武 華，林偉東，孟利佳，陰雅潔，喬思娜，倪維玲，侯紹華，徐倩倩，董世山,5*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；2.上海交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，上海 200025；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193; 4.河北創(chuàng)安生物科技有限公司，河北 保定 071001；5.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病病原生物學(xué)華北科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，河北 保定 071001)

新型鴨呼腸孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)為正呼腸孤病毒屬(呼腸孤病毒科，刺突呼腸孤病毒亞科)，作為一種新出現(xiàn)的病毒，不同于以往的番鴨呼腸孤病毒(muscovy duck reovirus,MDRV)和禽呼腸孤病毒(avrian reovirus,ARV)。MDRV也稱(chēng)鴨正呼腸孤病毒，于1972年首次從法國(guó)番鴨中分離出來(lái)[1]。但MDRV的經(jīng)典病毒分離株對(duì)北京鴨幼鴨和1日齡雞并無(wú)致病性[2]。2005年后，我國(guó)東南地區(qū)番鴨主產(chǎn)區(qū)陸續(xù)發(fā)生了一種新的番鴨傳染病，以肝脾出血壞死為主。該病的病原體被確認(rèn)為一種新型的番鴨呼腸孤病毒(new type of MDRV,N-MDRV)[3]。從死亡的北京鴨身上分離出的這種新型的呼腸孤病毒，在試驗(yàn)室感染時(shí)未導(dǎo)致死亡或出現(xiàn)明顯的臨床癥狀[4]。但在2011 年，我國(guó)在北京鴨體內(nèi)分離出一種可能由N-MDRV演變而來(lái)的病毒。這種新分離的病毒對(duì)1日齡番鴨具有高致病性，鴨胚在感染后 48～72 h內(nèi)死亡，死亡胚胎表現(xiàn)出肝臟腫脹。通過(guò)電鏡觀察病原體為球形、帶刺的病毒顆粒，與呼腸孤病毒科家族成員的顆粒一致。該分離株被命名為DRV-TH11，我國(guó)將該類(lèi)病毒正式定為NDRV[5]。

與先前所報(bào)道的所有 DRV 感染相比，NDRV 感染表現(xiàn)出明顯不同的生物學(xué)特征，包括更高的毒力和更廣泛的宿主物種[6]。目前 NDRV 的進(jìn)化來(lái)源依舊并未有確鑿的證據(jù)和結(jié)論，根據(jù)基因組信息顯示[7]，與MDRV和ARV的基因組相似，除了S1、M2以及S3基因外，NDRV其余7個(gè)基因都是與MDRV具有更高的同源性。因此其進(jìn)化來(lái)源更可能是在MDRV的骨架上，部分基因與ARV或其他病毒發(fā)生交換重組而產(chǎn)生的新病毒。其中包括S1基因中新產(chǎn)生的P18蛋白[8]，類(lèi)似于ARV中的核質(zhì)穿梭蛋白P17[9-11]，提示這可能是導(dǎo)致NDRV擴(kuò)大宿主范圍的原因。同樣在 S1 基因中編碼的外衣殼蛋白 σC 具有極重要生物學(xué)功能，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，但它在 MDRV 和 ARV 中的同源性低，表明 NDRV 中的 σC 蛋白已產(chǎn)生高度變異[12]。基于 σC 編碼基因核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，可將NDRV與MDRV和ARV進(jìn)行鮮明分類(lèi)[13]，因此，利用 σC 差異性和其在NDRV中的特異性，可用于檢測(cè) NDRV 感染。且由于 σC 蛋白為 NDRV 的外衣殼蛋白[14]，在機(jī)體受病毒感染后的免疫應(yīng)答中，更容易誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。

