朱昭穎,郭盛,武文星,趙晶晶,劉睿,尚爾鑫,段金廒

(南京中醫(yī)藥大學(xué)/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用研究重點(diǎn)研究室,江蘇 南京 210023)

山羊角為?？苿游锷窖駽aprahirusLinnaeus的角,作為藥用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,目前主要作為地方習(xí)用藥材用于治療小兒驚厥、高熱神昏等疾病[1]。也有研究提示,山羊角可作為珍稀瀕危藥材羚羊角的類效資源,具有安全無毒、資源豐富的優(yōu)勢[2]。山羊角現(xiàn)已納入多個省市的地方藥材標(biāo)準(zhǔn),但僅收載性狀鑒別和顯微鑒別等常規(guī)鑒別方法[3-4],尚少見相關(guān)活性組分的分析評價。

現(xiàn)代研究表明,山羊角含有蛋白質(zhì)類、肽類、氨基酸類、核苷類[5]、巰基類[6]、無機(jī)元素類等化學(xué)成分,具有抗驚厥[7]、解熱[8]、鎮(zhèn)靜、降血壓[9]、抗病毒等藥理作用。我國山羊品種豐富,其中60個品種的山羊可產(chǎn)角[10],且適生能力強(qiáng),分布范圍遍及全國。2021年我國山羊存欄量達(dá)13 345.2萬只,其中：華北地區(qū)內(nèi)蒙古存欄數(shù)為1 629.3萬只,為山羊及其附加產(chǎn)品的主要產(chǎn)區(qū)；華東地區(qū)山東、江蘇山羊存欄數(shù)均大于500萬只；西南地區(qū)四川、云南山羊存欄數(shù)大于1 000萬只[11]。

據(jù)此,本研究以不同產(chǎn)地山羊角為研究對象,對其水溶性蛋白、氨基酸類、核苷類、含巰基化合物及無機(jī)元素等功效物質(zhì)含量進(jìn)行分析,并在此基礎(chǔ)上對其產(chǎn)地差異進(jìn)行評價,以期較為系統(tǒng)地闡明不同產(chǎn)地山羊角中資源性化學(xué)成分的組成與含量差異,為其藥用價值的揭示提供數(shù)據(jù)支持,為藥用山羊角產(chǎn)區(qū)選擇提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters ACQUITY UPLC系統(tǒng)(包括四元泵溶劑系統(tǒng),在線脫氣機(jī)和自動進(jìn)樣器，美國Waters公司)；Xevo TQ檢測器(美國Waters公司);MassLynxTM質(zhì)譜工作站軟件(美國Waters公司);NEXION 350D電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國Perkin Elmer公司);Enspive多功能酶標(biāo)儀(美國Perkln Elmer公司);DHG-9070電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);VX-Ⅱ多管渦旋振蕩器(北京踏錦科技有限公司);D3024R高速冷凍離心機(jī)(大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司);BT125D電子分析天平(德國Sartorius公司);QY-2B中藥切片機(jī)(溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司);FMS小型氣流式超細(xì)粉碎機(jī)(北京錕捷玉誠機(jī)械設(shè)備有限公司);Milli-Q純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2 試劑

對照品:L-精氨酸(批號：20090318)、L-苯丙氨酸(批號：20090316)、L-谷氨酸(批號：20090316)、L-纈氨酸(批號：20090318)、L-組氨酸(批號：20090110)均購自上?；菖d生化試劑有限公司;L-谷氨酰胺(批號：C11144809)、L-賴氨酸(批號：C10914803)、L-異亮氨酸(批號：C11435950)、L-天冬氨酸(批號：C11512944)、L-色氨酸(批號：C11475362)、L-絲氨酸(批號：C11583738)、L-酪氨酸(批號：C10874374)、L-亮氨酸(批號：C11495324)、L-蘇氨酸(批號：C11584158)、L-半胱氨酸(批號：C11768775)均購自上海麥克林生化科技有限公司;胸苷(批號：1001182663)、胞苷(批號：1446223)、肌苷(批號：086K1243)、胸腺嘧啶(批號：1000735425)、鳥苷(批號：119K15841V)、次黃嘌呤(批號：101K0022)、L-瓜氨酸(批號：BCBC7694)、γ-氨基丁酸(批號：BCBD3661V)均購自西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司;2′-脫氧腺苷(批號：101144695)、2′-脫氧肌苷(批號：1001182663)、2-氯苯丙氨酸(批號：D2029087)均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲硫氨酸(批號：F20080927)購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

