張 晨 陳 楓 辛競妍 朱雨菲 李 矜 吳長江 謝文瑩 張濤靜

1.北京中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100078

背根神經(jīng)元（dorsal root ganglion neurons，DRGn）是人體內(nèi)重要的感覺神經(jīng)元，位于血神經(jīng)屏障之外的特殊生理位置使其暴露在全身代謝和缺氧應(yīng)激下，在高糖環(huán)境中更容易受到損害[1]。DRGn 細胞凋亡是糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）發(fā)生發(fā)展的重要因素[2-3]。既往研究發(fā)現(xiàn)，高糖能抑制DPN 大鼠DRGn 細胞活性，糖絡(luò)寧可以降低高糖引起的細胞凋亡水平[4-5]，其作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下的蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）/C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）凋亡通路有關(guān)[6]，而更深層的介導(dǎo)基因尚未明確。微RNA（microRNA，miRNA）在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下是調(diào)控細胞從保護性的未折疊蛋白反應(yīng)轉(zhuǎn)至激活凋亡的關(guān)鍵因子[7-8]，其中miR-211 依賴PERK 誘導(dǎo)而作用于促凋亡轉(zhuǎn)錄因子CHOP 的表達[9]。本研究以miR-211 為切入點，通過體外實驗觀察糖絡(luò)寧對大鼠DRGn 凋亡的影響及miR-211 在其中的作用，探討其治療DPN 的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

用于制備含藥血清和空白血清的SPF 級SD 大鼠[60 只，8 周齡雄性，體重（200±30）g]及用于提取DRGn 細胞的SPF 級SD 懷孕大鼠均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006。大鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學動物實驗中心，實驗室環(huán)境為國標GB14925-2001[10]規(guī)定的動物實驗設(shè)施及大鼠SPF 級屏障環(huán)境。本研究經(jīng)北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準（201811）。實驗中心溫度（20±2）℃，濕度45%～65%，12 h 明暗交替。

1.2 實驗用藥

糖絡(luò)寧制劑（由生黃芪、丹參、川牛膝、狗脊、全蝎組成）為北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院藥房提供，濃度為生藥0.5 g/ml。

1.3 主要試劑及儀器

BeyoRTTMⅡcDNA 第一鏈合成試劑盒（碧云天公司，批號：D7168S）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（MDL，批 號：MD913053）、Annexin V-FITC/PI Kit/凋亡檢測試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司，批號：FXP018）、Neurobasal 培養(yǎng)基（Gibco，批號：21103049）、兔抗PERK、轉(zhuǎn)錄激活因子4（activator of transcription 4，ATF4）、真核細胞起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）（abcam，批號：ab186284、ab216839、ab32157）、兔抗CHOP（Cell Signaling 公司，批號：L63F7）、低溫離心機（德國Sigma 公司，型號：3-30K）、熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國Applied biosystems，型 號：StepOne Softwar），電泳儀（北京百晶生物技術(shù)有限公司，型號：BG-subMIDI）。

1.4 研究方法

1.4.1 糖絡(luò)寧含藥血清的制備 雄性SD 大鼠60 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，采用隨機數(shù)字表法將其分為糖絡(luò)寧含藥血清組（30 只）和空白血清組（30 只），分別以糖絡(luò)寧組方生藥2.5 g/（kg·d）灌胃和等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)給藥10 d，末次給藥后2 h 內(nèi)以2%戊巴比妥（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，3000 次/min重復(fù)10 min（半徑95 mm，溫度4℃）離心，分離血清水浴滅活，過濾除菌后，-80℃環(huán)境中冷凍保存。

1.4.2 DRGn 細胞分離培養(yǎng)及分組 DRGn 細胞分離培養(yǎng)參照既往實驗[11-12]，神經(jīng)元專用培養(yǎng)基中細胞貼壁達70%～80%后，進行分組。將細胞分為正常組、高糖組、糖絡(luò)寧組、miR-211 抑制劑陰性組和miR-211 抑制劑組。正常組給予10%空白血清+神經(jīng)元專用培養(yǎng)基；高糖組給予10%空白血清+高糖神經(jīng)元專用培養(yǎng)基（含50 mmol/L 葡萄糖）；糖絡(luò)寧組予10%糖絡(luò)寧含藥血清+高糖神經(jīng)元專用培養(yǎng)基；miR-211 抑制劑陰性組和miR-211 抑制劑組分別先予空載體和miR-211 抑制劑載體轉(zhuǎn)染DRGn 細胞，再予10%空白血清+高糖神經(jīng)元專用培養(yǎng)基培養(yǎng)。各組細胞干預(yù)24 h，隨后收集細胞進行相關(guān)檢測。

1.4.3 流式細胞儀檢測 經(jīng)胰酶消化、1 000 次/min 重復(fù)5 min 二次離心（離心半徑95 mm，溫度4℃）及稀釋（調(diào)節(jié)濃度為1×105～5×105個/ml）后收集細胞懸液于流式管中。室溫避光孵育，孵育5 min 后加入10 μl碘化丙錠溶液、400 μl PBS，立刻進行流式檢測，用Cell Quest 軟件進行分析，繪制雙色散點圖。

