徐冠藝，李雪嵩，薛智洋，尹嘯嘯，宗小梅，張海朋，賀承光，孔令聰*,馬紅霞，2，3

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 吉林省新獸藥研發(fā)與創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118)

近年來，新型抗感染藥物的開發(fā)已陷入瓶頸，而多重耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，促使對(duì)耐藥機(jī)制展開研究，發(fā)現(xiàn)潛在耐藥抑制劑靶點(diǎn)，篩選新型耐藥抑制劑來延緩耐藥性的產(chǎn)生速率[1-2]。病原菌對(duì)抗生素的耐藥形成主要通過引起如活性氧的異常代謝、基因的水平轉(zhuǎn)移、生物被膜的形成等方式，而這些生物過程均有SOS反應(yīng)通路基因參與調(diào)控引發(fā)RecA/LexA介導(dǎo)的SOS反應(yīng)[3]。因此，參與SOS反應(yīng)調(diào)控的相關(guān)蛋白已被視為阻止抗生素耐藥性進(jìn)化的有效靶點(diǎn)。

氟喹諾酮類等殺菌藥物是SOS表達(dá)的有效誘導(dǎo)劑[4-5]，SOS反應(yīng)是通過修復(fù)由抗菌藥物直接引起的DNA損傷，或由代謝產(chǎn)物和氧化應(yīng)激反應(yīng)間接引起的DNA損傷來對(duì)抗抗生素壓力[6]。同時(shí)，由于SOS反應(yīng)的啟動(dòng)，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐受性，降低抗菌藥物的治療效果。為此，對(duì)SOS反應(yīng)在細(xì)菌耐藥性和耐受性中的核心作用及其在不同致病菌中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為SOS反應(yīng)耐藥抑制劑靶點(diǎn)的篩選奠定基礎(chǔ)。

1 SOS反應(yīng)對(duì)細(xì)菌耐藥形成的影響

近年來相關(guān)研究表明，抗生素治療可使細(xì)菌產(chǎn)生適應(yīng)性突變[7]，適應(yīng)性機(jī)制和耐藥基因元件的獲得是激活SOS反應(yīng)系統(tǒng)的一部分，其涉及DNA損傷修復(fù)、水平基因轉(zhuǎn)移(HGT)機(jī)制、抗生素耐藥誘導(dǎo)等。

1.1 SOS在DNA損傷修復(fù)中的作用SOS的誘導(dǎo)是由細(xì)胞內(nèi)ssDNA水平升高觸發(fā)的，因?yàn)镈NA聚合酶在受損的核苷酸上停滯不前，但解旋酶仍存在解離DNA的活性。在DNA復(fù)制過程中，滯后鏈和前導(dǎo)鏈上的模板損傷也會(huì)產(chǎn)生ssDNA。ssDNA是在水平基因轉(zhuǎn)移過程中瞬時(shí)產(chǎn)生的[8-9]。殺菌抗菌藥物是SOS反應(yīng)的有效誘導(dǎo)劑，幾種臨床上重要的抗生素，如磺胺類、氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類，均可通過誘導(dǎo)產(chǎn)生致死水平的氧化自由基而產(chǎn)生殺菌作用。其超氧陰離子自由基或羥自由基的產(chǎn)生可導(dǎo)致DNA損傷，從而激活SOS反應(yīng)[10]。SOS反應(yīng)對(duì)受損DNA的細(xì)胞修復(fù)沒有特殊的誘導(dǎo)作用，但可能具有廣泛的生理作用，已有研究報(bào)道SOS反應(yīng)可在不同菌株的應(yīng)激條件或致病過程中激活[11]，但除了DNA損傷之外，還有哪些因素可誘導(dǎo)SOS反應(yīng)，以及SOS誘導(dǎo)是如何在生物體中進(jìn)行的，還需進(jìn)一步的研究。

