金 鑫，王 靜，孫 宇，李世杰，馬興紅

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省動(dòng)物細(xì)胞與遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

研究發(fā)現(xiàn)胚泡在進(jìn)入子宮內(nèi)膜腔之后幾乎立即就與子宮內(nèi)膜發(fā)生對(duì)話[1]，發(fā)育中的胚胎黏附在子宮內(nèi)膜的表面，胚胎分泌一系列能與腔上皮和腺上皮上受體特異性結(jié)合的配體，胚胎與母體的子宮內(nèi)膜表面發(fā)生細(xì)胞之間的相互作用，并且持續(xù)進(jìn)行著復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[2]。蛻膜化的進(jìn)行需要轉(zhuǎn)錄、形態(tài)、細(xì)胞等許多因子和信號(hào)通路之間的相互作用。包括激素受體、其他核受體和一些調(diào)節(jié)因子[3]。雌激素和孕酮(P4)是胚胎著床與發(fā)育和正常妊娠所必需的重要調(diào)節(jié)因子[4]，并且以時(shí)間和空間方式協(xié)同調(diào)控各類子宮細(xì)胞的增殖與分化，以確保子宮處于植入的“窗口期”[5]。這些激素通過與特異性的激素受體結(jié)合來發(fā)揮作用，一旦受體與相應(yīng)激素結(jié)合，即可與應(yīng)答基因啟動(dòng)子區(qū)特定的順式作用序列相結(jié)合，從而調(diào)控這些基因[6]。

有研究表明小鼠胚胎在12.5 d死亡發(fā)生在泛素樣PHD和含環(huán)指結(jié)構(gòu)域的蛋白1(UHRF1)基因敲除型鼠上[7]，與正常胚胎相比較該基因敲除的小鼠胚胎發(fā)育緩慢,出現(xiàn)各種生理性缺陷[8]，檢測發(fā)現(xiàn)，凋亡事件明顯增多于骨節(jié)、神經(jīng)管腹側(cè)以及頭部中胚層等部位?？茖W(xué)家在尋找細(xì)胞周期蛋白的時(shí)候發(fā)現(xiàn)UHRF1在S期高表達(dá)[8]。下調(diào)該基因能夠?qū)е录?xì)胞增殖變慢并處于G1期[9]，容易進(jìn)入S期的細(xì)胞該基因往往高表達(dá)，大多數(shù)細(xì)胞處于S和G2/期[10]。與生長緩慢的組織相比較，增殖快的組織該基因表達(dá)多[11]。關(guān)于UHRF1在癌癥等方面的作用研究較為廣泛，但其參與哺乳動(dòng)物早期妊娠過程的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以小鼠為材料，探究UHRF1在小鼠早期妊娠模型、人工誘導(dǎo)蛻膜化模型、類固醇激素處理模型及體外誘導(dǎo)HESC蛻膜化模型中mRNA和蛋白的表達(dá)情況及其規(guī)律,為深入了解UHRF1及其上、下游信號(hào)通路和其在生殖工程中的作用提供線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)所用到的ICR小鼠，均已達(dá)性成熟，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。動(dòng)物于人為調(diào)控的條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，室溫為22℃左右，光照的時(shí)間控制在12 h光照和12 h黑暗，自由攝食及飲水并每周更換1次墊料。

1.2 主要試劑及配制UHRF1抗體購自愛必信(上海)生物科技有限公司；GAPDH抗體購自CST公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購自Abclonal公司。雜交液：用1 mL移液器調(diào)至500 μL加入去離子甲酰胺500 μL，DEPC處理的20×SSC 250 μL，4%BSA 5 μL，DEPC水240 μL，0.1 g硫酸葡聚糖，待其溶解后加入tRNA(50 g/L)5 μL，保存于-80℃中待用[12-14]。

1.3 早期妊娠模型每晚16:00左右將健康且已達(dá)性成熟的雌性小鼠與成年可育的雄性小鼠按照1∶1的比例置于同一個(gè)籠子中，使其交配，于第2日早9:00之前檢查是否存在陰道栓并且對(duì)其做陰道涂片。若于陰道內(nèi)發(fā)現(xiàn)精子的存在則將該天記為此鼠妊娠第1天。按照天數(shù)(妊娠第1～8天)于早上9:00之前完成取材。

