蘇雪蓉,謝穎,婁悅,蘇聯(lián)麟,毛春芹,趙曉莉,陸兔林

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023)

鱉血系鱉科動物中華鱉TrionyxsinensisWiegmann的新鮮血液,其藥用歷史可追溯至唐代?！吨腥A本草》記載,鱉血味甘、咸,性平,歸肝經(jīng),具有滋陰清熱、活血通絡(luò)的功效,主治虛勞潮熱、陰虛低熱、脅痛、口眼斜、脫肛等[1]。鱉血還是一種傳統(tǒng)的中藥炮制輔料,用來炮制柴胡、青蒿、牡丹皮、丹參等[2-6],其中鱉血柴胡作為江西樟幫特色炮制飲片沿用至今。但鱉血作為輔料缺乏全面、系統(tǒng)的質(zhì)量控制方法,尤其是專屬性的鑒別方法。因鱉血量少價高,在市場上可能存在以價廉易得的其他常見動物血液摻偽的現(xiàn)象,影響其藥用的安全性和有效性，因此,亟待建立一種特異性的鑒別方法以控制鱉血的質(zhì)量,進而保障以其炮制的飲片質(zhì)量。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展,PCR技術(shù)已經(jīng)成為中藥鑒定的常用輔助手段之一,在2020年版《中國藥典》[6]中,該技術(shù)用于烏梢蛇、蘄蛇、金錢白花蛇等動物藥材的鑒定。等位基因特異性PCR(Allele specific PCR,AS-PCR)鑒別技術(shù)基于物種DNA序列,通過引物3'端堿基與模板的嚴格配對來實現(xiàn)對SNP位點的檢測[7]。單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms,SNP)是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異引起的DNA序列多樣性。通過SNP位點設(shè)計具有物種特異性的引物,進行PCR反應(yīng)擴增出目標條帶從而進行物種鑒別,具有特異性高、分析速度快、結(jié)果準確的優(yōu)點。

本研究通過對鱉血以及驢血、牛血、豬血、雞血、羊血、兔血等常見動物血液的CO Ⅰ序列進行比對分析,根據(jù)SNP位點設(shè)計鱉血的特異性鑒別引物,使鱉血出現(xiàn)特異性條帶,而可能作為偽品摻入的其他動物血液無特異性條帶,從而建立鱉血的AS-PCR鑒別方法。研究結(jié)果可作為鱉血炮制輔料質(zhì)量控制的重要指標之一,亦可為血液類藥材的現(xiàn)代鑒別提供參考。

1 材料

1.1 實驗儀器

VeritiPro PCR儀(Thermo Fisher Scientific);東勝龍ETC811 PCR儀(蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司);Bio-Gener GE9612-T-S PCR儀(杭州柏恒科技有限公司);T100 Thermal Cycler PCR儀(BIO-RAD);SYSTEM GelDoc XR+全自動凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD);Tanon EPS 300電泳儀(上海天能科技有限公司);Nano-300微量分光光度計(杭州奧盛科技有限公司);Micro CL21R微量臺式離心機(Thermo Fisher Scientific)。

1.2 試劑

瓊脂糖(Bio Froxx,9012-36-6);Trans DNA Marker Ⅱ(北京全式金生物技術(shù)有限公司,BM411);DL5000 DNA Marker(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,MD102-01)；2×Rapid Taq Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,P222-AA);2×Es Taq Master Mix(北京康為世紀生物科技有限公司,CW0690)；2×Taq Plus Master Mix(北京索萊寶科技有限公司,PC1250)；6×Loading Buffer(南通飛宇生物科技有限公司,FY18906)；TaKaRa Taq[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司,RR901Q];FastPure Blood DNA Isolation Mini Kit V2(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,DC11101);Ultra GelRed(1 000×)(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,GR501-01);Tris-乙酸電泳緩沖液(50×TAE)(Leagene,NA0030);引物為上海生工生物科技有限公司合成。

