王玉宸，王欣玉，彭 龍1, *，袁志林1, *

(1.林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院，北京 100091；2.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037；3.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400)

荷伯生氏斜蓋傘(Clitopilushobsonii)，在分類地位上屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)傘菌目(Agaricales)粉褶蕈科(Entolomataceae)。基于最新的形態(tài)學(xué)特征和分子系統(tǒng)發(fā)育分析，斜蓋傘屬真菌可分3組：Clitopilus組、Scyphoides組和Crispi組，荷伯生氏斜蓋傘屬于Scyphoides組[1]。此真菌首次分離自櫟類林腐木[2]，是典型的土壤腐生型真菌。本研究組在2017—2018年開展了多種國(guó)外櫟類樹種菌根組織真菌的資源調(diào)查、分離培養(yǎng)工作，發(fā)現(xiàn)荷伯生氏斜蓋傘從大果櫟(Quercusmacrocrpa)、舒瑪櫟(Q.shumardii)、牛櫟(Q.michauxii)、琴葉櫟(Q.lyrata)、白櫟(Q.fabri)等櫟類樹種的新鮮菌根組織中均能分離獲得，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該菌不僅能與多種苗木建立共生關(guān)系，形成類似“微菌核”的侵染結(jié)構(gòu)，還能促進(jìn)苗木根系發(fā)育和養(yǎng)分吸收[3]。上述研究基礎(chǔ)證明荷伯生氏斜蓋傘不僅可從腐生型(saprotrophy)轉(zhuǎn)變?yōu)榧嫘曰铙w營(yíng)養(yǎng)型(facultative biotrophy)，還可對(duì)植物產(chǎn)生一定的促生抗逆作用。因此，筆者認(rèn)為破譯該菌的遺傳信息(如制備荷伯生氏斜蓋傘的同核菌株)不僅能為豐富“外生菌根真菌起源自腐生真菌”這一觀點(diǎn)[4-5]提供更多基因組進(jìn)化證據(jù)，還能為今后開展菌-植互惠機(jī)制研究奠定良好基礎(chǔ)。然而，傘菌目真菌大多為異核雙核體菌株，其基因組存在不同的雜合度，這將給基因組組裝帶來一定挑戰(zhàn)?！皢魏嘶弊鳛椤昂?jiǎn)化”復(fù)雜基因組的一種重要策略，也是有效開展異核體真菌全基因組測(cè)序分析的重要環(huán)節(jié)[6-8]。在遺傳上，把通過原生質(zhì)體再生法得到的單核體和同核體分別稱為單核原生質(zhì)體(protoplasted monokaryon)和同核原生質(zhì)體(protoplasted homokaryon)，此現(xiàn)象則被稱為原生質(zhì)體單核化(monotikaryotization by protoplasting)[9]。菌體單核化的方法主要包括機(jī)械分割法、化學(xué)處理法、孢子分離法和原生質(zhì)體再生法[10-12]。機(jī)械分割法是基于體細(xì)胞的物理分離策略，獲得的單核體遺傳信息能完整、準(zhǔn)確地保留，但該方法對(duì)細(xì)胞破壞程度大，分割后細(xì)胞存活率降低，而且分割產(chǎn)物不均勻，單核體得率低；化學(xué)處理法是基于體細(xì)胞的化學(xué)分離策略，盡管單核體遺傳信息也能完整、準(zhǔn)確地保留，但對(duì)于處理?xiàng)l件要求嚴(yán)格，具有細(xì)胞毒性；孢子分離法是基于生殖細(xì)胞的分離策略，相比于其他制備單核體的方法，孢子分離法僅適用于產(chǎn)孢菌株的單核體制備，且單核孢子的形成需要經(jīng)過遺傳重組、減數(shù)分裂，因而遺傳信息無法完整保留；原生質(zhì)體再生法曾用于分離同宗結(jié)合菌雙孢蘑菇的同核體[13-15]，由原生質(zhì)體再生形成的細(xì)胞核未經(jīng)過減數(shù)分裂及遺傳重組，親本細(xì)胞核內(nèi)的遺傳信息能被更完整、準(zhǔn)確地保留[13]。目前通過原生質(zhì)體再生獲得的單核、同核體菌株已被廣泛應(yīng)用于食用真菌雜交育種中親本材料的制備[9, 16-17]。

本研究利用原生質(zhì)體再生法制備荷伯生氏斜傘同核體菌株，即僅具有1種基因型的純合體，并通過形態(tài)學(xué)特征、細(xì)胞核染色及基因雜合位點(diǎn)檢測(cè)加以論述，為該菌種的科學(xué)制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