現(xiàn)階段我國(guó)大部分水禽養(yǎng)殖地區(qū)都已出現(xiàn) NDRV 感染，但感染 NDRV 的成年鴨群初期并無(wú)明顯癥狀[15]，且容易造成垂直傳播，而目前也沒(méi)有相應(yīng)成型的商品化試劑盒可用于檢測(cè)NDRV抗體，給臨床診斷帶來(lái)困難。本課題組先前的研究以包涵體形式的 σC 蛋白作為研究對(duì)象[16]，本研究?jī)?yōu)化其基因序列和改善表達(dá)條件后，收獲大量可溶性表達(dá)的 σC 蛋白，并利用其建立更高靈敏性和特異性的間接ELISA(indirect ELISA,iELISA)方法用于 NDRV 檢測(cè)。與全病毒 iELISA 共同檢測(cè)大量質(zhì)控血清后發(fā)現(xiàn)，其符合率為100%，且 σC 蛋白包被板彌補(bǔ)了全病毒包被板檢測(cè)樣品D值低的缺點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 毒株、載體、菌體及血清NDRV流行株、pET-32a(+)由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)保存；Trans BL21 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；NDRV 質(zhì)控陽(yáng)性血清為免疫后的鴨血清由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)保存；DRV、ARV、DTMUV、IBV陽(yáng)性血清均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)保存。

1.2 主要試劑Easy pure Viral DNA/RNA Kit 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Gel Extraction Kit 膠回收試劑盒、Plasmid Mini Kit Ⅰ質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自 OMEGA 公司；蛋白Marker、QuickCutTMBamHⅠ、QuickCutTMXhoⅠ均購(gòu)自 TaKaRa 公司；BSA 試劑盒購(gòu)自碧云天公司；HRP山羊抗鴨IgG 購(gòu)自 Abbkine 公司；抗體稀釋液、雙組份 TMB 顯色液購(gòu)自 Solarbio 公司;血清由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)保存。

1.3 重組蛋白的表達(dá)和純化根據(jù) GenBank 登記的 NDRV(MT598196)基因組序列，搜索 S1 中的 σC 基因序列，通過(guò) DNAStar軟件對(duì)其進(jìn)行分析，并根據(jù)大腸桿菌密碼子偏嗜性規(guī)律對(duì)基因片段進(jìn)行密碼子優(yōu)化，在基因片段兩端分別加上BamHⅠ和XhoⅠ限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，優(yōu)化后的基因片段交由金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行合成。利用BamHⅠ和XhoⅠ將合成的基因片段定向克隆入原核表達(dá)載體pET-32a(+)相應(yīng)位點(diǎn)之間，獲得重組質(zhì)粒pET-32a-NDRV-σC。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Trans BL21 感受態(tài)細(xì)胞中，將含有 pET-32a-NDRV-σC 的菌液接種到含有 Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 180 r/min 振蕩培養(yǎng)至D450值0.6～0.8，而后分別加入IPTG至終濃度0.10，0.25，0.50，1.00 mmol/L 16℃誘導(dǎo)15 h。分別收集菌液進(jìn)行超聲破碎后，12 000 r/min 離心5 min，棄上清，用40 μL PBS 重懸沉淀，加入8 μL 5×loading buffer，煮沸10 min 后進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，觀察蛋白表達(dá)情況。根據(jù)蛋白純化試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)表達(dá)的蛋白過(guò) His 柱純化后，再進(jìn)行陰離子交換柱進(jìn)一步純化。將純化好的蛋白送上海啟研生物科技有限公司做質(zhì)譜分析鑒定。

1.4 NDRV iELISA方法的建立采用方陣滴定法分別確定最佳抗原包被濃度和樣品稀釋度，再優(yōu)化二抗工作濃度和顯色反應(yīng)時(shí)間等，最后根據(jù)D450值和P/N值建立iELISA方法。

1.4.1陰陽(yáng)臨界值的確定 NDRV 84 份質(zhì)控陽(yáng)性血清、180份質(zhì)控陰性血清按照最佳樣品稀釋度稀釋后進(jìn)行i ELISA 檢測(cè)，測(cè)定D450值，計(jì)算陽(yáng)性百分比(P%=待檢樣品D450值/陽(yáng)性對(duì)照平均值D450值×100%)。使用 GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用非參數(shù)法構(gòu)建 ROC 曲線，以特異性和靈敏性最高值時(shí)作為此方法的陰陽(yáng)性臨界值，并確定該方法的特異性和靈敏性。

1.4.2特異性檢測(cè) 使用本研究建立的iELISA方法分別檢測(cè)DRV、ARV、DTMUV、IBV的陽(yáng)性血清，同時(shí)以 NDRV 的陽(yáng)性血清做陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)孔，從而驗(yàn)證此方法的特異性。