1.3 樣品

從江蘇、湖南、浙江等地的中華鱉養(yǎng)殖基地收集13批中華鱉原動物,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為鱉科動物中華鱉TrionyxsinensisWiegmann,采用斷頭法取得的鱉血,每批樣品約30 mL;同法在江蘇新沂、南京收集驢血、牛血、雞血、羊血、豬血、兔血樣品,每批樣品約5 mL(表1)。

表1 樣品來源信息

2 方法

2.1 摻偽血液樣品制備

在同一批鱉血中不摻或摻入100%、80%、50%、20%、10%、5%牛血,考察摻偽靈敏度,并在此基礎(chǔ)上在同一批次鱉血中等比摻入驢血、牛血、羊血、雞血、豬血、兔血，模擬摻偽樣品進行鑒別。

2.2 基因組DNA提取

采用諾唯贊公司生產(chǎn)的全血DNA提取試劑盒,按照使用說明進行鱉血、2.1項下自制摻偽血液樣品、不同來源其他常見動物全血中所含DNA序列的提取純化,制得經(jīng)純化的鱉血基因組DNA提取物和不同來源動物基因組DNA提取物,采用Nano-300微量分光光度計測定其濃度,并根據(jù)吸光度A260/A280、A260/A230的值判斷DNA提取物的質(zhì)量。

2.3 通用引物擴增與測序

鱉血使用CO Ⅰ通用引物HCO2198/LCO1490擴增,25 μL反應(yīng)體系包括2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL,上游及下游引物1 μL,模板DNA 250 ng,雙蒸水補足至25 μL;反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 2.5 min,35個循環(huán),72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物于Gelred染色的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,全自動凝膠成像系統(tǒng)成像、觀察。取陽性產(chǎn)物測序,由上海生工生物科技有限公司完成。使用BioEdit軟件對測序峰圖進行校對，去除引物序列及拼接,獲得對應(yīng)測序結(jié)果。序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對,獲得最相似物種信息。

2.4 SNP位點篩選和特異性鑒別引物設(shè)計

分析Genebank里中華鱉、山瑞鱉、佛羅里達鱉、中南半島巨鱉、宏鱉、緣板鱉、黿、非洲鱉及常見動物驢、牛、雞、羊、豬、兔CO Ⅰ基因序列,使用Clustal W程序?qū)ζ溥M行多重序列比對,分析差異SNP位點。從中獲得3個特異性SNP位點,其中306位為胞嘧啶(C)(以GenBank序列JF700184.1為參照),394位為鳥嘌呤(G),520位為胸腺嘧啶(T),為中華鱉特有SNP位點,可用于鱉血與其它常見動物血液鑒別。為了增加引物潛在的特異性,在引物3'端倒數(shù)第2或3位引入錯配堿基,通過Primer Premier 6設(shè)計出中華鱉特異性鑒別引物對ZHB286、ZHB1、ZHB2、ZHB3,其它常見動物血液引物序列參考《江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范》[8]，上述引物均由上海生工生物科技有限公司合成，引物序列見表2。

表2 引物參數(shù)

2.5 鱉血AS-PCR反應(yīng)條件的確定

使用設(shè)計的鱉血PCR特異性引物進行PCR鑒別,PCR反應(yīng)在VeritiPro PCR儀上進行。選用試劑盒常用PCR反應(yīng)條件及預(yù)實驗結(jié)果建立初始條件進行進一步優(yōu)化。初始PCR反應(yīng)體系:10 μL反應(yīng)體系包含基因組DNA提取物100 ng，2×Rapid Taq Master Mix 5 μL，引物對正、反序列(10 μmol·L-1)各0.4 μL，雙蒸水補足至10 μL。初始反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸15 s,進行30次擴增循環(huán),72 ℃徹底延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后,取PCR產(chǎn)物于GelRed染色的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,全自動凝膠成像系統(tǒng)成像、觀察。為獲得最佳PCR反應(yīng)條件,分別考察退火溫度、循環(huán)次數(shù)、引物用量、DNA模板量、Taq DNA聚合酶種類、Taq DNA聚合酶用量、PCR儀對PCR反應(yīng)的影響。