荷伯生氏斜蓋傘(C.hobsonii)(菌株編號(hào)：QYL-10)，分離自琴葉櫟(Q.lyrata)1年生實(shí)生幼苗菌根組織[18]，保藏于中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所。

1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

真菌DNA快速提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司(貨號(hào)：DN4102)；PCR引物合成、擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序均由擎科生物科技有限公司完成；PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自擎科生物科技有限公司；裂解酶(lysing enzyme)購(gòu)自Sigma公司，用0.5 mol/L蔗糖溶液配置成質(zhì)量濃度為10 μg/μL的工作液后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌備用；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)購(gòu)自Sigma公司，用無菌水配置成質(zhì)量濃度為50 μg/mL的母液，使用前用磷酸鹽(PBS)緩沖液(pH 6.8，濃度0.1 mol/L)稀釋成質(zhì)量濃度為5 μg/mL的工作液[19]；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。全溫振蕩器(THZ-C-1，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；PCR擴(kuò)增儀(MyCycler，Bio-Rad公司)；電泳儀(DYY-6C，北京六一儀器廠)；立式壓力蒸汽滅菌器(LDZF-50KB-Ⅱ，上海申安醫(yī)療機(jī)器廠)；光學(xué)顯微鏡(Axio Scope A1，德國(guó)卡爾蔡司公司)；激光共聚焦熒光顯微鏡(LSM700，德國(guó)卡爾蔡司公司)。

1.1.3 培養(yǎng)基與緩沖液

馬鈴薯固體(PDA)培養(yǎng)基；麥芽浸汁固體(MYG)培養(yǎng)基：10 g葡萄糖，4 g酵母提取物，10 g麥芽提取物，15 g瓊脂，0.5 mol蔗糖溶液，pH 7.0。麥芽浸汁液體(YMG)培養(yǎng)基：10 g葡萄糖，4 g酵母提取物，10 g麥芽提取物，0.5 mol蔗糖溶液，pH 7.0。滲透壓穩(wěn)定劑：0.5 mol/L蔗糖溶液。

1.2 同核體菌株制備

1.2.1 原生質(zhì)體制備

QYL-10菌絲細(xì)胞原生質(zhì)體制備參考鮑大鵬等[20]的方法并做改動(dòng)。將10個(gè)直徑6 mm的菌餅接種至YMG液體培養(yǎng)基，25 ℃、120 r/min培養(yǎng)7 d。然后收集菌絲體，用無菌水洗滌3次，再用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌1次。將洗凈后的菌絲體置于10 g/L裂解酶溶液中(1 g菌絲/5 mL酶液)，在37 ℃下80 r/min震蕩酶解3 h。酶解后將菌絲酶解液經(jīng)無紡布過濾，得到較純的原生質(zhì)體懸液，將所得濾液在4 ℃下3 000 r/min離心10 min，棄上清，得到原生質(zhì)體沉淀；用滲透壓穩(wěn)定劑沖洗2次，棄上清，保留沉淀；用1 mL滲透壓穩(wěn)定劑重懸沉淀。將得到的原生質(zhì)體重懸液置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并記錄拍照原生質(zhì)體形態(tài)。經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，原生質(zhì)體數(shù)量濃度為1×106個(gè)/mL。

1.2.2 原生質(zhì)體再生

將100 μL原生質(zhì)體重懸液均勻涂布于MYG培養(yǎng)基上，25 ℃避光培養(yǎng)，每天觀察菌落生長(zhǎng)情況。挑取10 d后長(zhǎng)出的再生菌落轉(zhuǎn)接至PDA固體培養(yǎng)基上，25 ℃避光培養(yǎng)。

1.3 同核體菌株鑒定

1.3.1 再生菌株與出發(fā)雙核體菌落的培養(yǎng)

菌落形態(tài)特征觀察：用直徑為6 mm的打孔器沿再生菌株、出發(fā)菌株的菌落邊緣打孔，分別接種于PDA培養(yǎng)基上，置于25 ℃培養(yǎng)箱，避光培養(yǎng)12 d后觀察菌落表型特征(包括菌落正反面及邊緣特征、色素、生長(zhǎng)速度等)，拍照記錄。

