王倩,肖東,劉睿,2,朱悅,楊濱,丁玉華,白加德,溫華軍,吳海榮,段金廒,趙明

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點研究室,江蘇 南京 210023;2.江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點實驗室,江蘇 南京 210023;3.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所,北京 100700;4.江蘇大豐麋鹿國家級自然保護(hù)區(qū),江蘇 大豐 224136;5.北京麋鹿生態(tài)實驗中心,北京 100076;6.湖北石首麋鹿國家級自然保護(hù)區(qū),湖北 石首 434407;7.江蘇省溱湖國家濕地公園麋鹿苑,江蘇 泰州 225500)

麋鹿角為鹿科麋鹿屬麋鹿ElaphurusdavidianusMillne-Edwards雄鹿已骨化的角,是珍貴的傳統(tǒng)中藥,在本草中多有記載。據(jù)《中華本草》,麋鹿角可“溫腎壯陽,填精補(bǔ)髓,強(qiáng)筋骨,益血脈”,主治“腎陽不足,虛勞精虧,腰膝酸軟,筋骨疼痛,血虛證”[1]。

麋鹿種群曾一度在中國境內(nèi)絕跡,導(dǎo)致麋鹿角藥材藥用歷史斷代。近年來,隨著中國境內(nèi)麋鹿資源分布區(qū)域不斷擴(kuò)張和種群持續(xù)壯大[2],自行脫落的麋鹿角資源產(chǎn)量逐年遞增且形成大量庫存。從資源學(xué)角度看,人類對生物資源保護(hù)的目的是為了能夠持續(xù)有效地服務(wù)于人們的生產(chǎn)與生活,滿足人們健康需求。長期人工馴養(yǎng)繁衍的麋鹿產(chǎn)生的脫落角,既有深厚的傳統(tǒng)中醫(yī)藥用歷史和功效記載,又有現(xiàn)代科學(xué)證據(jù),若不加以積極主動地研究與合理利用,必將造成中國這一特有鹿科藥用資源的極大浪費,也不符合“傳承精華,守正創(chuàng)新”的發(fā)展戰(zhàn)略思想。因此,本課題組近20年持續(xù)對麋鹿角傳統(tǒng)功效及其物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了較為系統(tǒng)的科學(xué)表征研究,為恢復(fù)麋鹿角的法定藥用地位開展了前瞻性基礎(chǔ)研究,為明確麋鹿角的物質(zhì)組成及特征,為其資源合理利用以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評價和控制提供科學(xué)依據(jù)。

本文是在前期研究的基礎(chǔ)上[3-5],鑒于以往研究報道所涉及麋鹿角樣品的局限性及所表征的物質(zhì)信息不足等,收集了麋鹿分布代表性區(qū)域的39批麋鹿角樣品進(jìn)行多指標(biāo)物質(zhì)表征和分析,以期為麋鹿角的物質(zhì)組成提供較為全面的信息,同時揭示麋鹿角樣品的區(qū)域特征,為麋鹿角的深入研究和資源利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗藥材

麋鹿角樣品,共39批次(表1),收集于江蘇大豐、江蘇溱湖、北京、湖北石首地區(qū)。經(jīng)江蘇省大豐麋鹿國家級自然保護(hù)區(qū)丁玉華主任鑒定,確證為鹿科動物麋鹿ElaphurusdavidianusMilne-Edwards雄鹿已骨化的角。憑證標(biāo)本存于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心。

表1 麋鹿角樣品信息

1.2 實驗試劑

含有鋰(Li)、鈹(Be)、硼(B)、鎂(Mg)、鋁(Al)、鈦(Ti)、釩(V)、鉻(Cr)、錳(Mn)、鐵(Fe)、鈷(Co)、鎳(Ni)、銅(Cu)、鋅(Zn)、鎵(Ga)、砷(As)、鍶(Sr)、鎘(Cd)、錫(Sn)、銻(Sb)、鋇(Ba)、鉈(Tl)、鉛(Pb)和鉍(Bi)的多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg·mL-1)(批號:GSB 04-1767-2004)和含有磷(P)(100 μg·mL-1)[批號:GSB 04-1741-2004(a)]、鈣(Ca)(100 μg·mL-1)(批號:GSB 04-1720-2004)的多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心;對照品反式-4-羥基-L-脯氨酸(Hpro)、L-絲氨酸(Ser)、L-甘氨酸(Gly)、L-丙氨酸(Ala)、L(+)-精氨酸(Arg)、L-蘇氨酸(Thr)、L-脯氨酸(Pro)、L-纈氨酸(Val)、L-異亮氨酸(Ile)、L-亮氨酸(Leu)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-賴氨酸(Lys)均購于Sigma公司,經(jīng)HPLC檢測純度均大于98%;乙腈(HPLC級)購自Merck公司;異硫氰酸苯酯(批號：C10274299)購自南京良緯生物科技有限公司;硝酸(優(yōu)級純,批號：180732)、雙氧水(優(yōu)級純,批號：180827)、三乙胺、鹽酸和正己烷均購自國藥控股化學(xué)試劑有限公司;牛血清白蛋白(BSA,純度≥98%)、考馬斯亮藍(lán)G-250購自南京晚晴有限公司。