1.4.3重復(fù)性檢測(cè) 制作3批試劑盒(分別命名為20210501，20210511，20210521)，使用質(zhì)控陽(yáng)性血清(P1、P2、P3)和質(zhì)控陰性血清(N1、N2、N3、N4、N5)分別測(cè)定試劑盒批內(nèi)和批間重復(fù)性。

1.4.4全病毒包被板與 σC 蛋白包被板比較性試驗(yàn) 由于目前市場(chǎng)沒(méi)有檢測(cè) NDRV的試劑盒來(lái)進(jìn)行比較，因此使用實(shí)驗(yàn)室先前建立的NDRV iELISA檢測(cè)方法[16](利用差速離心純化后的 NDRV作為包被抗原)和本研究建立的檢測(cè)方法進(jìn)行比較。通過(guò)分別檢測(cè)84份質(zhì)控陽(yáng)性血清和180份質(zhì)控陰性血清，比較兩種檢測(cè)方法的差異性。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白的表達(dá)純化收集誘導(dǎo)后的菌體，用 PBS 進(jìn)行重懸后超聲破碎，離心后分別取上清和沉淀制樣，在終濃度 0.25 mmol/L IPTG的條件下，16℃ 誘導(dǎo)15 h后，σC 蛋白在上清獲得最大的表達(dá)量，出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，大小約為 37 kDa,與預(yù)期相近。而后大量表達(dá)并進(jìn)行純化，SDS-PAGE 結(jié)果顯示，利用鎳柱親和層析純化后去除了大量雜蛋白。經(jīng)陰陽(yáng)離子交換柱進(jìn)一步純化后成功獲得大小約為 37 kDa，純度大于 90% 的 σC 目的蛋白(圖1)，經(jīng) BSA 蛋白定量后，每升菌液可純化出約32 mg 蛋白。純化后的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定后確定為 σC 蛋白。表明通過(guò)對(duì)翻譯過(guò)程和誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，可以實(shí)現(xiàn) σC 蛋白可溶性表達(dá)，利用該類(lèi)純化方法可成功獲得純度良好的 σC 蛋白。

M.蛋白Marker；1.上清中的 σC 蛋白；2.沉淀中的 σC 蛋白；3.穿透；4.5% Eloution Buffer；5.Eloution Buffer濾液；6.Eloution Buffer；7.穿透；8.陰陽(yáng)離子交換柱純化后的 σC 蛋白

2.2 NDRV iELISA方法的建立通過(guò)方陣滴定法對(duì)各組的研究，最終確定的最佳試驗(yàn)條件為：抗原包被質(zhì)量濃度0.5 μg/孔，最佳樣品稀釋度1∶320。優(yōu)化后的最佳二抗工作濃度1∶10 000，底物反應(yīng)時(shí)間30 min。

2.3 陰陽(yáng)臨界值的確定對(duì)84份質(zhì)控陽(yáng)性血清和和180份質(zhì)控陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示陽(yáng)性血清和陰性血清分布在2個(gè)明顯不同的范圍之內(nèi)(圖2)。使用GraphPad Prism 8.0 軟件分析檢測(cè)結(jié)果并繪制靈敏性和特異性相關(guān)的ROC曲線(圖3)。通過(guò) Youden 指數(shù)選擇靈敏性和特異性最佳的P值作為陰陽(yáng)臨界值。本研究中，曲線下面積為1.00，P=0.076，此時(shí)的特異性和靈敏性均為100%。

A.豐度分布特征；B.從頭測(cè)序驗(yàn)證

A.樣品D450值的點(diǎn)狀分布;B.ROC曲線

2.4 特異性試驗(yàn)采用本研究建立的 iELISA 方法分別檢測(cè) DRV、ARV、DTMUV、IBV 的陽(yáng)性血清，與NDRV 陽(yáng)性血清做陰陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，結(jié)果顯示本研究建立的 iELISA方法檢測(cè) DRV、ARV、DTMUV、IBV 陽(yáng)性血清時(shí)均顯示為陰性(表1)，說(shuō)明此方法具有良好的特異性。

表1 特異性試驗(yàn)檢測(cè)