硝酸(優(yōu)級純,批號：20220105)、雙氧水(優(yōu)級純,批號：180827)、硼氫化鈉(批號：20120302)購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;砷(As)、鎂(Mg)、鉻(Cr)、錳(Mn)、鐵(Fe)、鈷(Co)、鎳(Ni)、鉛(Pb)、銅(Cu)、鋅(Zn)、鎘(Cd)和錫(Sn)的多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg·mL-1，批號：GSB 04-1767-2004)；單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液磷(P，批號：GSB 04-1741-2004 a)、鈣(Ca，批號：GSB 04-1720-2004)、鈉(Na，批號：GNM-SNA-002-2013)和鉀(K，批號：GNM-SK-002-2013)均為1 000 μg·mL-1,單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液鉬(Mo)、銦(In)和銠(Rh)均為100 μg·mL-1，均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心;BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：20220723)購自北京索萊寶科技有限公司;屈臣氏蒸餾水。

甲醛溶液(批號：13080211122)購自南京化學(xué)試劑有限公司;5, 5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB,批號：C20PA6091)和1.5 mol·L-1Tris-HCl緩沖液(批號：TU1124)購自南京翼飛雪生物科技有限公司；乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物(EDTA-2Na,批號：J09GS151076)購自上海源葉生物科技有限公司。乙腈為色譜級,購自德國Merck公司;甲酸(批號：C11901830),購自美國ACS公司;甲酸銨(批號：BCBX5107)和乙酸銨(批號：BCBV8695)均購自西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司;氯化鈉(批號：A2104123)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 樣品

山羊角樣品于2021年11月至2022年2月采自江蘇、山東、內(nèi)蒙古、山西、河北、廣西、云南等省區(qū),共32批次。樣品經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定均為牛科動物山羊CaprahirusLinnaeus的角。憑證標(biāo)本存放于南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化創(chuàng)新協(xié)同中心標(biāo)本室。樣品采集后,洗凈取出骨塞,晾干后鎊片粉碎,過40目篩,密封干燥保存?zhèn)溆?樣品信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 核苷類及氨基酸類成分分析

2.1.1 對照品溶液制備 取干燥至恒質(zhì)量的27種對照品適量,精密稱定,溶于10%甲醇溶液配制成化合物1～27(表2)質(zhì)量濃度分別為0.120、0.100、0.109、0.107、0.102、0.092、0.104、0.108、0.196、0.201、0.101、0.115、0.118、0.143、0.117、0.124、0.183、0.126、0.101、0.152、0.212、0.114、0.107、0.111、0.132、0.159、0.187 mg·mL-1的混合對照品儲備液。再將混合的對照品儲備溶液稀釋到一系列適當(dāng)?shù)臐舛?搖勻,溶液經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜濾過,續(xù)濾液作為對照品溶液。精密稱定4 mg內(nèi)標(biāo)(IS)2-氯苯丙氨酸,加10%甲醇溶液配制成質(zhì)量濃度為40 μg·mL-1的IS儲備液,后稀釋至4 μg·mL-1冷藏備用。將上述系列濃度對照品溶液各吸取950 μL加入50 μL IS溶液配成含IS的系列濃度對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取樣品粉末1.0 g,精密稱定,置于25 mL具塞錐形瓶中,精密加入15 mL純水,室溫靜置過夜,室溫超聲(40 kHz)提取3次,每次40 min,稱質(zhì)量,加水補(bǔ)足減失質(zhì)量,搖勻,3 000 r·min-1離心15 min,取上清液3 mL,加乙腈9 mL,搖勻,冷藏過夜,3 000 r·min-1離心15 min。取上清液8 mL,真空離心濃縮,殘渣加1 mL 50%乙腈溶解,13 000 r·min-1離心15 min,取上清液,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過后,取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密吸取各供試品溶液950 μL加入50 μL IS溶液配成含IS的供試品溶液。

