陳胡羚，辛怡霖，侯佳琪，唐 熙，王虹雅，李青云，張 欣，李引乾*

(1.四川省北川羌族自治縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 北川 6227502；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊陵 712100)

氟苯尼考(florfenicol,FFC)是目前臨床上應(yīng)用廣泛的動(dòng)物廣譜抗菌藥[1-3]，在生物藥劑學(xué)分類(lèi)系統(tǒng)(biopharmaceutics classification system,BCS)中屬于低溶解度、高滲透性的藥物。將藥物通過(guò)納米技術(shù)制成納米晶體，可以有效改善藥物的溶解度[4-5]、溶出度[6-8]及生物利用度，改善藥物的吸收，降低藥物殘留，保障食源性動(dòng)物的安全性[9-10]。乳化溶劑揮發(fā)法是制備藥物納米晶的常用技術(shù)之一[11-12]，采用乳化溶劑揮發(fā)法制備納米晶時(shí)，影響納米粒徑大小的因素主要有有機(jī)相與水相的體積比、勻漿的速度和時(shí)間、勻質(zhì)的壓力和次數(shù)以及使用的表面活性劑濃度等[13]。乳化溶劑揮發(fā)法的優(yōu)勢(shì)就在于原理及操作簡(jiǎn)單、制備的納米晶穩(wěn)定。目前已有多種FFC的劑型，但尚無(wú)采用乳化溶劑揮發(fā)法制備氟苯尼考納米晶(florfenicol nanocrystal,FFC-NC)的研究。因此，本研究擬采用乳化溶劑揮發(fā)法制備FFC-NC，為FFC-NC的制備提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑FFC(FB2002051)，江蘇恒盛藥業(yè)有限公司；FFC標(biāo)準(zhǔn)品(H1715060)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泊洛沙姆188(T24J10Z80481)，上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水乙醇(191127)，四川西隴科學(xué)有限公司；乙酸乙酯(20191222)，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；N,N-二甲基乙酰胺(20190613)，蘇丹Ⅲ(20190506)、三水合亞甲基藍(lán)(20190402)、光譜純溴化鉀(20191226)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 處方工藝本試驗(yàn)采用乳化溶劑揮發(fā)法[11]，以泊洛沙姆188/乙醇/乙酸乙酯作為納米乳體系制備FFC-NC。將3～5 g FFC原粉溶解于100 mL乙酸乙酯，加入0.25 mL N,N-二甲基乙酰胺助溶，置于45℃的恒溫水浴鍋中水浴10 min后，用0.45 μm微孔濾膜除雜質(zhì)得有機(jī)相。將泊洛沙姆188按對(duì)應(yīng)比例添加至乙醇中，置于45℃的恒溫水浴鍋中，待泊洛沙姆188完全溶解，即得混合表面活性劑。以有機(jī)相和混合表面活性劑的體積比為1∶2充分混合均勻后，置于磁力攪拌器上攪拌，邊攪拌邊緩慢勻速滴入一定體積比的水相，制得FFC初乳。對(duì)FFC初乳進(jìn)行高速勻漿和高壓勻質(zhì)后得透明的均一體系，即FFC納米乳。然后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將納米乳中所含的乙酸乙酯、乙醇等有機(jī)溶劑通過(guò)旋蒸去除，得FFC納米混懸液，將納米混懸液在-60℃條件下冷凍干燥后，即得到FFC-NC。

1.3 單因素試驗(yàn)本試驗(yàn)篩選最優(yōu)制備條件的主要依據(jù)為FFC納米混懸液的粒徑大小，在進(jìn)行單因素試驗(yàn)前，首先根據(jù)多次預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定有機(jī)相與混合表面活性劑的體積比為1∶2。單因素試驗(yàn)所考察的6個(gè)影響因子如下：有機(jī)相與水相的體積比、泊洛沙姆188的濃度、高速勻漿的速度與時(shí)間，高壓勻質(zhì)的壓力與次數(shù)。

1.3.1有機(jī)相與水相體積比 采用5‰的泊洛沙姆188，高速勻漿速度為5 000 r/min，勻漿時(shí)間3 min，高壓勻質(zhì)壓力為300 bar，勻質(zhì)3次，以泊洛沙姆188作為凍干保護(hù)劑冷凍干燥制備FFC-NC。考察有機(jī)相與水相體積比(1∶1.0,1∶1.5,1∶2.0,1∶2.5,1∶3.0,1∶3.5,1∶4.0,1∶5.0)對(duì)FFC-NC粒徑的影響。