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)本研究建立的 iELISA方法批內(nèi)變異系數(shù)最高為8.56%，批間變異系數(shù)最高為6.27%，均小于10%，說(shuō)明建立的方法具有良好的重復(fù)性(表2，3)。

表2 批內(nèi)重復(fù)性結(jié)果

表3 批間重復(fù)性結(jié)果

2.6 全病毒包被板與 σC 蛋白包被板比較在檢測(cè)的84份陽(yáng)性質(zhì)控血清與180份陰性質(zhì)控血清中，全病毒包被板檢測(cè)出陽(yáng)性 84份，陰性 180份；σC 蛋白包被板檢測(cè)出陽(yáng)性84份，陰性180份，兩種包被板檢測(cè)符合率為100%(表4)。其中，全病毒包被比 σC 蛋白包被時(shí)檢測(cè)到的D450值低，前者弱陽(yáng)性的P/N為 1.2，而后者弱陽(yáng)性的P/N為 4.1。

表4 全病毒包被板與 σC 蛋白包被板比較結(jié)果

2.7 iELISA方法的臨床應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室保存的50份經(jīng)RT-PCR檢測(cè)的臨床樣本中，其中從肝臟中擴(kuò)增出NDRV的有38份，12份為陰性。

將這50份樣品所對(duì)應(yīng)的血清，用本研究建立的iELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示35份為陽(yáng)性，15份為陰性。與先前RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果比較，兩種檢測(cè)方法符合率為90%(表5)。

表5 iELISA方法的臨床應(yīng)用結(jié)果

3 討論

由于感染 NDRV 的鴨群早期不會(huì)出現(xiàn)特異性癥狀，常用的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，如RT-PCR、熒光定量RT-PCR、RT-LMAP和免疫熒光(IFA)等方法操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴并不適用于基層應(yīng)用，因此迫切需要一種快速、靈敏的檢測(cè)方法[17-18]。ELISA 試劑盒操作簡(jiǎn)單，特異性和靈敏性良好，同時(shí)能檢測(cè)大批量樣品的優(yōu)點(diǎn)適用于大型水禽養(yǎng)殖業(yè)，但現(xiàn)階段中國(guó)暫無(wú)成型的NDRV ELISA試劑盒。本研究建立的iELISA方法，操作簡(jiǎn)單、特異性和靈敏性均表現(xiàn)良好，為 NDRV 臨床診斷及疫苗免疫抗體監(jiān)測(cè)提供科學(xué)有效的血清學(xué)檢測(cè)方法。

iELISA 方法對(duì)多種疾病的診斷均表現(xiàn)出良好的特異性和靈敏性，將其用于 NDRV 上也有較好的效果。近年來(lái)有許多學(xué)者建立了關(guān)于 NDRV 的iELISA 檢測(cè)方法。隨著對(duì) NDRV 分子生物學(xué)研究深入，通過(guò)表達(dá) NDRV 相關(guān)蛋白來(lái)建立 ELISA 檢測(cè)方法成為研究趨勢(shì)，其中對(duì) σB 和 σC 蛋白的研究最為深入[19-22]。σC 蛋白為病毒的外衣殼蛋白，主要以同源三聚體的結(jié)構(gòu)形式存在，對(duì)病毒吸附、增殖和形成合胞體起重要作用，同時(shí)能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生群特異性中和抗體[23-24]。然而在以往的研究中，關(guān)于 σC 蛋白的原核表達(dá)都以包涵體的形式存在，導(dǎo)致蛋白在純化環(huán)節(jié)操作較為復(fù)雜，且在變性復(fù)性過(guò)程中易失敗或蛋白純化量較低，以包涵體形式存在的蛋白免疫原性比可溶性蛋白差[25]。為了表達(dá)出可溶的、免疫原性強(qiáng)的 σC 蛋白，本研究在不改變氨基酸序列的前提下，按照大腸桿菌密碼子偏嗜性規(guī)律設(shè)計(jì)合成了 σC 蛋白基因片段。另一方面，σC 蛋白在NDRV病毒內(nèi)主要以同源三聚體形式成為結(jié)構(gòu)蛋白[26]，本身具有形成多聚體的內(nèi)在條件，同時(shí)由于T7啟動(dòng)子的強(qiáng)啟動(dòng)效應(yīng)[27]，過(guò)快地表達(dá)可能導(dǎo)致蛋白的不正確折疊或形成包涵體。因此本研究選用低溫和低誘導(dǎo)劑的辦法同步降低表達(dá)速率以促進(jìn)其可溶性的表達(dá)。最終在0.25 mmol/L IPTG和16℃誘導(dǎo)15 h后，獲得最大可溶性表達(dá)的 σC 蛋白，1 L菌液純化后可收獲約32 mg σC 蛋白。σC蛋白被認(rèn)為是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生NDRV中和抗體的最重要蛋白[28]，而本研究改善的大量表達(dá)可溶性σC 蛋白方法，為NDRV亞單位疫苗的制備提供簡(jiǎn)便高效的途徑。