3 結(jié)果

3.1 模板DNA的提取

使用試劑盒提取的鱉血DNA濃度均值為88.46 ng·μL-1,A260/A280均值為1.77,表明其DNA質(zhì)量良好。

3.2 引物篩選

使用CO Ⅰ通用引物HCO2198/LCO1490擴增4批鱉血,獲得約700 bp條帶并成功測序,確定樣品基原為中華鱉(圖1)。根據(jù)所測CO Ⅰ序列和Genbank中不同動物CO Ⅰ序列的特異性位點設(shè)計出4對鱉血鑒別引物,對上述引物進行PCR擴增,僅ZHB286可擴增獲得286 bp單一明亮的特異性條帶,其他動物血液無條帶(圖2)。因此選擇ZHB286作為鱉血特異性鑒別引物。

3.3 PCR反應(yīng)條件考察

以驢血、牛血、羊血、雞血、豬血、兔血作為鱉血的偽品,使用鱉血特異性鑒別引物與鱉血同時進行PCR擴增(圖3A～B),當退火溫度為60、62 ℃,循環(huán)次數(shù)為26、29次時,鱉血獲得約286 bp的單一特異性鑒別條帶,無非特異性條帶,作為偽品的其它常見動物血液樣品均無條帶。在此基礎(chǔ)上,對影響PCR鑒別準確性的關(guān)鍵條件:DNA模板濃度、鑒別引物用量、Taq DNA聚合酶用量進行考察(圖3C～E),結(jié)果表明,所設(shè)計的鱉血特異性鑒別引物正、反向引物(10 μmol·L-1)用量為0.2、0.4 μL,Taq DNA聚合酶預(yù)混液用量為5 μL,模板DNA為10～100 ng時，獲得約286 bp的單一明亮的特異性條帶,無非特異性條帶,偽品無條帶。模板DNA在1 ng下檢出條帶較暗,故不作為陽性檢出結(jié)果。根據(jù)上述結(jié)果確定鱉血AS-PCR最佳反應(yīng)條件為:PCR反應(yīng)體系(10 μL)包含基因組DNA提取物100 ng，2×Rapid Taq Master Mix 5 μL，引物對正、反序列各(10 μmol·L-1)0.2 μL，雙蒸水補足至10 μL。初始反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性15 s,62 ℃退火15 s,72 ℃延伸15 s,進行29次擴增循環(huán),72 ℃徹底延伸3 min。使用上述優(yōu)化后PCR條件對不同產(chǎn)地鱉血樣品、其他動物血液樣品進行AS-PCR鑒別,以驗證該鑒別體系的科學(xué)性和可行性。

3.4 耐受性考察

分別使用2×Rapid Taq Master Mix、2×Es Taq Master Mix、2×Taq Plus Master Mix、TaKaRa Taq預(yù)混液各5 μL進行試驗,結(jié)果表明,使用不同的Taq DNA聚合酶進行PCR反應(yīng)均能擴增得到286 bp的明亮條帶;使用VeritiPro、東勝龍ETC811、Bio-Gener GE9612-T-S、T100 Thermal Cycler PCR儀分別進行擴增,結(jié)果表明不同PCR儀,PCR擴增條帶強弱具有區(qū)別,但不影響結(jié)果判讀。結(jié)果見圖3F～G。