1.3.2泊洛沙姆188的濃度 采用通過(guò)上述考察確定的有機(jī)相與水相的體積比，以高速勻漿速度為5 000 r/min，勻漿時(shí)間3 min，高壓勻質(zhì)壓力為300 bar，勻質(zhì)3次為固定條件，以泊洛沙姆188作為凍干保護(hù)劑冷凍干燥制備FFC-NC?？疾毂砻婊钚詣┎绰迳衬?88的濃度(2‰,3‰,4‰,5‰,6‰)對(duì)FFC-NC粒徑的影響。

1.3.3勻漿速度 采用通過(guò)上述考察確定的有機(jī)相與水相的體積比及泊洛沙姆188的濃度，以高速勻漿時(shí)間3 min，高壓勻質(zhì)壓力為300 bar，勻質(zhì)3次為固定條件，以泊洛沙姆188作為凍干保護(hù)劑冷凍干燥制備FFC-NC?？疾靹驖{速度(1 000,3 000,5 000,7 000,9 000 r/min)對(duì)FFC-NC粒徑的影響。

1.3.4勻漿時(shí)間 采用通過(guò)上述考察確定的有機(jī)相與水相的體積比、泊洛沙姆188的濃度以及勻漿速度，以高壓勻質(zhì)壓力為300 bar，勻質(zhì)3次為固定條件，以泊洛沙姆188作為凍干保護(hù)劑冷凍干燥制備FFC-NC?？疾靹驖{時(shí)間(1,3,5,7,9,11 min)對(duì)FFC-NC粒徑的影響。

1.3.5勻質(zhì)壓力 采用通過(guò)上述考察確定的有機(jī)相與水相的體積比、泊洛沙姆188的濃度以及高速勻漿的速度與時(shí)間，以高壓勻質(zhì)3次為固定條件，以泊洛沙姆188作為凍干保護(hù)劑冷凍干燥制備FFC-NC?？疾靹蛸|(zhì)壓力(100,300,500,700,900,1 100 bar)對(duì)FFC-NC粒徑的影響。

1.3.6勻質(zhì)次數(shù) 采用通過(guò)上述考察確定的有機(jī)相與水相的體積比、泊洛沙姆188的濃度、高速勻漿的速度與時(shí)間以及高壓勻質(zhì)的壓力大小為固定條件，以泊洛沙姆188作為凍干保護(hù)劑冷凍干燥制備FFC-NC?？疾靹蛸|(zhì)次數(shù)(0,1,3,5,7,9 次)對(duì)FFC-NC粒徑的影響。

1.4 粒徑測(cè)定利用馬爾文納米激光粒度儀，對(duì)所制備的FFC-NC的粒徑及多分散系數(shù)(polymer dispersity index,PDI)進(jìn)行測(cè)定。操作步驟如下：將FFC-NC均勻分散于蒸餾水后，用移液器吸取1 mL于特定比色皿中，置于納米激光粒度儀進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

1.5 掃描電子顯微鏡觀察對(duì)FFC原粉和FFC-NC用掃描電子顯微鏡做形貌分析。操作方法如下：用導(dǎo)電膠帶將樣品粘在樣品座上，噴金后，利用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡進(jìn)行觀察。加速電壓為10 kV，圖像放大倍數(shù)為104～6×104倍。

1.6 傅里葉紅外光譜分析對(duì)FFC原粉、FFC-NC、泊洛沙姆188、FFC原粉與泊洛沙姆188的物理混合物(以下簡(jiǎn)稱(chēng)物理混合物)進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)分析。操作方法如下：將樣品干燥后用溴化鉀(光譜級(jí))稀釋至1%，充分混勻研磨后，用壓片機(jī)將其壓成薄片后置于傅里葉紅外光譜儀的樣品盤(pán)上。在室溫環(huán)境下，波長(zhǎng)范圍為400～4 000/cm條件下進(jìn)行紅外掃描分析。

1.7 X-射線(xiàn)衍射檢測(cè)對(duì)FFC原粉、FFC-NC、泊洛沙姆188、FFC原粉與泊洛沙姆188的物理混合物的晶型結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。分別取適量樣品于專(zhuān)用樣品臺(tái)，經(jīng)輕壓抹平后，置于D8 ADVANCE A25型X-射線(xiàn)衍射儀中進(jìn)行檢測(cè)。XRD的檢測(cè)條件如下：衍射角5～60℃，掃描速率為11°/min，掃描步長(zhǎng)為0.02°，掃描模式為2θ，掃描電壓為40 kV，電流為40 mA。