將 σC 蛋白用于建立iELISA檢測(cè)方法，經(jīng)方陣滴定法確定以0.5 μg/孔包被酶標(biāo)板，且最佳樣品稀釋度為1∶320，探索最佳陰陽(yáng)臨界值，該值的確定對(duì)整個(gè)方法的建立和后期樣品的檢測(cè)至關(guān)重要[29-30]，主要表現(xiàn)在它的變化對(duì)應(yīng)著靈敏性和特異性在檢測(cè)中互為增減，但二者在檢測(cè)最佳值具備最高的統(tǒng)一性，因此可以利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法探索最佳臨界值。本研究通過(guò)對(duì)84份陽(yáng)性和180份陰性質(zhì)控血清進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后，繪制了與特異性和靈敏性相關(guān)的 ROC 曲線來(lái)選擇合適的陰陽(yáng)臨界值為0.076，此時(shí)的靈敏性和特異性均為100%。由于 NDRV 與 DRV 和ARV都屬于同種屬病毒，有相似的形態(tài)學(xué)特征，其中與 ARV血清型最為相似，包括最常見(jiàn)的禽類(lèi)疾病如 DTMUV、IBV 等的抗血清都可能在檢測(cè)過(guò)程中與其產(chǎn)生交叉反應(yīng)[31]。本研究中，選取來(lái)源明確的多種血清使用建立的 ELISA 方法進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果表明本方法能有效區(qū)分多種傳染病與 NDRV,充分表明本研究建立的 NDRV iELISA 方法具有良好的特異性。

全病毒作為包被抗原時(shí)可以結(jié)合病毒不同抗原或抗原表位產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，而單一蛋白作為包被抗原時(shí)只能結(jié)合相應(yīng)抗體，因此以全病毒包被板建立間接 ELISA 方法要比蛋白包被板效果好[32]。本研究采用的全病毒包被板是使用經(jīng)差速離心純化后的 NDRV 病毒以20 μg/孔進(jìn)行包被的，檢測(cè)質(zhì)控樣品后其檢測(cè)結(jié)果與 σC 蛋白包被板檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，全病毒包被板陽(yáng)性對(duì)照D450值比 σC 蛋白包被板值高，但樣品檢測(cè)數(shù)值中，σC 蛋白包被板比全病毒包被板高，其全病毒包被板的弱陽(yáng)性P/N值約為1.2，σC 蛋白包被板的弱陽(yáng)性P/N值約為4。出現(xiàn)這種差異的原因可能是因?yàn)?σC 蛋白為外衣殼蛋白，比其他蛋白更易誘發(fā)機(jī)體識(shí)別，甚至產(chǎn)生更高的抗體，而全病毒包被板可檢測(cè)到除 σC 蛋白外的其他編碼蛋白，或純化的病毒可能有其他雜質(zhì)，從而導(dǎo)致抗原與抗體并不能很好地結(jié)合。

本研究改善了表達(dá)可溶性 σC 蛋白方法，可應(yīng)用于未來(lái) NDRV亞單位疫苗的制備。并利用其成功建立了檢測(cè) NDRV 抗體的iELISA 方法，具有良好的特異性和靈敏性，彌補(bǔ)了全病毒包被板檢測(cè)樣品D值偏低的缺點(diǎn)。為水禽養(yǎng)殖場(chǎng)提供了可靠的 NDRV ELISA 檢測(cè)方法，也為未來(lái)關(guān)于NDRV的檢測(cè)提供了參考。