2.1.3 UHPLC-MS/MS色譜分析條件 色譜柱:ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流動相:A(含5 mmol·L-1甲酸銨、5 mmol·L-1乙酸銨和0.2%甲酸的水溶液)和B(含1 mmol·L-1甲酸銨、1 mmol·L-1乙酸銨和0.2%甲酸的乙腈溶液)。梯度洗脫程序:0～3 min,10%A;3～9 min,10%～18%A;9～15 min,18%～20%A;15～16 min,20%～46%A;16～18 min,46%A;18～20 min,46%～10%A。流速:0.40 mL·min-1,柱溫:30 ℃,進(jìn)樣量:1 μL[12]。

2.1.4 UHPLC-MS/MS質(zhì)譜分析條件 離子化模式:ESI+;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);毛細(xì)管電壓:3.0 kV;離子源溫度：150 ℃;脫溶劑氣溫度:500 ℃;脫溶劑氣流速:1 000 L·h-1;碰撞氣流量:0.15 mL·min-1;錐孔氣流量:50 L·h-1。27種被測物質(zhì)及IS質(zhì)譜參數(shù)見表2,MRM色譜圖見圖1。

2.1.5 線性關(guān)系、檢測限和定量限 按2.1.1項下方法制備不同濃度的混合對照品溶液,按2.1.3項下色譜條件和2.1.4項下質(zhì)譜條件測定混合對照品,分別以各對照品峰面積與對應(yīng)IS峰面積的比值為縱坐標(biāo)(Y),以各對照組溶液的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算相關(guān)系數(shù)(r);將峰高除以背景噪聲值作為信噪比(S/N),S/N分別為3和10時,獲得了27種化合物的檢測限(LOD)和定量限(LOQ)。線性方程、LOD和LOQ結(jié)果見表3,結(jié)果顯示r在0.998 4～1.000 0,表明各化合物在測定范圍內(nèi)線性良好。

表3 27種對照品線性關(guān)系考察

2.1.6 方法學(xué)考察 對實(shí)驗(yàn)中各成分均進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收率考察。結(jié)果顯示各成分日內(nèi)精密度RSD在1.46%～4.96%,日間精密度RSD在0.61%～4.99%;重復(fù)性試驗(yàn)RSD在1.56%～5.24%;穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD在1.75%～5.89%;平均回收率在95.41%～107.13%,RSD在1.47%～6.00%。上述結(jié)果提示本實(shí)驗(yàn)建立的分析方法可用于山羊角樣品中相關(guān)成分的分析評價。

2.1.7 樣品測定結(jié)果及分析 所測樣品中共檢測到18種游離氨基酸類成分,其中γ-氨基丁酸0.11～1.55 μg·g-1、絲氨酸20.62～213.65 μg·g-1、纈氨酸35.62～83.62 μg·g-1、蘇氨酸20.50～76.75 μg·g-1、亮氨酸33.46～80.46 μg·g-1、異亮氨酸19.25～86.04 μg·g-1、天冬酰胺0.08～1.43 μg·g-1、天冬氨酸1.98～17.36 μg·g-1、賴氨酸3.73～36.79 μg·g-1、谷氨酰胺0.05～0.33 μg·g-1、谷氨酸1.04～46.95 μg·g-1、甲硫氨酸0.53～7.64 μg·g-1、組氨酸5.49～75.82 μg·g-1、苯丙氨酸26.15～82.83 μg·g-1、精氨酸49.37～344.05 μg·g-1、瓜氨酸0.34～11.91 μg·g-1、酪氨酸36.47～125.48 μg·g-1、色氨酸5.50～25.28 μg·g-1。各產(chǎn)地氨基酸類成分含量測定結(jié)果見圖2。氨基酸類成分平均總質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)642.41 μg·g-1,其中所測8種人體必需氨基酸占總氨基酸的41.22%。不同產(chǎn)地樣本中氨基酸類成分總含量差異較大,其中江蘇南通樣品(S13)氨基酸總含量(1 023.87 μg·g-1)較高,是廣西南林樣品(S6)氨基酸總含量(331.69 μg·g-1)的3.09倍。華東地區(qū)氨基酸類成分平均含量(826.10 μg·g-1)較高,華北地區(qū)次之(550.41 μg·g-1),西南地區(qū)(405.57 μg·g-1)較低。對于不同氨基酸成分,各樣品中精氨酸(22.73%)、絲氨酸(11.63%)、酪氨酸(10.37%)占總氨基酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。