1.4 類固醇激素處理模型選擇健康且已性成熟的雌性小鼠，雙側(cè)卵巢切除，休養(yǎng)并恢復(fù)3周以上，隨機(jī)分配成4組，每組分別注射雌二醇(E2)、(100 μg/0.1 L)、P4(1 g/0.1 L)、E2+P4、芝麻油，注射 24 h 之后進(jìn)行取材，每組至少取3只以保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

1.5 人工誘導(dǎo)蛻膜化模型制備健康且性成熟的3只結(jié)扎鼠，取已恢復(fù)的雄鼠1份再取3份自然發(fā)情的雌鼠于當(dāng)日下午4點(diǎn)合籠，次日清晨檢栓,發(fā)現(xiàn)陰道栓時(shí)則為假孕第1天。取假孕第4天時(shí)的小鼠為試驗(yàn)材料，芝麻油注入一側(cè)子宮角另一側(cè)不注，在假孕第8天取材。

1.6 體外誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(HESC)蛻膜化模型提前配制好誘導(dǎo)所需要的激素濃儲(chǔ)液，當(dāng)HESC細(xì)胞密度約80%時(shí)，換液接種,6孔板內(nèi)，待細(xì)胞密度與生長狀態(tài)適宜時(shí)開始誘導(dǎo)。誘導(dǎo)培養(yǎng)體系以1 000 mL細(xì)胞培養(yǎng)液為例，分別加入DMEM/F12 15.56 g、Sadium Bicarbonate 1.2 g、CS-FBS 20 mL、Penicillin-Streptomycin 5 mg、cAMP 0.5 mmol/L、MPA 1 μmol/L、E210 nmol/L。

1.7 原位雜交用設(shè)計(jì)好的探針引物序列(表1)，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增后,將產(chǎn)物與T載體連接轉(zhuǎn)化挑取單菌落測序后，將測序正確的質(zhì)粒大量提取,用T7/SP6與目的基因上、下游引物擴(kuò)增目的片段，用Roche公司探針標(biāo)記試劑盒進(jìn)行探針標(biāo)記，55℃雜交過夜后用堿性磷酸酶標(biāo)記的地高辛抗體4℃避光過夜孵育。滴加含有左旋咪唑的NBT/BCIP顯色液，4℃過夜顯色并實(shí)時(shí)觀察,甲基綠復(fù)染拍照。

表1 引物序列

1.8 免疫組織化學(xué)將石蠟組織切成7 μm薄厚，37℃過夜烘片1 h，二甲苯脫蠟，而后用乙醇溶液進(jìn)行梯度脫水，用3%的過氧化氫封閉掉內(nèi)源性的過氧化物酶以保證陽性信號(hào)的準(zhǔn)確性，血清封閉以后加入所需的一抗(UHRF1抗體，愛必信生物科技有限公司)放入4℃冰箱過夜，用緩沖液浸泡過后加入二抗并進(jìn)行避光孵育,顯色以后使用蘇木精染色液染色，乙醇梯度復(fù)水及二甲苯透明，封片、晾干封片劑以后進(jìn)行照相。

1.9 蛋白質(zhì)免疫印跡測定濃度按照所需各個(gè)蛋白樣品的體積點(diǎn)樣進(jìn)行電泳，待樣品距離膠底部較近時(shí)，立即停止電泳，轉(zhuǎn)膜60 min，配置5%脫脂牛奶用于封閉，把恒溫培養(yǎng)箱調(diào)節(jié)溫度至37℃條件下孵育1 h，加一抗4℃過夜；PBST洗膜，封閉液稀釋二抗，覆于膜上，37℃振蕩1 h；PBST洗膜，使用增強(qiáng)型ECL發(fā)光液，于掃描儀器中曝光，拍攝蛋白條帶，Image J軟件掃描條帶，計(jì)算灰度值。

1.10 熒光定量PCR使用Real-time PCR試劑盒，以cDNA作為反應(yīng)模板，用Amplied Biosystems?7500 Real-time PCR System(Amplied Biosystems)儀器。

2 結(jié)果

2.1 小鼠早期妊娠模型中UHRF1 mRNA的表達(dá)通過原位雜交的結(jié)果可得到，UHRF1 mRNA在第1～4天的子宮中并沒有非常明顯的表達(dá)。伴隨著胚胎進(jìn)行著床，蛻膜化的發(fā)生UHRF1 開始表達(dá)。在妊娠第5天的腺上皮上可以看到UHRF1的表達(dá)；并且在之后的幾天里,該基因表達(dá)較為明顯且主要集中在蛻膜區(qū)域，原位雜交與Real-time PCR顯示的UHRF1 mRNA的表達(dá)情況基本一致(圖1)。

