錢意,張亞文,呂翔,朱雨雨,李念光,段金廒,周婧,馬宏躍

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023)

蟾酥是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥,由蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑框蟾蜍BufomelanostictusSchneider等耳后腺及皮膚腺分泌物經(jīng)加工干燥而成,具有清熱解毒、消腫止痛和開竅醒神的功效,是多種中藥大品種和傳統(tǒng)中成藥的關(guān)鍵原料。隨著蟾蜍生態(tài)環(huán)境的破壞和商業(yè)捕殺的增加,野生中華大蟾蜍數(shù)量急劇減少乃至面臨瀕危困境。雖然人工養(yǎng)殖近年快速興起,但仍未解決資源緊張問題。蟾酥商品價(jià)格高昂、供需矛盾巨大迫使代用品研發(fā)十分必要[1]。

蟾酥含有復(fù)雜的化學(xué)物質(zhì),已知包括多樣的蛋白質(zhì)、多肽類大分子和強(qiáng)心甾、吲哚生物堿類小分子。從化學(xué)組學(xué)的視角審視,其活性物質(zhì)尚未完全揭示。實(shí)驗(yàn)室前期采用Denovo轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)結(jié)合蛋白組學(xué)方法,率先報(bào)道了蟾酥中蛋白和多肽類物質(zhì),并對(duì)部分基因序列進(jìn)行克隆驗(yàn)證[2-3];采用細(xì)胞親和篩選的方法,報(bào)道了蟾酥中一些獨(dú)特序列多肽[4];確定了一系列蟾酥內(nèi)酯和生物堿的藥效標(biāo)志物[5-6]?；趯?shí)驗(yàn)室前期的工作,馬宏躍、段金廒等設(shè)計(jì)了“化學(xué)特征類似、藥效近同、安全性更高”的蟾酥潛在代用品,優(yōu)化形成NJ2196。

本文是蟾酥和NJ2196等效性評(píng)價(jià)系統(tǒng)工作的一部分。鑒于免疫-神經(jīng)系統(tǒng)互作在炎癥反應(yīng)方面的重要作用,本文選用了脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)炎癥抑郁模型進(jìn)行等效性評(píng)價(jià)。此外,本文首次報(bào)道蟾酥藥材的抗炎性抑郁活性。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠,雄性,體質(zhì)量18～22 g,購(gòu)自杭州醫(yī)學(xué)院，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(浙)2019-0002,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過南京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審查,倫理號(hào):202206A016。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,飼養(yǎng)條件:溫度22～26 ℃,晝夜節(jié)律,相對(duì)濕度40%～70%。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

蟾酥藥材(產(chǎn)地:蘇州),經(jīng)馬宏躍教授鑒定為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍BufobufogargarizansCantor的干燥分泌物,質(zhì)量符合2020年版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)[7]。NJ2196由本實(shí)驗(yàn)室自制。鹽酸氟西汀購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司(貨號(hào):F844356)。

1.3 主要儀器

多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司);Nano-Drop超微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher公司);qPCR儀(瑞士Roche公司);SCIEX QTRAP 5500液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)AB公司)。

1.4 主要試劑

LPS(蘭杰柯科技有限公司,貨號(hào):BS904),白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒(南京翼飛雪生物科技有限公司,貨號(hào):YFXEM00028,YFXEM00031),TRIzon Reagent(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司,貨號(hào):CW0580),HiScriPt Ⅱ Q RT SuPerMix for qPCR(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,貨號(hào):R223-01),Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,貨號(hào):Q712-02),乙腈、異丙醇、甲醇和甲酸(美國(guó)Merck公司,色譜純)，氘標(biāo)記內(nèi)標(biāo)(IS)花生四烯酸(AA)-d8(美國(guó)Cayman Chemical公司,批號(hào):20150513)。引物為上海生工生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

將63只SPF級(jí)雄性ICR小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、氟西汀組、蟾酥低劑量組、蟾酥高劑量組、NJ2196低劑量組、NJ2196高劑量組,每組9只。除對(duì)照組外,每組單次給予LPS(0.83 mg·kg-1,腹腔注射)。氟西汀組:予氟西汀30 mg·kg-1灌胃;蟾酥低劑量組:予蟾酥30 mg·kg-1灌胃;蟾酥高劑量組:予蟾酥90 mg·kg-1灌胃;NJ2196低劑量組:予NJ2196 30mg·kg-1灌胃;NJ2196高劑量組:予NJ2196 90 mg·kg-1灌胃,對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。小鼠行為學(xué)考察結(jié)束后,眼眶取血,用于血清IL-1β和TNF-α水平檢測(cè),隨后斷頭取腦,分離出左腦海馬體,用于qPCR檢測(cè),右腦用于脂質(zhì)組學(xué)分析。