1.3.2 再生菌株與出發(fā)菌株生長(zhǎng)速度測(cè)定

用直徑為6 mm的打孔器沿再生菌株、出發(fā)菌株的菌落邊緣打孔，分別接種于PDA培養(yǎng)基中心，25 ℃避光培養(yǎng)，以十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲的生長(zhǎng)速度(mm/d)，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.3 菌絲形態(tài)觀察

用直徑為6 mm的打孔器沿再生菌株、出發(fā)菌株的菌落邊緣打孔，分別接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃避光培養(yǎng)3 d，在菌落邊緣斜插入無菌蓋玻片，待菌絲延伸至蓋玻片2/3處時(shí)，在無菌條件下取出蓋玻片，制片后置于光學(xué)顯微鏡下鏡檢，在100倍顯微鏡下觀察此兩類菌株的菌絲是否存在鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)。

1.3.4 細(xì)胞核熒光染色及觀察

參考胡曉棣等[21]的方法并稍做改動(dòng)。用鑷子取出經(jīng)插片培養(yǎng)附著有菌絲體的蓋玻片，擦去背面菌絲，向菌絲附著位置均勻滴加50 μL DAPI染色工作液(5 μg/mL)，在4 ℃、避光條件下對(duì)再生菌株、出發(fā)菌株的菌絲進(jìn)行細(xì)胞核熒光染色，10～15 min后用PBS緩沖液(pH 6.8，0.1 mol/L)洗滌3次。將蓋玻片附著菌絲一面朝下置于滴有PBS緩沖液的載玻片上，置于激光共聚焦熒光顯微鏡63倍鏡下觀察，激發(fā)光與發(fā)射光波長(zhǎng)分別為340、488 nm。

1.3.5 基因雜合位點(diǎn)鑒定

用真菌基因組DNA快速提取試劑盒分別提取荷伯生氏斜蓋傘再生菌株、出發(fā)菌株的基因組DNA。采用fRPB2-5F/fRPB2-7cR和983F/2218R兩對(duì)引物分別擴(kuò)增rpb2[22]和tef[23]基因片段。

PCR擴(kuò)增體系(50 μL)如下：25 μL 1-5TM2×High-Fidelity Master Mix，1 μL模板DNA(10～20 ng/μL)，上下游引物各2 μL(10 μmol/L)，20 μL ddH2O。rpb2基因PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性40 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1.5 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

采用降落PCR(touch-down PCR)方法擴(kuò)增tef基因，降落PCR程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，66 ℃退火50 s，每循環(huán)下降1 ℃，72 ℃延伸1.5 min，擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)；94 ℃變性40 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸1.5 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送擎科生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。采用SeqMan 5.0軟件分別對(duì)再生菌株、出發(fā)菌株的rpb2基因和tef基因進(jìn)行核酸序列比對(duì)和雙峰雜合位點(diǎn)鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析(α=0.05)；菌株生長(zhǎng)速度以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體再生菌落的獲得

通過酶解實(shí)驗(yàn)，成功獲得了荷伯生氏斜蓋傘原生質(zhì)體(圖1A)，在MYG再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后可觀察到兩種形態(tài)的菌落(圖1B)。其中一類表現(xiàn)為菌絲快速萌發(fā)(大多出現(xiàn)在再生培養(yǎng)前期)，將其轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，此類菌絲萌發(fā)后呈稀薄毛氈狀，形成的菌落邊緣呈放射狀，與出發(fā)菌落形態(tài)差異較小(圖1C)；另一類表現(xiàn)為菌絲緩慢萌發(fā)(大多出現(xiàn)在再生培養(yǎng)后期)，轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，此類菌絲萌發(fā)后呈濃密絨毛狀，形成的菌落有裂褶狀紋路且邊緣明顯，與出發(fā)菌落形態(tài)差異大(圖1D)，推測(cè)后者可能是潛在的同核菌株。隨機(jī)挑取50個(gè)菌落轉(zhuǎn)接至PDA固體培養(yǎng)基用于后續(xù)鑒定分析。

A.原生質(zhì)體形態(tài)protoplast morphology；B. MYG培養(yǎng)基表面再生菌落regenerated colonies on MYG medium；C. PDA培養(yǎng)基表面再生菌落類型Ⅰ regenerated colony type Ⅰ on PDA medium；D. PDA培養(yǎng)基表面再生菌落類型Ⅱ regenerated colony type Ⅱ on PDA medium。圖1 荷伯生氏斜蓋傘再生菌落形態(tài)Fig.1 Protoplast and colony morphology of regenerated strains of C. hobsonii

