王晨亮 張 菁 劉浩茹 李觀華

江西省九江市第一人民醫(yī)院病理科，江西九江 332000

肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是非小細(xì)胞肺癌的主要亞型之一，是惡性程度最高的癌癥之一，通常在晚期被診斷出，臨床預(yù)后較差，5年生存率低。研究發(fā)現(xiàn)，糖酵解與非小細(xì)胞肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并受到Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rats arcoma viral oncogene homolog，KRAS）的調(diào)控，KRAS 是引發(fā)肺癌的關(guān)鍵基因之一，近年來針對(duì)KRAS 為分子治療靶點(diǎn)的研究越來越多。烏骨藤總苷是烏骨藤輔助抗癌的主要成分，對(duì)胃癌、肉瘤、白血病、肝癌等腫瘤具有抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方烏骨藤膠囊對(duì)Lewis 肺癌小鼠具有抑瘤作用, 并能夠增強(qiáng)其腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞活性，從而提高荷瘤小鼠的免疫功能。目前關(guān)于烏骨藤總苷的研究還較少，烏骨藤總苷的一些作用機(jī)制也尚不明確，本研究主要就烏骨藤總苷對(duì)肺癌細(xì)胞的影響及機(jī)制進(jìn)行研究，為烏骨藤總苷的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H1299 購(gòu)自ATCC。將H1299 細(xì)胞置于37℃、5% CO的培養(yǎng)箱中，使用含有10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的RMPI-1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)。及時(shí)更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)用胰酶消化后進(jìn)行傳代。

1.2 儀器與試劑

烏骨藤總苷（自制，C21 甾體苷類成分含量＞80%）；MTT 噻唑藍(lán)（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：303HO510）；二甲基亞砜（上海鈺博生物科技有限公司，貨號(hào)：YB60313ES60）；RPMI 1640 培養(yǎng)基[愛必信（上海）生物科技有限公司，貨號(hào)：abs9468]；葡萄糖定量試劑盒（美國(guó)AAT Bioquest 公司，貨號(hào)：AAT-40004）；胎牛血清[愛必信（上海）生物科技有限公司，批號(hào)：190A19]；Trizol（上海研卉生物科技有限公司，批號(hào)：50175111）；磷酸緩沖鹽溶液（上海梵態(tài)生物科技有限公司，貨號(hào)：FT21046yy）；通用反轉(zhuǎn)錄試劑盒[金克隆（北京）生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：RE0510-50T]；Lactate Colorimetric Assay Kit Ⅱ乳酸試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司，貨號(hào)：K627-100）；KRAS 抗體（英國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)：ab275876）；GAPDH（5174）、Bax 抗體（5023）、Bcl-2 抗體（3498）、LC3A/B 抗體（4108）、beclin-1 抗體（3495）、HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗（7074）均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology 公司。熒光定量PCR 儀（美國(guó)伯樂Bio-rad 公司，型號(hào)：CFX96Touch）；全自動(dòng)凝膠成像分析儀（上海鄂禾儀器有限公司，型號(hào)：SH-EHE-288）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司，型號(hào)：Varioskan LUX）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司，型號(hào)：CytoFLEX）。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組與處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1299 細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組、烏骨藤總苷低劑量組、烏骨藤總苷高劑量組、 烏骨藤總苷+Vector 組和烏骨藤總苷+KRAS 組。烏骨藤總苷低劑量組和烏骨藤總苷高劑量組分別用終濃度為5、20 mg/ml 的烏骨藤總苷處理H1299 細(xì)胞； 烏骨藤總苷+Vector 組先轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照載體，再用20 mg/ml 的烏骨藤總苷處理； 烏骨藤總苷+KRAS 組先轉(zhuǎn)染KRAS 過表達(dá)載體，再用20 mg/ml的烏骨藤總苷處理；對(duì)照組不轉(zhuǎn)染，用正常培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。

1.3.2 qRT-PCR 檢測(cè)各組H1299 細(xì)胞KRAS 表達(dá)水平 取各組生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液，胰酶消化后離心，將細(xì)胞用PBS 清洗后離心，收集細(xì)胞。用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用qRT-PCR 法檢測(cè)KRAS 的相對(duì)表達(dá)水平，所用引物為：F：5′-CCA ATTGTGAATGTTGGTGTG-3′，R：5′-CCAATTAGA AGGTCTCAACTG-3′。根據(jù)2的方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.3 MTT 檢測(cè)各組H1299 細(xì)胞增殖抑制率 將各組細(xì)胞接種于96 孔板中，每組3 次重復(fù)。在每孔中加入MTT 20 μl，37℃下培養(yǎng)4 h，棄上清液，然后再加入150 μl 的二甲基亞砜 （dimethyl sulfoxide，DMSO），搖床振蕩10 min，充分混勻，使用酶標(biāo)儀在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光值（optical density，OD），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。細(xì)胞抑制率計(jì)算公式為： 細(xì)胞抑制率=對(duì)照組OD－處理組OD/空白對(duì)照組OD×100%。