2.2 檢測(cè)方法

2.2.1 懸尾實(shí)驗(yàn) 懸尾箱內(nèi)部為黑色,長(zhǎng)寬高均為25 cm,頂部中心用繩連接夾子,在小鼠尾端2 cm處固定,使小鼠呈倒懸狀態(tài),頭部離懸尾箱底面約3.5 cm,觀察6 min,統(tǒng)計(jì)后4 min的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。

2.2.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 把小鼠放入高20 cm,直徑12 cm的圓形玻璃容器中,水溫25 ℃,水深10 cm。每只小鼠觀察6 min,統(tǒng)計(jì)后4 min的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。

2.2.3 ELISA法檢測(cè)血清中炎癥因子水平 血液4 ℃自然凝固2 h,于4 ℃、4 000 r·min-1離心30 min,收集上清,按ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清中IL-1β和TNF-α水平。

2.2.4 qPCR法檢測(cè)小鼠海馬組織炎癥因子和BDNF mRNA表達(dá) 采用Trizol法從小鼠海馬組織中提取總RNA,Nano-Drop超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度。使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix預(yù)混液制備樣品及擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性10 s,退火/延伸60 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參, 2-△△Ct法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

2.2.5 高靈敏度脂質(zhì)組學(xué)分析炎癥相關(guān)介質(zhì) 將小鼠右腦用乙酸乙酯和正己烷(v/v=1∶1,冷卻至-20 ℃),以及25 μL AA-d8溶液(1 μg·mL-1)萃取。在冰水浴中超聲,離心,收集上清液。樣品濃縮并重新溶解在500 μL 90%乙腈中。使用HPLC系統(tǒng)在XBridge C18柱(4.6 mm×100 mm,3.5 μm,Waters)上進(jìn)行色譜分析。流動(dòng)相A是水、乙腈和甲酸(70∶30∶0.02,v/v/v)。流動(dòng)相B是乙腈和異丙醇(50∶50,v/v)。流速為0.7 mL·min-1,樣品分離如下:0～3 min,0～25%B;3～11 min,25%～45%B;11～13 min,45%～60%B;13～18 min,60%～75%B;18～18.5 min,75%～90%B;18.5～20 min,90%B;20～21 min,90%B～100%A;21～25 min,100%A。進(jìn)樣量為5 μL。采用QTRAP5500型質(zhì)譜儀,陰離子、多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)模式,主要儀器參數(shù):氣簾氣壓力10 psi,霧化氣壓力30 psi,輔助氣壓力30 psi,噴霧電壓-4 500 V,離子化溫度525 ℃。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 蟾酥和NJ2196對(duì)小鼠抑郁行為的影響

結(jié)果見圖1,與對(duì)照組相比,模型組懸尾累積不動(dòng)時(shí)間和強(qiáng)迫游泳累積不動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0.01),出現(xiàn)抑郁樣行為;給予陽(yáng)性藥氟西汀,高、低劑量蟾酥和高、低劑量NJ2196后,小鼠懸尾累積不動(dòng)時(shí)間和強(qiáng)迫游泳累積不動(dòng)時(shí)間顯著縮短(P<0.01),表現(xiàn)出抗抑郁作用;蟾酥與NJ2196各劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明兩者在抗抑郁作用上有一定的等效性。

3.2 蟾酥和NJ2196對(duì)小鼠血清TNF-α和IL-1β水平的影響

結(jié)果見圖2,與對(duì)照組相比,模型組小鼠血清炎癥因子TNF-α和IL-1β水平均顯著提高(P<0.01);與模型組比較,氟西汀組,蟾酥高、低劑量組,NJ2196高、低劑量組TNF-α和IL-1β水平均顯著下降(P<0.01),表明蟾酥及其潛在代用品可降低血液炎癥因子釋放,具有抗外周炎癥的作用;蟾酥與NJ2196各劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明兩者在抗外周炎癥因子作用上有一定的等效性。

3.3 蟾酥和NJ2196對(duì)小鼠海馬組織炎癥因子TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果見圖3,與對(duì)照組相比,模型組小鼠海馬組織炎癥因子TNF-α和IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01);與模型組比較,氟西汀組,蟾酥高、低劑量組,NJ2196高、低劑量組小鼠海馬組織炎性因子TNF-α和IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著下降(P<0.01),表明蟾酥及其潛在代用品可降低海馬組織炎癥因子釋放,具有抗腦組織炎癥的作用;蟾酥與NJ2196各劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明兩者在抗腦組織炎癥作用上有一定的等效性。

3.4 蟾酥和NJ2196對(duì)小鼠海馬組織BDNF mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果見圖4,與模型組比較,蟾酥高、低劑量組,NJ2196高、低劑量組小鼠海馬組織BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)顯著上升(P<0.01),表明蟾酥及其潛在代用品可提高BDNF mRNA表達(dá)水平;蟾酥與NJ2196各劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明兩者在提高BDNF表達(dá)上有一定的等效性,如圖4。

