中LC3B及Beclin-1表達(dá)升高，促凋亡蛋白Bax表達(dá)顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降，細(xì)胞出現(xiàn)自噬和凋亡。PCDH17屬于原鈣粘蛋白基因家族，已被證明與細(xì)胞凋亡和自噬有關(guān)[24-26]。目前尚無文獻(xiàn)報道PCDH17在DC中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下HLEB3細(xì)胞中PCDH17 mRNA表達(dá)升高，沉默PCDH17表達(dá)后細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡水平均顯著下降，推測PCDH17在DC中可能具有重要作用。但本研究未進(jìn)行PCDH17蛋白水平的檢測，在之后的研究中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注PCDH17在DC中的作用機(jī)制。此外，有研究表明自噬和凋亡之間具有復(fù)雜的相互作用，激活自噬可促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活，抑制自噬可降低視神經(jīng)退行性病變過程中細(xì)胞的存活[27]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)DC形成過程中細(xì)胞凋亡與自噬均發(fā)生顯著變化，然而自噬與細(xì)胞凋亡的關(guān)系尚不清楚，仍有待進(jìn)一步研究。

本研究還探索了miR-23b-3p對高糖誘導(dǎo)的HLEB3細(xì)胞中JNK信號通路的潛在影響。JNK屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，可結(jié)合磷酸化c-Jun的轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域，在調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬中發(fā)揮重要作用[28-29]。在本研究中，miR-23b-3p過表達(dá)使p-JNK/JNK比值和p-c-Jun/Jun比值顯著降低，而PCDH17過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)這一結(jié)果，說明在高糖誘導(dǎo)的HLEB3細(xì)胞中，miR-23b-3p通過調(diào)控PCDH17抑制了JNK信號通路的激活。

綜上所述，miR-23b-3p通過靶向PCDH17抑制JNK通路，促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的HLEB3細(xì)胞自噬和凋亡。以上結(jié)果為DC發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制提供了新的見解，同時為miR-23b-3p成為DC治療的靶點(diǎn)提供了實驗依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明劉文蘭：參與研究選題，研究設(shè)計，研究實施，論文撰寫、修改及定稿；王莉：參與研究設(shè)計、數(shù)據(jù)分析、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱；楊揚(yáng)：參與研究實施、數(shù)據(jù)采集與分析、論文修改；閆瑾：參與數(shù)據(jù)采集與分析、論文修改；何媛：參與研究實施、資料收集