1.3.4 葡萄糖消耗量和乳酸含量 取各組細(xì)胞離心，收集細(xì)胞上清液，葡萄糖消耗量使用葡萄糖定量試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，采用Lactate Colorimetric Assay Kit Ⅱ乳酸試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中的乳酸含量，具體實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組H1299 細(xì)胞凋亡率 取各組細(xì)胞，加入胰酶消化，棄上清液，加入PBS 液洗滌2次，離心收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至EP 管中，加入200 μl 1×的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，然后在細(xì)胞懸液中加入5 μl的Annexin V 和5 μl 碘化丙錠（propidine iodide，PI）混勻，避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6 Western blot 檢測(cè)KRAS 蛋白和凋亡和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平 將已棄去培養(yǎng)液的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS 清洗3 次，加入蛋白裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA 法對(duì)提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)。用SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，電泳結(jié)束后使用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1 h。加入一抗稀釋液：KRAS（1∶1 000），Bcl-2（1∶1 000），Bax（1∶1 000），LC3A/B（1∶1 000）和beclin-1（1∶2 000），4℃冰箱過夜?；厥找豢?，TBST 洗膜后，加入二抗稀釋液（1∶5 000），室溫孵育1 h，洗膜，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑顯影，拍照并進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組H1299 細(xì)胞KRAS 表達(dá)水平的比較

烏骨藤總苷低劑量組和高劑量組KRAS mRNA和KRAS 蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。烏骨藤總苷高劑量和烏骨藤總苷+Vector組KRAS mRNA 和KRAS 蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。烏骨藤總苷+KRAS 組KRAS mRNA 和KRAS 蛋白表達(dá)水平高于烏骨藤總苷+Vector組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖1，表1）。

圖1 Western blot 檢測(cè)各組H1299 細(xì)胞KRAS 表達(dá)水平

表1 各組H1299 細(xì)胞KRAS 表達(dá)水平比較（n=9，±s）

2.2 各組H1299 細(xì)胞增殖水平的比較

烏骨藤總苷不同劑量組細(xì)胞增殖抑制率均高于對(duì)照組，克隆形成數(shù)均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。烏骨藤總苷+KRAS 組細(xì)胞增殖抑制率低于烏骨藤總苷+Vector 組，克隆形成數(shù)高于烏骨藤總苷+Vector 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖2，表2）。

表2 各組H1299 細(xì)胞增殖水平比較（n=9，±s）

圖2 各組H1299 細(xì)胞克隆形成情況

2.3 各組H1299 細(xì)胞糖酵解水平的比較

烏骨藤總苷低劑量組和高劑量組的葡萄糖消耗量和乳酸含量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；烏骨藤總苷+KRAS 組葡萄糖消耗量和乳酸含量高于烏骨藤總苷+Vector 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表3）。

表3 各組H1299 細(xì)胞葡萄糖消耗量和乳酸含量的比較（n=9，±s）

2.4 各組H1299 細(xì)胞凋亡水平的比較

烏骨藤總苷不同劑量組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。烏骨藤總苷+KRAS 組細(xì)胞凋亡率低于烏骨藤總苷+Vector 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖3，表4）。

表4 各組H1299 細(xì)胞凋亡水平的比較（n=9，±s）

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組H1299 細(xì)胞凋亡率

2.5 各組H1299 細(xì)胞凋亡與自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平

烏骨藤總苷低劑量組和高劑量組Bax、LC3-Ⅱ/Ⅰ和beclin-1 蛋白水平高于對(duì)照組，Bcl-2 蛋白水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。烏骨藤總苷+KRAS 組Bax、LC3-Ⅱ/Ⅰ、beclin-1 蛋白水平低于烏骨藤總苷+Vector 組，Bcl-2 蛋白水平高于烏骨藤總苷+Vector 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。烏骨藤總苷高劑量組和烏骨藤總苷+Vector 組的蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖4，表5）。

圖4 Western blot 檢測(cè)各組H1299 細(xì)胞Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ/Ⅰ、beclin-1 蛋白表達(dá)

表5 各組H1299 細(xì)胞Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ/Ⅰ、beclin-1 蛋白表達(dá)水平比較（n=9，±s）