所有樣品中共檢測到9種核苷類成分,其中胞嘧啶0.44～1.03 μg·g-1、胸腺嘧啶2.51～6.21 μg·g-1、次黃嘌呤1.22～9.46 μg·g-1、胸苷0.63～17.38 μg·g-1、胞苷0.12～1.23 μg·g-1、2′-脫氧腺苷0.002～0.058 μg·g-1、2′-脫氧肌苷0.11～0.31 μg·g-1、肌苷0.19～3.06 μg·g-1、鳥苷0.13～6.91 μg·g-1。結(jié)果見圖3,核苷類成分平均總質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)20.88 μg·g-1,不同產(chǎn)地樣品中核苷類成分總含量差異較大,其中江蘇鎮(zhèn)江樣品(S14)核苷總含量(29.21 μg·g-1)較高,是內(nèi)蒙古烏審旗樣品(S26)核苷總含量(10.19 μg·g-1)的2.9倍;不同地區(qū)核苷類成分平均含量總體差異較小。各樣品中胸苷(40.73%)和次黃嘌呤(20.68%)占總核苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。

2.2 水溶性蛋白成分分析

2.2.1 對照品溶液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書中工作液配制方法配制BCA工作液。將5 mg·mL-1的BSA標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋至0.5 mg·mL-1,將稀釋的BSA標(biāo)準(zhǔn)品按0、2、4、6、8、12、16、20 μL加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)孔中,加PBS補(bǔ)足至20 μL,配成質(zhì)量濃度為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL-1的系列濃度對照品溶液。

在各蛋白標(biāo)準(zhǔn)孔加入200 μL BCA工作液,37 ℃振蕩15 min后于562 nm處測定吸光度,以BSA的濃度(mg·mL-1，X)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,水溶性蛋白的回歸方程為Y=0.874 7X+0.020 1(r=0.998 1),結(jié)果顯示水溶性蛋白在0.05～0.50 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 供試品溶液制備及測定 精密稱取樣品5 g,加入10倍量水,煎煮2次,每次煎煮4 h。合并提取液,趁熱抽濾,定容至100 mL,過0.22 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液即得,備用。精密吸取各產(chǎn)地山羊角供試溶液適量,用PBS溶液稀釋8倍,取樣品稀釋液20 μL加于96孔板的樣品測定孔中,加入200 μL BCA工作液,37 ℃振蕩15 min后于562 nm處測定吸光度,根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計算不同產(chǎn)地山羊角的水溶性蛋白含量。

2.2.3 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率試驗(yàn) 對實(shí)驗(yàn)中各種檢測方法均進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率試驗(yàn)考察。結(jié)果顯示,精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)RSD值分別為1.20%、1.77%和0.87%,加樣回收率平均值為103.33%,RSD為4.63%,表明本方法準(zhǔn)確可靠,可用于山角羊中水溶性蛋白的分析。

2.2.4 樣品含量分析 具體結(jié)果見表4,水溶性蛋白平均含量為51.07 mg·g-1,其中河北武安樣品(S22)的水溶性蛋白含量較高,云南羅平樣品(S4)的水溶性蛋白含量較低。華東地區(qū)產(chǎn)山羊角水溶性蛋白平均含量(58.79 mg·g-1)較高,華北地區(qū)產(chǎn)樣品水溶性蛋白平均含量(53.50 mg·g-1)次之,西南地區(qū)產(chǎn)樣品水溶性蛋白平均含量(28.20 mg·g-1)較低。

表4 不同產(chǎn)地山羊角水溶性蛋白含量(n=3)