3.5 蟾酥和NJ2196對(duì)腦組織環(huán)氧合酶(COX)途徑中炎癥介質(zhì)的影響

使用高靈敏度靶向脂質(zhì)組學(xué)檢測(cè)腦組織炎性脂質(zhì)生物標(biāo)記物的變化。在AA代謝的3個(gè)主要途徑中,通過COX途徑產(chǎn)生的代謝物發(fā)生了顯著變化。模型組有10種來自COX途徑的脂質(zhì)上調(diào)。經(jīng)蟾酥及NJ2196處理后,多數(shù)脂質(zhì)顯著減少(圖5)。與對(duì)照組相比,模型組20-Ethyl PGE2、PGF2β、2,3-Dinor-PGE1顯著增加(P<0.01)以及11-Deoxy-PGF1a/1b顯著增加(P<0.05);與模型組相比,氟西汀組,蟾酥高、低劑量組,NJ2196高、低劑量組20-Ethyl PGE2、19(R)PGF1a、δ-12-PGJ2/PGJ2、PGF1a/1b、2,3-Dinor-PGE1均顯著減少(P<0.01)。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用LPS刺激小鼠炎性抑郁模型,探究蟾酥及其潛在代用品的抗神經(jīng)炎癥活性。LPS會(huì)誘導(dǎo)嚙齒動(dòng)物的炎癥刺激和行為改變,與人類抑郁癥的臨床癥狀相似[8]。臨床研究已觀察到IL-1β、IL-6和TNF-α水平與神經(jīng)炎癥之間存在正相關(guān)[9]。LPS導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子增加,如TNF-α、IL-1β和IL-6等,會(huì)誘導(dǎo)小鼠的抑郁樣行為產(chǎn)生[10-11]。BDNF在抗神經(jīng)炎癥方面有重要作用[12-14],且炎癥標(biāo)志物增加和BDNF信號(hào)傳導(dǎo)中斷有關(guān)[15]。

結(jié)果顯示,給予LPS后小鼠懸尾累積不動(dòng)時(shí)間和強(qiáng)迫游泳累積不動(dòng)時(shí)間顯著增加,說明LPS能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生行為學(xué)異常。氟西汀、蟾酥和潛在代用品NJ2196能顯著減少累積不動(dòng)時(shí)間,改善抑郁樣表型。在上述整體行為學(xué)指標(biāo)上,不同劑量蟾酥和NJ2196組之間的活性強(qiáng)度近似,兩者沒有顯著性差異,具有一定的等效性。

LPS刺激了小鼠外周循環(huán)系統(tǒng)促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β分泌顯著增多;qPCR法檢測(cè)小鼠海馬組織中促炎因子相關(guān)基因表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá)水平顯著升高。炎癥標(biāo)志物增加和BDNF信號(hào)傳導(dǎo)中斷有關(guān)[12-14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蟾酥和NJ2196在改善小鼠抑郁樣表型、抑制小鼠外周血清促炎因子分泌、抑制小鼠海馬組織中促炎因子表達(dá)和促神經(jīng)保護(hù)因子表達(dá)方面具有顯著的活性,而且兩者間有一定的等效性。

為進(jìn)一步研究蟾酥和NJ2196抗神經(jīng)炎癥的潛在機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了AA代謝脂質(zhì)組學(xué)分析。脂質(zhì)代謝在神經(jīng)炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用,當(dāng)大腦受到炎性刺激,會(huì)釋放游離AA,稱為促炎介質(zhì)的前體[16],在COX途徑中,COX酶促進(jìn)內(nèi)源性氧化物PGH2的產(chǎn)生,然后轉(zhuǎn)化為各種生物活性前列腺素(PG)。本實(shí)驗(yàn)中,LPS能誘導(dǎo)高水平COX產(chǎn)物,且在蟾酥和NJ2196組中,20-Ethyl PGE2、19(R)PGF1a、δ-12-PGJ2/PGJ2、PGF1a/1b、2,3-Dinor-PGE1等顯著下調(diào),這些脂質(zhì)在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了極其復(fù)雜的生理作用。以上結(jié)果表明,蟾酥和NJ2196可能是通過COX途徑對(duì)炎癥因子進(jìn)行調(diào)控。

綜上所述,蟾酥及其潛在代用品NJ2196能夠有效改善LPS誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)炎癥,對(duì)小鼠外周血清和中樞海馬組織促炎因子水平有著顯著抑制作用,且其潛在機(jī)制可能與COX途徑代謝相關(guān)。本文在LPS刺激神經(jīng)炎癥動(dòng)物模型上,評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)蟾酥和NJ2196均具有抗炎性抑郁活性,而且兩者有一定等效性,為后續(xù)在更大范圍開展代用品藥效學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。