1.3 總灰分、酸不溶灰分及水浸出物測定

取麋鹿角樣品,粉碎,過2號篩,于4 ℃低溫條件下保存?zhèn)溆谩Ｒ罁?jù)2020年版《中國藥典》四部通則中灰分測定法(2302)和浸出物測定法(2201)項下水溶性浸出物測定法(熱浸法)相關(guān)規(guī)定對麋鹿角藥材進(jìn)行總灰分、酸不溶性灰分及水溶性浸出物測定。

1.4 重金屬含量測定

取麋鹿角樣品,粉碎,過120目篩,于4 ℃低溫條件下保存?zhèn)溆?。依次配置測定所需的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液,建立儀器測定方法[6],開展麋鹿角重金屬含量測定。

1.5 無機(jī)元素測定

取麋鹿角樣品,粉碎,過120目篩,于4 ℃低溫條件下保存?zhèn)溆?。依次配置測定所需的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液,建立儀器測定方法[7],開展麋鹿角無機(jī)元素的測定。

1.6 水溶性蛋白測定

取麋鹿角樣品,粉碎,過120目篩備用。依次配置水溶性蛋白測定所需的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液,建立儀器測定方法[8],開展麋鹿角水溶性蛋白測定。

1.7 水解氨基酸相關(guān)的定性分析及指紋圖譜特征

取麋鹿角樣品,粉碎,過120目篩,于4 ℃低溫條件下保存?zhèn)溆?。依次配置水解氨基酸測定所需的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液,建立儀器測定方法[9],開展麋鹿角水解氨基酸測定。

采用Waters InnovationTM300°A C18(4.6 mm×25 cm,5 μm)；乙腈-0.1 mol·L-1醋酸鈉溶液(用醋酸調(diào)節(jié)pH值至6.5)(7∶93)為流動相A，以乙腈-水(4∶1)為流動相B進(jìn)行梯度洗脫；流速1.0 mL·min-1,柱溫43 ℃,檢測波長為254 nm,進(jìn)樣體積:5 μL。

建立梯度洗脫程序:0～11 min,100%A;11～15 min,100%→85%A;15～25 min,85%→78%A;25～30 min,78%→65%A;30～35 min,65%A→100%B;35～45 min,100%B。

2 結(jié)果

2.1 總灰分、酸不溶灰分及水浸出物測定

依據(jù)2020年版《中國藥典》四部通則相應(yīng)方法對39批代表性麋鹿角樣品進(jìn)行測定,相關(guān)數(shù)據(jù)詳見表2。

表2 39批麋鹿角總灰分、酸不溶灰分、水浸出物含量(%)

2.2 重金屬含量測定

使用OptimaTM2100 DV電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀對麋鹿角樣品中Pb、Cu、As和Cd重金屬進(jìn)行測定,具體數(shù)據(jù)詳見表3～4。

表3 39批麋鹿角中4種重金屬含量(μg·g-1)

表4 不同區(qū)域麋鹿角中4種重金屬平均含量(μg·g-1)

2.3 無機(jī)元素測定

采用ICP-MS對麋鹿角樣品中的3種常見元素(Mg、P、Ca)、8種必需微量元素(Cr、Mn、Fe、Ni、Zn、Sr、B、V)和其它11種無機(jī)元素(Li、Be、Tl、Bi、Ti、Co、Ga、Sn、Ba、Al、Sb)進(jìn)行定量檢測,數(shù)據(jù)詳見表5～10。結(jié)合正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)及聚類分析法開展多元統(tǒng)計分析。

表5 39批麋鹿角樣品中常量元素含量(μg·g-1)

2.3.1 不同地區(qū)的麋鹿角無機(jī)元素聚類分析 利用SIMCA-P 14.0軟件聚類分析,對39批麋鹿角樣品中無機(jī)元素分析可得(圖1),距離為1.6時,可劃分為2類。來自江蘇大豐和江蘇溱湖地區(qū)的樣品聚為一類,可能與大豐和溱湖的地理位置非常接近有關(guān);來自北京和湖北石首樣品聚為另一類,但湖北石首地區(qū)的樣品聚集緊密。

2.3.2 不同地區(qū)的麋鹿角無機(jī)元素OPLS-DA分析 為探討不同地區(qū)麋鹿角無機(jī)元素成分含量差異,挖掘可用于區(qū)分不同地區(qū)的潛在指標(biāo)成分,本研究將所測定的39批麋鹿角樣品中的17種(可測到)化學(xué)成分含量導(dǎo)入SIMCA-P 14.0軟件進(jìn)行OPLS-DA分析。如圖2A所示,所有樣品被分為3類,反映了不同地區(qū)的麋鹿角成分存在一定的差異。來自江蘇大豐和江蘇溱湖的樣品相對較近,來自北京和湖北石首的樣品相對較近。根據(jù)各成分的VIP值(圖2B),B、Li、Mn、Al、Ca和V的VIP值均大于1,篩選為主要差異成分,表明這6種成分在江蘇大豐、江蘇溱湖、北京以及湖北石首地區(qū)樣品中含量差異較大。