2.3 含巰基化合物含量分析

2.3.1 對照品溶液的制備 取L-半胱氨酸24.2 mg,精密稱定,加水定容至10 mL配制成20.0 mmol·L-1的溶液,再用純水分別稀釋至10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.17 mmol·L-1。

2.3.2 供試品溶液的制備 同2.2.2項供試品溶液制備方法。

2.3.3 工作液的制備 精密稱定硼氫化鈉3.78 mg,溶于50%甲醇溶液,定容至10 mL,配成10.0 mmol·L-1的硼氫化鈉溶液;精密稱定氯化鈉5.85 mg,加50%甲醇溶液定容至10 mL,配成10.0 mmol·L-1的氯化鈉溶液;精密稱定EDTA-2Na固體380 mg,用Tris-HCl緩沖液(pH=8.6)溶解后,加入50 μL甲醛溶液,配成10.0 mmol·L-1的EDTA溶液; 精密稱定DTNB固體39 mg,加純甲醇溶液定容至10 mL,配成10.0 mmol·L-1的DTNB溶液[13]。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

2.3.4.1 游離巰基 精密吸取氯化鈉溶液15 μL與濃度分別為20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.17 mmol·L-1的L-半胱氨酸對照品溶液至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,振搖混勻后加入165 μL EDTA溶液,再加入15 μL DTNB溶液,室溫靜置15 min后于412 nm處測定吸光度,以-SH的濃度(1 mol的L-半胱氨酸中含有1 mol的-SH)為橫坐標(biāo)(X),吸光度為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,游離巰基的回歸方程為Y=0.148 7X+0.136 2(r=0.999 5),結(jié)果顯示游離巰基在0.16～20.00 mmol·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4.2 總巰基 精密吸取硼氫化鈉溶液15 μL與濃度分別為20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.17 mmol·L-1的對照品溶液至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,其他步驟與2.3.4.1項下相同,總巰基的回歸方程為Y=0.180 7X+0.221 5(r=0.999 8),結(jié)果顯示總巰基在0.16～20.00 mmol·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 方法學(xué)考察 對實(shí)驗(yàn)中各種檢測方法均進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率試驗(yàn)考察。結(jié)果各指標(biāo)均符合定量測定要求,具體結(jié)果見表5。

表5 含巰基類化合物含量測定方法考察結(jié)果(n=6)

2.3.6 樣品測定結(jié)果及分析 不同產(chǎn)地山羊角含巰基類化合物測定結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示,游離巰基平均含量為9.97 μmol·g-1。其中山東菏澤樣品(S19)的游離巰基含量(20.38 μmol·g-1)較高,是平均含量的2.04倍;云南昆明樣品(S1)的游離巰基含量(4.64 μmol·g-1)較低,是平均含量的0.46倍;西南地區(qū)產(chǎn)山羊角樣品游離巰基含量普遍低于華東地區(qū)及華北地區(qū),其中華東地區(qū)產(chǎn)樣品游離巰基含量(12.79 μmol·g-1)較高,是西南地區(qū)(6.15 μmol·g-1)的2.08倍、華北地區(qū)(8.60 μmol·g-1)的1.49倍。所有產(chǎn)地樣品的總巰基含量均大于游離巰基含量,總巰基的平均含量為22.48 μmol·g-1,是游離巰基平均含量的2.25倍。其中山東菏澤樣品(S19)的總巰基含量(44.48 μmol·g-1)較高,是平均含量的1.98倍;云南昆明祿勸樣品(S2)的總巰基含量(12.39 μmol·g-1)較低,是平均含量的0.55倍;不同區(qū)域樣品中總巰基平均含量規(guī)律為華東地區(qū)(28.42 μmol·g-1)>華北地區(qū)(20.28 μmol·g-1)>西南地區(qū)(12.97 μmol·g-1)。不同產(chǎn)地、不同區(qū)域樣品中總巰基與游離巰基含量變化規(guī)律一致。