D1～D8.小鼠妊娠早期1～8 d子宮；**** P<0.000 1。下同

2.2 小鼠早期妊娠模型中UHRF1蛋白的表達(dá)免疫組化結(jié)果表明，UHRF1蛋白在妊娠第1～4天的子宮中并無明顯表達(dá)。從第5天開始可以看到UHRF1蛋白在上皮微弱的表達(dá)，隨著蛻膜組織的逐漸形成，在第6～8天可以明顯地觀測到其表達(dá)，且表達(dá)量隨著妊娠的進(jìn)行逐漸升高，其主要在蛻膜組織中表達(dá)。通過Western blot結(jié)果表明，在妊娠的第1～4天，有少量的UHRF1蛋白表達(dá)。從妊娠的第5天開始，隨著蛻膜化的發(fā)生UHRF1蛋白表達(dá)量逐漸升高，并且表達(dá)量變化比較顯著(圖2)。

D1～D8.小鼠妊娠早期1～8 d子宮

2.3 小鼠類固醇激素處理模型子宮中 UHRF1 mRNA的表達(dá)Real-time PCR結(jié)果表明，UHRF1 mRNA在雌激素處理組中表達(dá)量增高，但在對(duì)照組中和各類激素處理組中并無明顯表達(dá)。原位雜交的結(jié)果可以很明顯觀測到，雌激素組中UHRF1 mRNA在腔上皮有所表達(dá)，這與Real-time PCR提示的結(jié)果基本一致(圖3)。

圖3 小鼠類固醇激素處理子宮中UHRF1 mRNA的表達(dá)情況

2.4 小鼠類固醇激素處理模型子宮中UHRF1蛋白的表達(dá)通過原位雜交和Real-time PCR可知，雌激素可能調(diào)控該基因的表達(dá)。而UHRF1 蛋白的表達(dá)同樣通過激素處理模型進(jìn)行研究，免疫組化的結(jié)果表明，UHRF1 蛋白在經(jīng)雌激素處理的子宮中有明顯表達(dá)增加的趨勢。Western blot的結(jié)果可以觀察到，β-雌二醇處理組中UHRF1蛋白表達(dá)量增高，其他處理組中沒有觀察到UHRF1蛋白顯著性表達(dá)(圖4)。

圖4 小鼠類固醇激素處理子宮中UHRF1蛋白的表達(dá)情況

2.5 小鼠人工誘導(dǎo)蛻膜化模型子宮中UHRF1 mRNA的表達(dá)情況結(jié)果表明，UHRF1 mRNA在蛻膜組中的表達(dá)量相對(duì)較高,且與對(duì)照組相比較，差異極顯著(圖5)。

圖5 小鼠人工誘導(dǎo)蛻膜化模型子宮中UHRF1 mRNA的表達(dá)情況

2.6 小鼠人工誘導(dǎo)蛻膜化模型子宮中UHRF1蛋白的表達(dá)情況免疫組化結(jié)果得知，UHRF1 蛋白在蛻膜組織中廣泛表達(dá)，而在對(duì)照組中沒有明顯表達(dá)。Western blot結(jié)果表明，UHRF1 蛋白在發(fā)生蛻膜化試驗(yàn)組子宮中的表達(dá)非常顯著，而在未發(fā)生蛻膜化的對(duì)照組中無明顯表達(dá)，與免疫組化的結(jié)果完全一致，與UHRF1 mRNA在人工誘蛻膜化模型中表達(dá)情況類似(圖6)。

注：對(duì)照.非蛻膜測驗(yàn)

2.7 體外誘導(dǎo)HESC蛻膜化中UHRF1 mRNA的表達(dá)用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)驗(yàn)證過誘導(dǎo)成功的HESC蛻膜化細(xì)胞mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，檢測發(fā)現(xiàn)UHRF1 mRNA在妊娠1，2,3,4,6 d蛻膜組織表達(dá)量相對(duì)較高，且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加有逐漸升高的趨勢(圖7)。

圖7 體外誘導(dǎo)HESC蛻膜化中UHRF1 mRNA的表達(dá)情況

3 討論

UHRF1參與眾多體內(nèi)生理過程，例如對(duì)淋巴細(xì)胞發(fā)育的調(diào)節(jié)、DNA甲基化的維持、對(duì)于細(xì)胞生長的調(diào)控、基因組穩(wěn)定性的維持、以及腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)等[15]。有研究表明小鼠中敲除該基因后能夠?qū)е滦∈笈咛サ乃劳鯷7]。