1.4.4 實時熒光定量PCR 提取各組實驗細胞miR-211，使用BeyoRTTMⅡcDNA 第一鏈合成試劑盒將miR-211合成cDNA，根據(jù)引物設(shè)計原則，利用Primer 6 設(shè)計合成引物，引物序列見表1。取上述cDNA 及對應(yīng)引物，開始qRT-PCR 反應(yīng)程序，反應(yīng)體系共20 μl：cDNA 2 μl，master mix 10 μl，正向引物1 μl，反向引物1 μl，ddH2O 6 μl。反應(yīng)條件見表2。每次反應(yīng)均設(shè)陰性平行對照組，實驗重復(fù)3 次，根據(jù)得到的熒光信號計算Ct 值及基因的相對表達量。

表1 miR-211 引物序列

表2 聚合酶鏈式反應(yīng)條件

1.4.5 Western blot 采用細胞懸液5 倍體積的細胞裂解液，提取總蛋白，經(jīng)BCA 試劑盒進行濃度測定后，SDS-PAGE 法分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉溶液封閉搖動1 h，采用兔PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，并用HRP 標記山羊抗兔IgG（H+L）室溫下孵育60 min（1∶4 000），最終顯色成像獲得蛋白條帶，Image J 軟件計算灰度值。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 五組細胞凋亡率比較

高糖組細胞凋亡率高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。高糖組與miR-211 抑制劑陰性組細胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。糖絡(luò)寧組和miRNA-211 抑制劑組細胞凋亡率低于高糖組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見圖1～2。

圖1 各組細胞凋亡率散點圖

圖2 五組細胞凋亡率比較（n=3）

2.2 五組miR-211 基因表達情況比較

高糖組miR-211 基因表達高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。高糖組與miR-211 抑制劑陰性組miR-211 基因表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。糖絡(luò)寧組和miR-211 抑制組miR-211 基因表達低于高糖組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 五組miR-211 基因表達情況比較（n=3）

2.3 五組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達水平比較

高糖組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。高糖組與miR-211 抑制劑陰性組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。糖絡(luò)寧組和miRNA-211抑制組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達水平低于高糖組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見圖4～5。

圖4 五組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達條帶圖

圖5 五組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達水平比較

3 討論

糖尿病周圍神經(jīng)病變屬于中醫(yī)“消渴病痹癥”范疇，以氣虛血瘀或陰虛血瘀，氣陰兩虛夾瘀，陰陽兩虛夾痰瘀，陽虛寒凝，肝腎虧虛的規(guī)律動態(tài)演變[13-15]。高彥彬教授基于絡(luò)病理論，認為其病機本質(zhì)為氣陰兩虛、脈絡(luò)瘀阻，治療上強調(diào)以滋陰補氣、活血化瘀通絡(luò)為要，研制出中藥成方糖絡(luò)寧，臨床療效確切[16]。經(jīng)既往研究證實，糖絡(luò)寧可以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的損害，抑制坐骨神經(jīng)及施萬細胞中PERK/IRE1α-CHOP、PI3K/Akt通路的表達，改善施萬細胞及DRGn 細胞凋亡[17-22]。

目前臨床普遍認為，血糖升高會激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，長期持續(xù)的應(yīng)激和細胞損傷啟動細胞凋亡，但在應(yīng)激背景下如何協(xié)調(diào)其他通路啟動細胞凋亡，其轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵節(jié)點仍在探索。研究發(fā)現(xiàn)，PERK 信號依賴性的miR-211 可以抑制生物鐘協(xié)調(diào)新陳代謝和晝夜節(jié)律，限制蛋白質(zhì)超負荷，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下調(diào)節(jié)凋亡的潛在靶點[23]。本團隊前期通過基因芯片篩選發(fā)現(xiàn)，糖絡(luò)寧對DPN 的治療作用與miR-211 的下調(diào)有關(guān)[24]，基于前期實驗提出設(shè)想：糖絡(luò)寧可能通過作用于miR-211下調(diào)PERK/CHOP 凋亡通路而保護背根神經(jīng)元。本研究結(jié)果顯示，高糖組細胞miR-211 與PERK/CHOP通路均顯著升高，且呈現(xiàn)出高凋亡率，提示高糖誘導(dǎo)下的背根神經(jīng)節(jié)中，miR-211 顯著過表達可促進DRGn 細胞中PERK/CHOP 通路的表達及細胞凋亡，可能導(dǎo)致細胞功能障礙。糖絡(luò)寧組DRGn 細胞凋亡率降低，miR-211 和PERK/CHOP 通路表達下調(diào)，達到與miR-211 基因沉默的相似效果，提示糖絡(luò)寧可能通過作用于miR-211 下調(diào)凋亡通路而保護DRGn細胞，治療DPN。

DPN 是糖尿病并發(fā)癥中較為特殊的一種，治療局限在預(yù)防性管理與疼痛控制上[25-28]，針對病理機制的治療方法仍在探索。目前臨床主要關(guān)注神經(jīng)在營養(yǎng)超負荷下的能量代謝問題，糖尿病營養(yǎng)物質(zhì)代謝紊亂時神經(jīng)元的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體功能如何調(diào)節(jié)、過量葡萄糖和脂質(zhì)對神經(jīng)能量的作用是否協(xié)同一致等尚未被解釋。針對神經(jīng)的能量利用是開發(fā)DPN 有效療法的途徑，miRNA 被認為是其中的關(guān)鍵靶點[29]。本研究從細胞角度分析糖絡(luò)寧對DPN 模型大鼠背根神經(jīng)元凋亡的作用，結(jié)果顯示其機制與抑制miR-211 表達有關(guān)，但miR-211 如何靶向調(diào)控基因抑制凋亡及糖絡(luò)寧如何抑制miR-211 的表達仍需進一步探索。