3.5 適用性考察

為考察不同飼養(yǎng)條件下的中華鱉鱉血檢出的一致性,以及所建立方法的可行性,根據(jù)3.3、3.4項下確定的最優(yōu)條件,對來自江蘇寶應(yīng)、浙江淳安、湖南漢壽、浙江余姚的12批鱉血,使用鱉血特異性鑒別引物ZHB286進行PCR擴增,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果表明,各產(chǎn)地鱉血基因組均能擴增出286 bp的特異性鑒別條帶(圖4),所建立的方法具有廣泛的適用性,可用于鱉血的特異性鑒別。

3.6 其他動物血PCR擴增結(jié)果

在優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件下,使用中華鱉特異性引物ZHB286,擴增作為偽品的其他動物血液基因組樣品(圖5),結(jié)果顯示，僅鱉血基因組樣品出現(xiàn)單一明亮的特異性鑒別條帶,表明該引物對鱉血具有特異性;使用中華鱉、驢、牛、雞、羊、豬、兔引物分別擴增鱉血基因組樣品,結(jié)果僅能顯示出鱉血單一明亮的條帶,表明其他動物引物也具有特異性,該批次鱉血樣品未摻入常見動物血液,可用于摻偽樣品檢出(圖6)。

3.7 摻偽靈敏度考察

為考察本研究所建立的AS-PCR鑒別方法對鱉血摻偽樣品的鑒別最低限度,在同一批次鱉血中,摻入不同比例牛血,使用牛引物進行AS-PCR擴增,結(jié)果表明,樣品在摻入10%～100%牛血均可檢測出約400 bp條帶,條帶亮度隨著摻入牛血比例的增加而增強,摻入50%～100%牛血時條帶無顯著性差異,其檢出限為10%,而摻入5%牛血未被檢測到(圖7)。使用ZHB286以及驢、牛、雞、羊、豬、兔各自引物對等比混合的動物血液基因組進行PCR擴增,得到不同大小的目標條帶,表明鱉血在摻偽50%及以上動物血液時均可被顯著鑒別(圖8)。以上實驗結(jié)果表明,此方法能檢查鱉血摻偽常見動物血液情況,并且所建立的方法具有廣泛的適用性,可用于鱉血的特異性鑒別。

4 討論

本研究基于鱉血原動物中華鱉和以驢、牛、羊、雞、豬、兔為代表的常見可能摻偽鱉血的原動物的CO Ⅰ序列差異,設(shè)計了中華鱉特異性鑒別引物,并通過對PCR各項反應(yīng)條件的優(yōu)化,成功建立了鱉血AS-PCR鑒別方法,該法能較快速(約1 h內(nèi))地鑒別鱉血。鑒于鱉血可能存在的摻偽現(xiàn)象,本研究應(yīng)用不同動物來源的特異性鑒別引物在同一反應(yīng)體系內(nèi)檢查鱉血摻偽狀況,以實現(xiàn)其專屬性的質(zhì)量控制。

文獻研究發(fā)現(xiàn),藥材多基原鑒別以及外觀性狀近似的混偽品鑒別亦有應(yīng)用多重實時熒光PCR技術(shù)[9-11],該法在鑒別過程中通過Ct值客觀鑒別摻偽樣品,可縮短和簡化檢測步驟,但同時也需要設(shè)計熒光探針鑒別引物、配套熒光PCR儀來采集熒光信號,檢測成本較高,在數(shù)據(jù)處理和實際應(yīng)用中存在一定局限性[12]。各省市藥材標準中對于鹿茸血、山羊血、豬血[13]等血液類藥材的鑒別采用理化法、氨基酸薄層色譜法,不具有專屬性。考慮到可能作為偽品摻入鱉血的其他動物血液種類較多,本研究所建立的AS-PCR鑒別方法因各引物PCR反應(yīng)條件統(tǒng)一,可實現(xiàn)批量、高效率擴增,并且瓊脂糖凝膠電泳檢測非特異性擴增產(chǎn)物相較于實時熒光定量PCR檢測結(jié)果更加直觀、簡便。本課題組后續(xù)還將進行多種摻偽品準確定量方法的深入研究。