2.4 無機(jī)元素類成分分析

2.4.1 對照品溶液制備 分別精密吸取各元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,用2%硝酸溶液逐級稀釋Mg、Ca、P、Na、K、Cr、Mn、Fe、Ni、Zn、Sn、Cu、Cd、Pb、As、Si、Co和Mo混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至1 000、800、400、200、100、50、25、10、5、1、0.25、0.13 ng·mL-1。In和Rh配制成質(zhì)量濃度為20 ng·mL-1的混合IS溶液。各元素的回歸方程、r以及線性范圍見表6。

表6 18種元素線性關(guān)系和方法學(xué)考察

2.4.2 供試品溶液制備 精密稱取山羊角粉末0.2 g于聚四氟乙烯消解罐中,加入5 mL硝酸、2 mL過氧化氫,靜置10 min,待反應(yīng)不劇烈,密封后放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中,于170 ℃下進(jìn)行12 h的密閉消解,待消解完全后,取出消解罐置于通風(fēng)櫥中降溫,溫度降至室溫時打開消解罐并在通風(fēng)櫥中將酸揮干,消解液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中,加2%硝酸定容至刻度,搖勻,即得供試品溶液,其中由于P、Ca、Mg、Na、K常量元素含量過高,將供試品溶液用2%硝酸稀釋1 000倍用于上述常量元素的測定。同步以5 mL硝酸、2 mL過氧化氫做空白試驗(yàn)。所有容器及量器用之前均用30%硝酸浸泡[14]。

2.4.3 測定條件 樣品溶液注入NEXION電感耦合等離子體質(zhì)譜儀進(jìn)行測定,測定條件:等離子體射頻功率1 500 W;冷卻氣流速15 L·min-1,載氣為高純氬氣,載氣流速0.8 L·min-1,輔助氣流速0.2 L·min-1,采樣深度9.5 mm;蠕動泵0.3 r·min-1,一次讀數(shù)時間5 s;進(jìn)樣延時30 s;泵速15 r·min-1。

2.4.4 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性 對實(shí)驗(yàn)中各種檢測方法均進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性試驗(yàn)考察。結(jié)果各指標(biāo)均符合定量測定要求,具體結(jié)果見表6。

2.4.5 樣品測定結(jié)果及分析 本方法測定的18種元素可分為常量元素、必須微量元素、重金屬元素。由圖5可知,在測定的5種常量元素中,Ca(21.39～34.23 mg·g-1)含量最高,Mg(1.52～4.06 mg·g-1)含量最低。不同產(chǎn)地之間,內(nèi)蒙古赤峰樣品(S25)的Ca含量最高(34.23 mg·g-1),約為平均含量的1.33倍,山東沂源樣品(S20)的Ca含量最低(21.39 mg·g-1),約為平均含量的0.83倍;內(nèi)蒙古赤峰樣品(S25)的Mg含量最高(4.06 mg·g-1),約為平均含量的1.53倍,云南昆明祿勸樣品(S2)的Mg含量最低(1.52 mg·g-1),約為平均含量的0.58倍。

由圖6可知,在測定的9種必須微量元素中,Fe(34.28～401.78 μg·g-1)和Mn(0.99～24.09 μg·g-1)含量較高,Fe在西南地區(qū)山羊角樣品中平均含量達(dá)380.14 μg·g-1,占比60.75%,遠(yuǎn)高于華東(23.06%)和華北地區(qū)(23.69%);西南地區(qū)山羊角中Mn含量(22.72 μg·g-1)是華東地區(qū)(1.25 μg·g-1)的18.50倍、華北地區(qū)(1.55 μg·g-1)的14.61倍;所測9種必須微量元素總量在西南地區(qū)(625.65 μg·g-1)最高,是華東地區(qū)(186.32 μg·g-1)的3.36倍、華北地區(qū)(257.31 μg·g-1)的2.43倍。