胚胎著床后子宮基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生著一系列的增殖與分化，UHRF1可以與甲基化狀態(tài)的Rb啟動(dòng)子結(jié)合，從而抑制其表達(dá)，這促進(jìn)了細(xì)胞向細(xì)胞周期中的S期轉(zhuǎn)化，結(jié)合本試驗(yàn)原位雜交和免疫組化中UHRF1表達(dá)的位置以及定量PCR和Western blot結(jié)果可知，在胚胎發(fā)生著床以后，UHRF1的mRNA和蛋白逐漸在蛻膜細(xì)胞當(dāng)中高表達(dá)，說明胚胎著床后UHRF1蛋白的高表達(dá)在一定程度上促進(jìn)了子宮基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換，進(jìn)而影響細(xì)胞的生理狀態(tài)。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在早期妊娠的第5天，胚胎發(fā)生著床，UHRF1 mRNA表達(dá)量開始上升，其首出現(xiàn)在早期妊娠第5天的子宮腺上皮當(dāng)中，而后其表達(dá)量隨著著床時(shí)間的增加而增加，以上所述說明UHRF1確實(shí)與胚胎著床過程密切相關(guān)。

胚胎成功著床，既要有進(jìn)入接受狀態(tài)的子宮，又要有獲得著床能力的胚胎，這兩個(gè)看似獨(dú)立而又緊密聯(lián)系的事件需要多個(gè)信號(hào)通路同步進(jìn)行，并在協(xié)調(diào)過程中涉及激素調(diào)控，其中雌激素和P4是胚胎著床發(fā)育和正常妊娠所必需的重要調(diào)節(jié)因子[16]。絕大多數(shù)參與調(diào)控生殖過程的基因都受到卵巢雌激素和P4的影響，例如Lif，Ihh等。在成年小鼠中，腔上皮和腺上皮的增殖受到雌激素的調(diào)節(jié)，雌激素與P4共同作用刺激基質(zhì)細(xì)胞的增殖,雌激素主要通過核受體發(fā)揮作用[17-18]。在本試驗(yàn)的激素處理模型中，人為給卵巢切除小鼠注射雌激素后UHRF1的mRNA和蛋白的表達(dá)都有所上調(diào)，P4處理組和雌激素加P4共同處理組以及只注射芝麻油的對(duì)照組中并沒有發(fā)現(xiàn)UHRF1表達(dá)明顯性上調(diào)，而雌激素處理組中UHRF1的這種上調(diào)可能和上皮細(xì)胞在雌激素刺激下進(jìn)行增殖有關(guān)聯(lián)。

胚胎發(fā)生著床之后，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)增殖與分化轉(zhuǎn)變?yōu)橥懩ぜ?xì)胞，為早期妊娠發(fā)生及胎盤的形成提供了大量的營養(yǎng)物質(zhì)，并且提供免疫環(huán)境，使胚胎免受免疫反應(yīng)。蛻膜化現(xiàn)象的出現(xiàn)對(duì)于后期的妊娠以及維持這其中涉及到許多生物學(xué)事件，包括生長的子宮基質(zhì)細(xì)胞、再分化的基質(zhì)成纖維細(xì)胞、以及重新建立細(xì)胞外基質(zhì)等至關(guān)重要，在此過程中涉及很多細(xì)胞因子的參與，例如bmp2[19]、cAMP[20]等。蛻膜化是子宮基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)功能發(fā)生變化的一個(gè)過程，子宮蛻膜化對(duì)于母體妊娠的建立和維持是很重要的。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，UHRF1的mRNA與蛋白在早期妊娠第6天以后的蛻膜細(xì)胞里高表達(dá)，在人工誘導(dǎo)蛻膜化模型中UHRF1的mRNA和蛋白表達(dá)量也相對(duì)較高，在人工誘導(dǎo)HESC細(xì)胞當(dāng)中也出現(xiàn)類似現(xiàn)象，而在早期妊娠前幾天并沒有發(fā)現(xiàn)明顯表達(dá)，這可能說明UHRF1參與子宮基質(zhì)細(xì)胞向蛻膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，推測其與蛻膜化轉(zhuǎn)變具有相關(guān)性。綜上所述，UHRF1參與胚胎著床的調(diào)控，UHRF1表達(dá)受類固醇激素的調(diào)控，UHRF1與蛻膜化過程密切相關(guān)。