3 討論

肺癌是常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，其病因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，早期很難發(fā)現(xiàn)且轉(zhuǎn)移性高，在全球范圍內(nèi)都表現(xiàn)出高發(fā)病率和高死亡率。肺癌主要有兩種：小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）在原發(fā)性肺癌中的占比更大，約占85%。烏骨藤又名通關(guān)藤，為蘿藦科多年生攀援植物，主要以干燥藤莖入藥，具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)活血、止血等作用?，F(xiàn)代研究表明，烏骨藤提取物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖都具有良好的抑制作用，且毒副作用小。

KRAS 是非小細(xì)胞肺癌中一種最常見的突變基因，約20%～30%的非小細(xì)胞肺癌存在KRAS 突變。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)KRAS 基因發(fā)生突變，會(huì)導(dǎo)致其編碼的蛋白持續(xù)活化，進(jìn)而激活MAPK 信號(hào)通路、AKT 信號(hào)通路等下游信號(hào)通路，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。周琳等在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，Adagrasib 作為一種針對(duì)KRAS G12C 突變的口服小分子共價(jià)抑制劑，對(duì)NSCLC 治療方案起到了補(bǔ)充作用，且不良反應(yīng)少，耐受性較好，是一種具有潛力的NSCLC 治療藥物。本研究結(jié)果顯示，烏骨藤總苷可明顯抑制KRAS 的表達(dá)水平，且當(dāng)KRAS 過表達(dá)時(shí)肺腺癌細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率會(huì)明顯降低，提示烏骨藤總苷可能通過抑制KRAS 的表達(dá)抑制肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，且抑制作用會(huì)隨著烏骨藤總苷所用劑量的升高而增強(qiáng)。

腫瘤細(xì)胞即使是在氧氣充足的條件下亦表現(xiàn)出明顯的糖酵解活性，消耗大量葡萄糖并產(chǎn)生乳酸，此種異常代謝現(xiàn)象被稱為Warburg 效應(yīng)，Warburg 效應(yīng)在大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞中均存在，可以為腫瘤細(xì)胞提供大量增殖所需的能量，還可以提供對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移有利的酸性環(huán)境，因此抑制糖酵解水平可在一定程度上發(fā)揮抗癌作用。本研究通過檢測(cè)各組細(xì)胞的葡萄糖消耗量和乳酸含量可以發(fā)現(xiàn)，高、低劑量的烏骨藤總苷對(duì)肺腺癌細(xì)胞的糖酵解過程具有抑制作用，可以明顯抑制肺腺癌細(xì)胞的Warburg 效應(yīng)，減少腫瘤細(xì)胞能量供給，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力。郭舜等研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素可同時(shí)參與肝癌細(xì)胞糖酵解及谷氨酰胺代謝從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖降低肝癌細(xì)胞能量代謝水平。且研究發(fā)現(xiàn)，DEPDC1 可能通過調(diào)節(jié)KRAS/MEK/ERK 信號(hào)通路來影響糖酵解，進(jìn)而影響肝細(xì)胞癌進(jìn)展。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本文結(jié)果具有一致性。

腫瘤細(xì)胞往往具有無限復(fù)制潛能、凋亡抵抗等能力，因此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬也是治療腫瘤的重要策略之一。Bcl-2 家族蛋白是在凋亡過程中起重要作用的蛋白家族，其中Bax 有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，而Bcl-2 具有抗凋亡作用。LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和beclin-1 是參與調(diào)控細(xì)胞自噬過程的重要蛋白，Beclin-1 是自噬重要的正調(diào)節(jié)因子，在自噬起始階段起關(guān)鍵作用；LC-3 是自噬體膜的標(biāo)記物，有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式，且LC3-Ⅱ含量的多少在某種程度上反映了細(xì)胞的自噬活性。在本研究結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，烏骨藤總苷低劑量組和高劑量組對(duì)肺腺癌細(xì)胞凋亡和自噬過程的相關(guān)蛋白具有調(diào)控作用，且過表達(dá)KRAS 時(shí)會(huì)反轉(zhuǎn)烏骨藤總苷的作用效果，即烏骨藤總苷可能通過調(diào)控KRAS 的表達(dá)從而對(duì)凋亡和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)起調(diào)控作用，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的凋亡和自噬，從而控制腫瘤細(xì)胞數(shù)量。

綜上所述，烏骨藤總苷可以通過抑制KRAS 的表達(dá)，調(diào)控肺腺癌細(xì)胞的糖酵解、凋亡和自噬過程，從而對(duì)肺腺癌細(xì)胞的增殖起到抑制作用，且烏骨藤總苷對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用具有劑量依賴性。