在測定的4種重金屬元素中,Cu(3.77～6.12 μg·g-1)平均含量最高,Pb(1.14～2.74 μg·g-1)和Cd(1.65～1.86 μg·g-1)平均含量次之,As(0.01～0.34 μg·g-1)在大部分樣品中有微量存在,具體結(jié)果見圖7。在不同產(chǎn)地樣品中,西南地區(qū)的樣品Cu、Pb、Cd元素含量遠(yuǎn)高于華東、華北地區(qū),其山羊角中重金屬總含量(10.86 μg·g-1)最高,是華東地區(qū)(6.89 μg·g-1)的1.56倍、華北地區(qū)(7.20 μg·g-1)的1.52倍。參考2020年版《中國藥典》中藥材重金屬含量限定及TraditionalChinesemedicine-determinationofheavymetalsinherbalmedicinesusedintraditionalChinesemedicine(ISO 18664-2015)[15-16],對不同產(chǎn)地山羊角藥材的重金屬含量進(jìn)行限定,其中,Pb不得超過5 mg·kg-1、As不得超過2 mg·kg-1、Cu不得超過20 mg·kg-1、Cd不得超過1 mg·kg-1,本實(shí)驗(yàn)所測所有批次山羊角中重金屬含量均符合藥典規(guī)定。

2.5 多類型資源性化學(xué)成分產(chǎn)地差異分析

為探討不同地區(qū)產(chǎn)山羊角多類型資源性化學(xué)成分含量的產(chǎn)地差異,挖掘可用于不同地區(qū)區(qū)分的潛在指標(biāo)成分,本研究將所測定的32批山羊角樣品的48種化學(xué)成分含量導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別(PLS-DA)等多變量統(tǒng)計分析。如圖8A所示,所有樣品被分為3類,在一定程度上反映了不同地區(qū)的山羊角成分存在一定的差異。來自華東和華北地區(qū)的樣品相對較近且有重合部分,來自西南地區(qū)的樣品與其他地區(qū)的樣品距離較遠(yuǎn),呈現(xiàn)完全分離狀態(tài),提示西南地區(qū)的樣品中多類型資源性化學(xué)成分整體特征與華東、華北地區(qū)樣品有較大差異。進(jìn)一步建立有監(jiān)督的PLS-DA模型,結(jié)果見圖8B,3個產(chǎn)地可以完全區(qū)分開;采用200次隨機(jī)置換檢驗(yàn)考核PLS-DA模型的適用性(圖8C),R2=0.038 8,Q2=-0.512,說明該模型未發(fā)生過擬合,是可靠的分類判別模型[17];根據(jù)VIP值結(jié)合PLS-DA載荷圖,圖8D表明絲氨酸、Si、胸苷、Mn、Fe、Cu、Ca、天冬酰胺、蘇氨酸和游離巰基等成分的VIP均大于1,為組間主要差異貢獻(xiàn)成分。

根據(jù)上述PCA結(jié)果,以主成分特征值大于1為標(biāo)準(zhǔn),挑選出6個主成分,特征值分別為12.2、3.62、2.89、2.28、1.79、1.68,方差貢獻(xiàn)率分別為38.3%、11.3%、9.03%、7.11%、5.61%、5.26%,累積方差貢獻(xiàn)率為76.6%。以6個主成分得分與其方差貢獻(xiàn)率乘積之和,得出32批不同產(chǎn)地山羊角樣品多類型資源型化學(xué)成分總主成分因子得分值(F),結(jié)果見表7,華東地區(qū)的山羊角綜合評分排列前8名,提示就所測48種資源型化學(xué)成分而言,華東地區(qū)山羊角質(zhì)量較好,但同產(chǎn)地山羊角各類成分含量綜合評分差異較大,如山東臨沂山羊角樣品(S16)綜合評分遠(yuǎn)高于山東沂源(S20)綜合評分。

表7 不同產(chǎn)地山羊角各類成分含量綜合評分結(jié)果

3 討論

角類藥材多含有豐富的蛋白質(zhì)及氨基酸類、核苷類物質(zhì),本實(shí)驗(yàn)分析不同產(chǎn)地山羊角上述成分含量,發(fā)現(xiàn)華東地區(qū)水溶性蛋白、核苷及氨基酸類成分總含量較高,華北地區(qū)次之,西南地區(qū)含量相對較低;山羊角中富含精氨酸、酪氨酸、絲氨酸等成分,可被研究作為氨基酸補(bǔ)充劑。蛋白質(zhì)是生命活動的基本物質(zhì),可補(bǔ)充營養(yǎng)并提供豐富的功能特性[18],可被研究作為蛋白補(bǔ)充劑。