2.2 再生菌株與出發(fā)菌株的菌落性狀和形態(tài)特征

以其中1株與出發(fā)菌株具有明顯差異的再生菌株為材料，比較再生菌株與出發(fā)菌株間的菌落形態(tài)特征和生長(zhǎng)速度差異。培養(yǎng)結(jié)果表明再生菌株萌發(fā)后呈輻射狀生長(zhǎng)，菌絲呈濃密絨毛狀，菌落表面形成裂褶，有深黃色色素分泌(圖2A)(表1)。出發(fā)菌株萌發(fā)后則呈現(xiàn)輪紋狀生長(zhǎng)，菌絲呈稀薄毛氈狀，菌落表面形成輪狀紋，有淡黃色色素分泌(圖2B)。

A. PDA培養(yǎng)基表面再生菌株菌落(左正、右反)colony of regenerated strains (front and reverse) on PDA culture medium；B. PDA培養(yǎng)基表面出發(fā)菌株菌落(左正、右反)colony of original strains (front and reverse) on PDA culture medium。圖2 荷伯生氏斜蓋傘再生菌株與出發(fā)菌株菌落及其形態(tài)特征Fig.2 Colony and morphological characteristics of regenerated and original strains of C. hobsonii

此外，出發(fā)菌株的菌絲生長(zhǎng)速度為(5.72±0.07) mm/d，再生菌株的菌絲生長(zhǎng)速度為(2.82±0.03) mm/d，顯著低于出發(fā)菌株的菌絲生長(zhǎng)速度(P<0.01)(表1)。

表1 再生菌株與出發(fā)菌株的生長(zhǎng)特征比較

2.3 再生菌株與出發(fā)菌株的菌絲顯微形態(tài)特征

鎖狀聯(lián)合是擔(dān)子菌特有的菌絲結(jié)構(gòu)特征[24-25]。然而，不同于多數(shù)擔(dān)子菌，在荷伯生氏斜蓋傘出發(fā)菌株與再生菌株的菌絲中均未見鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)(圖3)。

此外，DAPI細(xì)胞核染色結(jié)果表明：再生菌株的幼齡菌絲中可觀察到少量具有單個(gè)細(xì)胞核的菌絲細(xì)胞，相鄰細(xì)胞核之間被隔膜分開(圖4B)，但大部分菌絲細(xì)胞仍呈現(xiàn)雙細(xì)胞核且與單核細(xì)胞共存(圖4A)；出發(fā)菌株的菌絲細(xì)胞中均含有兩個(gè)細(xì)胞核(圖4C)。

A.再生菌株regenerated strains；B. 出發(fā)菌株original strains。圖3 荷伯生氏斜蓋傘再生菌株與出發(fā)菌株的菌絲形態(tài)Fig.3 Hyphal morphologies of the regenerated andoriginal strains of C.hobsonii

A. 再生菌株單、雙核共存現(xiàn)象binuclear and mononuclear coexist phenomenon of regenerated strains；B. 再生菌株單核現(xiàn)象mononuclear phenomenon of regenerated strains；C. 出發(fā)菌株original strains；箭頭表示隔膜the arrows indicate septa in mycelia。圖4 荷伯生氏斜蓋傘再生菌株與出發(fā)菌株細(xì)胞核熒光顯微觀察結(jié)果Fig.4 Fluorescence microscopy of the mycelia of the regenerated and original strains of C. hobsonii

2.4 再生菌株與出發(fā)菌株rpb2和tef基因序列特征

由于異核體菌株基因型雜合，因此在基因Sanger測(cè)序峰圖中通常出現(xiàn)套峰現(xiàn)象，即存在雜合位點(diǎn)；而同核菌株基因型理論上應(yīng)該是純合的[26]，不存在雜合位點(diǎn)。通過對(duì)rpb2和tef基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)(圖5A)，對(duì)擴(kuò)增序列峰圖進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，出發(fā)菌株存在多個(gè)雜合位點(diǎn)，尤其是rpb2基因(圖5B1、5B3)；而再生菌株均未發(fā)現(xiàn)雜合位點(diǎn)(圖5B2、5B4)。