表6 39批麋鹿角樣品中必需微量元素含量(μg·g-1)

表7 39批麋鹿角樣品中其他11種無機(jī)元素含量(μg·g-1)

表8 不同區(qū)域麋鹿角中3種常量元素平均含量(μg·g-1)

表9 不同區(qū)域麋鹿角中8種必需微量元素元素平均含量(μg·g-1)

表10 不同區(qū)域麋鹿角中6種其他無機(jī)元素平均含量(μg·g-1)

2.4 水溶性蛋白測定

采用考馬斯亮藍(lán)比色法對麋鹿角樣品中水溶性蛋白的含量進(jìn)行測定,結(jié)果見表11。蛋白質(zhì)平均總含量為68.67 mg·g-1,分析可得各地區(qū)麋鹿角蛋白質(zhì)成分總含量差異較小。

表11 麋鹿角樣品蛋白質(zhì)成分含量檢測結(jié)果(mg·g-1,n=3)

2.5 水解氨基酸定性分析及指紋圖譜特征

氨基酸是角類藥材有機(jī)成分中含量居首的營養(yǎng)物質(zhì),種類繁多,是角類藥材的潛在功效物質(zhì)[8，10-11]。本文擬選用12種酸水解氨基酸作為研究對象,對來自麋鹿角主要分布區(qū)的麋鹿角樣品進(jìn)行全面的評估。

2.5.1 主成分鑒別 以建立的HPLC-UV法分析各供試樣品,1～12號峰被分別鑒定為羥脯氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸,結(jié)果見圖3。

2.5.2 指紋圖譜的建立 采用異硫氰酸苯酯(PITC)HPLC法建立麋鹿角藥材的指紋圖譜,共匹配出12個共有峰,結(jié)果見圖4。

將38批麋鹿角樣品所得色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)》,采用中位數(shù)法計算38批麋鹿角藥材相似度,發(fā)現(xiàn)所有樣品的相似度均大于0.9,表明不同地區(qū)間麋鹿角藥材的氨基酸組成相似。

3 討論

本研究對39批麋鹿角藥材進(jìn)行總灰分、酸不溶性灰分及水浸出物等相關(guān)理化數(shù)據(jù)測定。結(jié)果顯示,麋鹿角總灰分含量范圍為:49.71%～62.40%,酸不溶性灰分含量范圍為:21.73%～39.54%,水溶性浸出物含量范圍為:6.18%～16.95%。總灰分及酸不溶性灰分檢查項的含量偏高,與麋鹿角生長時期、骨化程度有關(guān)。重金屬含量測定結(jié)果顯示Pb、Cu及As的總含量范圍為0.67～197.29 μg·g-1,其中,Pb含量范圍為0.01～7.63 μg·g-1;Cu含量范圍為0.05～190.14 μg·g-1;As含量范圍為0.02～1.31 μg·g-1,所有麋鹿角樣品均不含有Cd。分析發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)麋鹿角種群之間重金屬元素存在一定差異,其中北京地區(qū)麋鹿角樣品中Pb和Cu平均含量相較于其它地區(qū)較高,這可能與麋鹿的棲息環(huán)境、飲食和水密切相關(guān)[6]。

分析39批麋鹿角樣品中無機(jī)元素的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),麋鹿角樣品中Ca含量最高(5.17～40.66 mg·g-1),P含量次之(2.08～18.95 mg·g-1);必需微量元素中Sr含量(17.31～432.97 μg·g-1)和Fe含量(2.26～305.03 μg·g-1)較高,Cr、V含量最低,只有個別樣品可以檢測到;其它11種無機(jī)元素中,Al含量較高(15.65～337.51 μg·g-1)。所有樣品均未檢測到Be、Tl、Bi、Co和Sb。就江蘇大豐麋鹿角中無機(jī)元素的含量測定結(jié)果而言,本次研究與宋建平等的研究結(jié)果基本保持一致[7]。

研究表明，麋鹿角中富含氨基酸類成分[9],進(jìn)一步比較分析發(fā)現(xiàn)北京地區(qū)麋鹿角樣品富含谷氨酸,江蘇溱湖地區(qū)麋鹿角樣品富含甲硫氨酸,而湖北石首地區(qū)麋鹿角樣品富含異亮氨酸。揭示出所有麋鹿角樣品呈現(xiàn)區(qū)域特征性且其氨基酸類成分的積累與生境密切相關(guān),為麋鹿角藥材的綜合利用提供了科學(xué)參考。

不同于過往研究報道中麋鹿角樣品收集區(qū)域范圍小及樣本量少的情況[6-7,10],本研究基于覆蓋麋鹿主要分布區(qū)的麋鹿角樣品,對其進(jìn)行包括灰分、水浸出物、重金屬、無機(jī)元素及水解氨基酸指紋圖譜等全面的物質(zhì)表征研究,明確了不同區(qū)域麋鹿角藥材間物質(zhì)成分的差異,揭示出麋鹿角樣品呈現(xiàn)區(qū)域特征性,為麋鹿角藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定以及麋鹿角的資源化利用提供了較全面的物質(zhì)組成依據(jù)。