1.8 差示掃描量熱分析對(duì)FFC原粉、FFC-NC、泊洛沙姆188、物理混合物進(jìn)行差示掃描量熱分析。分別精密稱(chēng)取樣品3 mg置于微坩堝中，蓋上微坩堝蓋經(jīng)壓制后，置于儀器檢測(cè)。DSC的檢測(cè)條件如下：升溫范圍20～240℃，升溫速率10℃/min。

1.9 電位測(cè)定利用馬爾文激光粒度儀，對(duì)制備的FFC-NC樣品進(jìn)行電位測(cè)定。分別將FFC和FFC-NC均勻分散于去離子水后，用移液器吸取1 mL置于比色皿中檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1有機(jī)相與水相的體積比 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將有機(jī)相與水相體積比的考察范圍確定為1∶1～1∶5。

由圖1可知，在有機(jī)相與水相比范圍為1∶1～1∶3時(shí)，F(xiàn)FC-NC的平均粒徑在259.3～703.2 nm之間；而當(dāng)有機(jī)相與水相比例超過(guò)1∶3.5時(shí)，F(xiàn)FC-NC的平均粒徑大于1 μm。在制備FFC納米乳時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有機(jī)相與水相比例超過(guò)1∶3.5時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量氣泡，也證實(shí)當(dāng)水量過(guò)多時(shí)，F(xiàn)FC納米乳的形成較差。綜合結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在有機(jī)相與水相的體積比為1∶2時(shí)，制得的FFC-NC粒徑最小，平均粒徑為(259.3±28.1)nm，多分散系數(shù)(PDI)的平均值為0.24±0.04，因此選擇有機(jī)相與水相的體積比為1∶2 來(lái)制備FFC-NC。

圖1 有機(jī)相與水相體積比對(duì)FFC-NC平均粒徑的影響

2.1.2泊洛沙姆188濃度 本試驗(yàn)以泊洛沙姆188作為表面活性劑，其濃度同樣影響著FFC-NC的粒徑大小。通過(guò)大量預(yù)試驗(yàn)確定，泊洛沙姆188的濃度范圍為2‰～6‰，其對(duì)FFC-NC平均粒徑的影響見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，泊洛沙姆188的濃度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，形成的FFC-NC的平均粒徑相對(duì)較大。當(dāng)泊洛沙姆188的濃度范圍在3‰～6‰時(shí)，F(xiàn)FC-NC的平均粒徑在251.9～642.3 nm之間。綜合結(jié)果確定，在泊洛沙姆188濃度為5‰時(shí)，制備的納米晶平均粒徑為(251.9±11.2)nm，PDI的平均值為0.23±0.02。

圖2 泊洛沙姆188的濃度對(duì)FFC-NC平均粒徑的影響

2.1.3勻漿速度與時(shí)間 本試驗(yàn)控制其他因素不變的情況下，考察了勻漿速度為1 000～9 000 r/min對(duì)FFC-NC的平均粒徑大小。由圖3可知，在考察的1 000～9 000 r/min范圍內(nèi)，F(xiàn)FC-NC的平均粒徑為242.6～365.0 nm。綜合結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在勻漿速度7 000 r/min時(shí)，納米晶平均粒徑為(242.6±3.5)nm，PDI的平均值為0.21±0.01。因此，確定FFC-NC制備的最佳勻漿速度為7 000 r/min。

圖3 勻漿速度對(duì)FFC-NC平均粒徑的影響

由圖4可知，在勻漿時(shí)間為1 min時(shí)，平均粒徑為344.2 nm，平均粒徑相對(duì)較大；而在3～11 min范圍內(nèi)，平均粒徑大小在230.3～264.2 nm之間，說(shuō)明在此范圍內(nèi)勻漿時(shí)間對(duì)FFC-NC的平均粒徑大小影響不大，在5 min時(shí)，制得的FFC-NC的平均粒徑最小，為(230.3±8.5)nm，PDI平均值為0.18±0.02。因此，選擇最佳勻漿時(shí)間為5 min。