A.荷伯生氏斜蓋傘出發(fā)菌株與再生菌株tef、rpb2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖PCR amplification results of tef and rpb2 from original and regenerated strains of C. hobsonii:M. DL2000 PCR Marker；B. 出發(fā)菌株與再生菌株tef、 rpb2基因部分序列峰圖partial tef and rpb2 sequence chromatograms from original and regenerated strains。 1. 出發(fā)菌株tef 基因tef from original strains；2. 再生菌株tef基因 tef from regenerated strains；3. 出發(fā)菌株rpb2基因 rpb2 from original strains；4. 再生菌株rpb2基因 rpb2 from regenerated strains；NC. 陰性對(duì)照negative control. 紅色箭頭指示套峰the red arrows indicate bimodal site.圖5 荷伯生氏斜蓋傘出發(fā)菌株與再生菌株rpb2、tef基因PCR檢測(cè)及部分序列峰圖Fig.5 PCR identification and partial rpb2 and tef sequence chromatograms from original and regenerated strains of C. hobsonii

3 討 論

本研究采用原生質(zhì)體制備和再生篩選技術(shù)獲得了荷伯生氏斜蓋傘同核體菌株。比較再生菌株與出發(fā)菌株，發(fā)現(xiàn)再生菌株與出發(fā)菌株形態(tài)差異顯著，且菌絲生長(zhǎng)速度顯著低于出發(fā)菌株，這與單倍型純合體菌株的性狀較吻合[10, 25]。本研究顯示荷伯生氏斜蓋傘菌絲不具備雙核擔(dān)子菌常見的鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)，這與Singer[27]認(rèn)為斜蓋傘屬真菌缺乏鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)這一結(jié)論一致，因此不能直接通過有無鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)判斷細(xì)胞核分布情況[24-25]。與常見研究不同，本研究通過原生質(zhì)體再生獲得了雙核同核體菌株(偶見單核)，而非典型的單核體菌株[16-17]。為了確認(rèn)雙細(xì)胞核的異同情況，筆者再次對(duì)兩個(gè)基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序，結(jié)果證實(shí)再生菌株依然不存在雜合位點(diǎn)。此外，同類研究結(jié)果顯示無論是單、雙或多核的同核菌株，其菌落形態(tài)特征與異核菌株均有顯著差異[28]，與本研究結(jié)果相符。綜上，該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)本研究獲得的再生菌株無論是雙核菌絲細(xì)胞還是單核菌絲細(xì)胞，都屬于單倍型純合體。

本研究所采用的原生質(zhì)體再生法常用以獲得異宗結(jié)合型食用菌單核育種材料，在次級(jí)同宗結(jié)合型菌中則獲得同核體[9, 16-17]，如雙孢蘑菇經(jīng)原生質(zhì)體再生獲得的同核菌株[13-15]。因此，認(rèn)為本研究中荷伯生氏斜蓋傘單核原生質(zhì)體經(jīng)再生萌發(fā)后以次級(jí)同宗結(jié)合型真菌生活方式進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，即初生單核菌絲不需經(jīng)過異體菌絲融合就能發(fā)生雙核化，從而完成生活史，故盡管在初期偶見單核現(xiàn)象，其他時(shí)期菌絲細(xì)胞仍呈現(xiàn)雙核狀態(tài)，類似現(xiàn)象在香菇同核菌株中也有見報(bào)道，即在香菇菌絲的不同營(yíng)養(yǎng)發(fā)育階段，可觀察到無核、單核、雙核與多核等多種表型[29]。

此外，本研究?jī)H獲得了其中1種基因型的荷伯生氏斜蓋傘菌株，不符合分離比例為1∶1的預(yù)期值，這與靈芝(Ganodermalucidum)、香菇(Lentinulaedodes)等擔(dān)子菌單核菌株分離結(jié)果類似[17, 24]。一般認(rèn)為可能有以下原因，首先兩種交配型的等位基因或基因表達(dá)差異導(dǎo)致的菌絲生長(zhǎng)速度差異過大[30-33]，其次也可能是在原生質(zhì)體游離過程中線粒體在每個(gè)單核中的分配不均，影響菌絲生長(zhǎng)速度[34-35]。由于其中一種基因型的同核菌絲的再生速度較快，推測(cè)其為再生前期出現(xiàn)的菌落，因此容易獲得；而另一種基因型的同核菌絲再生能力較弱，推測(cè)其為再生后期出現(xiàn)的菌落，但由于異核菌絲生長(zhǎng)極為迅速，導(dǎo)致再生后期出現(xiàn)的菌落被異核菌絲覆蓋，增加了篩選難度[28]。本研究共挑選了約200株再生菌株，最終得到4株同核體菌株。今后工作可以圍繞裂解酶、酶濃度、酶解時(shí)間、菌齡及培養(yǎng)條件等因素進(jìn)行優(yōu)化，以期更高效地獲得2種單倍型同核菌株。