無機(jī)元素可與體內(nèi)的氮、氧、硫的配體形成配位鍵,參與體內(nèi)代謝與平衡[19]。本實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示不同產(chǎn)地山羊角元素種類、含量豐富。研究表明熱性驚厥模型大鼠發(fā)作時,血漿中Ca2+濃度下降,及時補(bǔ)充Ca2+可使驚厥閾值下降,進(jìn)而達(dá)到抗驚厥功效[20-21],本實(shí)驗(yàn)所測不同產(chǎn)地山羊角無機(jī)元素中Ca含量最高,提示山羊角抗驚厥功效可能與之相關(guān)。此外，K、Na、P等常量元素可在預(yù)防骨質(zhì)疏松、調(diào)節(jié)神經(jīng)、鎮(zhèn)痛、催眠及參與骨髓造血系統(tǒng)生理過程[22]等方面發(fā)揮潛在作用,是山羊角相應(yīng)功效發(fā)揮的潛在效應(yīng)物質(zhì)之一。

重金屬具有較長的生物半衰期和不可生物降解性,會在人體肝、腎等不同部位長期積累[23]。本實(shí)驗(yàn)所測4種重金屬元素總含量均符合藥典規(guī)定,但西南地區(qū)產(chǎn)山羊角重金屬含量遠(yuǎn)高于其他地區(qū)樣品,此現(xiàn)象可能與我國土壤的重金屬分布規(guī)律有關(guān):Cd、Hg、Pb、As等有害元素含量分布呈現(xiàn)從東北到西南逐漸升高的態(tài)勢[24],其中Cd等重金屬元素在貴州、廣西等西南巖溶地區(qū)土壤的平均含量遠(yuǎn)高于全國平均水平[25]。據(jù)此推測,西南地區(qū)所產(chǎn)山羊角中重金屬含量較高與該區(qū)域飲水和飼料富含重金屬導(dǎo)致動物體內(nèi)蓄積相關(guān)。研究表明在飼料中添加高銅成分可提高家禽體質(zhì)量[23],這也可能是導(dǎo)致山羊角中Cu元素含量較高的原因之一。重金屬元素的測定可為山羊角藥材的質(zhì)量控制、安全性評價提供依據(jù)。

近年來,巰基及活性硫簇因與多種生物效應(yīng)及疾病相關(guān)而受到廣泛關(guān)注,在驚厥及發(fā)熱動物模型中血漿巰基含量在給予山羊角后顯著升高,表明山羊角的抗驚厥及解熱效應(yīng)可能與巰基含量有關(guān)[6,26]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明華東地區(qū)樣品中游離巰基、總巰基含量較高,西南地區(qū)樣品含量較低,后續(xù)可探討不同產(chǎn)地山羊角藥理活性與巰基含量的內(nèi)在聯(lián)系。

根據(jù)PCA結(jié)果發(fā)現(xiàn)西南地區(qū)山羊角被顯著分開,華東與華北地區(qū)樣品略有重疊,從地理位置來看,西南地區(qū)屬于亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候,而華東與華北地區(qū)地理位置相對較近。土壤環(huán)境、水源等因素導(dǎo)致山羊的生長環(huán)境具有顯著差異,進(jìn)而使山羊角的資源型化學(xué)成分含量具有地域性差異,可為山羊角藥用產(chǎn)地選擇提供數(shù)據(jù)支持,為山羊角藥材原料的資源供給和品質(zhì)穩(wěn)定提供數(shù)據(jù)支持。

山羊角作為我國山羊產(chǎn)業(yè)深加工的下腳料被大量廢棄,造成了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[1]?；谥兴庂Y源化學(xué)多層次、多途徑、精細(xì)化利用的研究思路[27],深入挖掘其藥用價值和多途徑資源利用前景,必將會為稀缺角類動物藥的類效替代資源開發(fā)、山羊角資源的合理綜合利用與產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù),為我國山羊產(chǎn)業(yè)鏈延伸做出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。