圖4 勻漿時(shí)間對(duì)FFC-NC平均粒徑的影響

2.1.4勻質(zhì)壓力與次數(shù) 高壓勻質(zhì)可以使制得的FFC納米乳更加均一穩(wěn)定。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定勻質(zhì)壓力的考察范圍為100～1 100 bar。

如圖5所示，當(dāng)壓力為100 bar升至300 bar時(shí)，平均粒徑由365.0降至225.0 nm；而當(dāng)壓力繼續(xù)加大，在300～1 100 bar范圍內(nèi)時(shí)，發(fā)現(xiàn)平均粒徑呈增大趨勢(shì)，這說(shuō)明壓力過(guò)大，納米乳滴遭到破壞。所以，選擇300 bar為最佳勻質(zhì)壓力大小，此時(shí)的平均粒徑大小為(225.0±8.7)nm，PDI平均值為0.24±0.02。

圖5 勻質(zhì)壓力對(duì)FFC-NC平均粒徑的影響

如圖6所示，在勻質(zhì)次數(shù)為1～9次范圍內(nèi)，平均粒徑大小為226.1～322.5 nm，其中在勻質(zhì)次數(shù)為3次時(shí)，平均粒徑最小，為(226.1±11.3)nm，PDI平均值為0.29±0.03。因此，確定3次為制備FFC-NC的最佳勻質(zhì)次數(shù)。

圖6 勻質(zhì)次數(shù)對(duì)FFC-NC平均粒徑的影響

綜上所述，制備FFC-NC的最佳條件：有機(jī)相與水相體積比為1∶2，泊洛沙姆188的濃度為5‰，勻漿速度和時(shí)間分別為7 000 r/min和5 min，勻質(zhì)壓力和次數(shù)分別為300 bar和3次。利用最佳條件制備得到的FFC-NC平均粒徑為(226.1±11.3)nm，PDI平均值為0.29±0.03。

2.2 納米晶粒徑分布將FFC-NC用蒸餾水分散后的粒徑分布圖顯示，采用最佳條件制備的FFC-NC粒徑分布在141.8～243.0 nm范圍內(nèi)，納米晶的粒徑分布范圍窄，且粒徑分布均勻(圖7)。

圖7 FFC-NC粒徑分布圖

2.3 掃描電子顯微鏡觀察FFC原粉與FFC-NC的掃描電鏡圖顯示，F(xiàn)FC原粉呈大小不一的薄片狀，其形態(tài)不規(guī)則。FFC-NC形態(tài)為不規(guī)則球體，粒徑分布均一(圖8)。

A.FFC;B.FFC-NC

2.4 傅里葉紅外光譜分析紅外光譜掃描結(jié)果顯示在3 455 cm-1處為-OH伸縮振動(dòng)吸收峰，3 320 cm-1處為-CONH-伸縮振動(dòng)吸收峰，1 684 cm-1處為C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，1 535 cm-1處為-NH的彎曲振動(dòng)和-CN的伸縮振動(dòng)，1 276 cm-1處是-CN的彎曲振動(dòng)和-NH的伸縮振動(dòng)[14]。P188紅外光譜圖顯示，在 3 460 cm-1處為-OH伸縮振動(dòng)吸收峰，2 883 cm-1處為-CH伸縮振動(dòng)吸收峰，1 108 cm-1處為-C-O-醚吸收峰[15]?？梢钥闯?，物理混合物的紅外光譜圖為FFC和P188紅外光譜的疊加。FFC-NC的紅外光譜圖未出現(xiàn)新的吸收峰，說(shuō)明制備過(guò)程中FFC與P188未發(fā)生化學(xué)作用，F(xiàn)FC的化學(xué)結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變(圖9)。

圖9 傅里葉紅外光譜圖

2.5 X-射線(xiàn)衍射檢測(cè)對(duì)FFC原粉、泊洛沙姆188、物理混合物及FFC-NC進(jìn)行X射線(xiàn)衍射分析，結(jié)果顯示FFC原粉在2θ為8.10°，16.21°，19.69°，20.16°，21.01°，24.40°，26.85°，28.92°，31.75°和41.16°時(shí)具有較強(qiáng)的衍射峰[16-17]，表明FFC原粉具有特定且較強(qiáng)的結(jié)晶度。FFC原粉的XRD圖與物理混合物的一致，表明輔料泊洛沙姆188的添加不會(huì)影響FFC的結(jié)晶形態(tài)。FFC-NC的XRD圖中，F(xiàn)FC的特征衍射峰消失，在2θ為11.96°，17.62°，18.80°處有較弱衍射峰，表明FFC-NC的晶型結(jié)構(gòu)發(fā)生改變(圖10)。

圖10 X-射線(xiàn)衍射結(jié)果

2.6 差示掃描量熱分析對(duì)FFC原粉、泊洛沙姆188、物理混合物及FFC-NC進(jìn)行差式掃描量熱分析，結(jié)果顯示FFC原粉的熔點(diǎn)峰出現(xiàn)在153.7℃，泊洛沙姆188的熔點(diǎn)峰出現(xiàn)在55.6℃。FFC和泊洛沙姆188的熔點(diǎn)峰在物理混合物中均存在。FFC-NC的DSC圖中不存在FFC和泊洛沙姆188的熔點(diǎn)峰，在115.1℃附近和151.3℃附近有極微弱的峰，此結(jié)果進(jìn)一步證明FFC-NC的晶型結(jié)構(gòu)發(fā)生改變(圖11)。

圖11 差示掃描量熱分析結(jié)果

2.7 電位測(cè)定結(jié)果經(jīng)測(cè)定，F(xiàn)FC納米混懸液的電位為-(23.18±0.35)mV，而FFC混懸液的電位為-(9.67±0.47)mV，說(shuō)明FFC納米混懸液的穩(wěn)定性更好，一般來(lái)說(shuō)，電位在-20 mV左右，混懸劑能保持長(zhǎng)期穩(wěn)定。

3 討論

將藥物制成納米晶體，不僅能大大改善藥物的溶解性能，相較于納米粒、脂質(zhì)體，納米晶還具有更高的載藥量，其作為一種中間體，可加工成片劑、膠囊、注射劑等劑型[18-19]。采用乳化溶劑揮發(fā)法制備納米晶時(shí)，制備納米乳的有機(jī)相需要具有良好的揮發(fā)性。本試驗(yàn)依據(jù)已有配方[20]進(jìn)行改良，保留了具有良好揮發(fā)性的乙酸乙酯作為有機(jī)相，此外，在藥物設(shè)計(jì)和制備過(guò)程中，通過(guò)添加合理安全的藥用輔料[21-22]和制備合適的劑型[23]，可以提高藥物的性能。本試驗(yàn)選擇泊洛沙姆188作為表面活性劑，是由于該非離子型表面活性劑的無(wú)毒無(wú)刺激性質(zhì)[24]，助表面活性劑采用無(wú)水乙醇，其能有效幫助乳化，降低界面表面張力，使納米乳更加穩(wěn)定[25]。

方宇奇等[26]采用微型化介質(zhì)研磨法制備得到了飽和溶解度和體外累積溶出度均明顯高于FFC原粉的納米晶，此外該團(tuán)隊(duì)[27]還考察了反溶劑沉淀法用于制備FFC-NC的效果。乳化溶劑揮發(fā)法也可用于制備納米晶，但由于采用此法的難題在于納米乳配方的篩選，目前還沒(méi)有研究者用此法制備FFC-NC。本試驗(yàn)采用乳化溶劑揮發(fā)法經(jīng)過(guò)優(yōu)化制備的FFC-NC粒徑為(226.1±11.3)nm，符合藥物納米晶的要求[28]，且PDI平均值為0.29±0.03，粒徑分布范圍窄。

本試驗(yàn)選用的對(duì)FFC-NC進(jìn)行物理表征的方法包括對(duì)樣品表面形貌及成分進(jìn)行觀察的掃描電鏡法[29]、對(duì)樣品化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的紅外光譜法、對(duì)樣品晶型結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的X-射線(xiàn)衍射法及對(duì)樣品熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析的差示掃描量熱法。本試驗(yàn)FFC原粉的鑒定結(jié)果與已有研究結(jié)果一致[14,17,24]，這表明所建立的方法具有可靠性。

將FFC制成納米晶，可以在增強(qiáng)其抗菌作用和生物相容性的同時(shí)，減少用藥量，從而降低藥物殘留和環(huán)境污染，解決藥物濫用、產(chǎn)生耐藥性等問(wèn)題，提升食源性動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量，保障人與畜牧業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展。該研究將為FFC的增溶作用研究提供新思路，豐富FFC的使用劑型，為獸醫(yī)臨床使用FFC提供新方法。