1.2 SOS在抗生素耐藥誘導(dǎo)中的直接作用一些SOS誘導(dǎo)蛋白的過表達(dá)與許多抗生素的敏感性降低有關(guān)。CRIZ等[12]研究表明，亞抑菌濃度的氟喹諾酮類藥物能激活霍亂弧菌SOS反應(yīng)，從而導(dǎo)致該菌對(duì)其他不相關(guān)藥物產(chǎn)生耐藥性。BAHAROGLU等[13]研究證明，在一個(gè)抑制LexA活性的大腸桿菌突變體中抑制SOS啟動(dòng)，可抑制作用于DNA類抗生素耐藥性的出現(xiàn)。此外，DNA損傷可由幾種抗生素直接造成，也可由次級(jí)代謝產(chǎn)物間接造成。據(jù)報(bào)道，在亞抑菌濃度氟喹諾酮類藥物、β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類藥物作用下，可誘導(dǎo)不同細(xì)菌的SOS反應(yīng)[14]。當(dāng)病原菌暴露于氟喹諾酮類藥物后，SOS反應(yīng)的激活增加了106倍的突變頻率，促進(jìn)了gyrA基因突變，賦予了對(duì)這類抗菌藥物的耐藥性[15]。

1.3 SOS在耐藥基因水平轉(zhuǎn)移中的作用環(huán)境中耐藥性質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移往往發(fā)生在抗菌藥物壓力作用下[15]。其中，遠(yuǎn)低于治療水平的抗生素濃度可作為信號(hào)分子和調(diào)節(jié)物質(zhì)，誘導(dǎo)結(jié)合轉(zhuǎn)移、誘變和SOS反應(yīng)，引起特定的轉(zhuǎn)錄變化，并為耐藥菌株提供選擇性優(yōu)勢(shì)。HGT參與的外源DNA攝取觸發(fā)ssDNA的形成，并通過ssDNA的積累誘導(dǎo)SOS反應(yīng)[8]。在一些接合質(zhì)粒中也已證明SOS抑制劑的存在，如R64drd和R100-1質(zhì)粒攜帶編碼SOS誘導(dǎo)抑制劑的psiB基因。PsiB是從PsiB高產(chǎn)細(xì)胞的粗提物中提純而來的，它是一種抗SOS反應(yīng)蛋白，PsiB蛋白在傳遞給大腸桿菌K-12受體的過程中被野生型的F性因子瞬時(shí)表達(dá)以保護(hù)接合后轉(zhuǎn)移的F單鏈DNA。當(dāng)PsiB蛋白過表達(dá)時(shí)，可干擾不連續(xù)DNA復(fù)制產(chǎn)生的染色體ssDNA位點(diǎn)上的RecA蛋白，從而引起SOS抑制表型[16-18]。

2 SOS反應(yīng)對(duì)不同病原菌耐藥形成的調(diào)控

2.1 大腸桿菌近年來，有關(guān)大腸桿菌Ⅰ類毒素-抗毒素tisB/IstR模塊激活是涉及SOS系統(tǒng)的主要研究熱點(diǎn)。tisAB/istR(一種特殊的SOS-TA位點(diǎn))的敲除顯著降低了持留菌對(duì)DNA損傷劑的耐受性。當(dāng)其循序漸進(jìn)地暴露于環(huán)丙沙星壓力中，會(huì)以一種tisAB依賴的機(jī)制引起持留，SOS響應(yīng)誘導(dǎo)的持留與TisB在大腸桿菌中的過表達(dá)有關(guān)。同時(shí)，許多細(xì)菌基因組含有的TA系統(tǒng)(CcdA、CcdB)，作為一種典型的毒素-抗毒素系統(tǒng)，CcdA能被一種名為L(zhǎng)on蛋白酶的酶迅速降解，有助于維持毒素和抗毒素的穩(wěn)定水平，從而使毒素/抗毒素比率小于1，SOS反應(yīng)可以由增加Lon蛋白酶活性或降低CcdA產(chǎn)量的刺激觸發(fā)。此外，MILLER等[19]報(bào)道，β-內(nèi)酰胺類抗生素通過DpiBA雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在大腸桿菌中誘導(dǎo)SOS反應(yīng)啟動(dòng)，使其能夠在自身暴露于高濃度抗生素下維持生存狀態(tài)。相關(guān)研究顯示，暴露于某些β-內(nèi)酰胺類藥物會(huì)降低青霉素結(jié)合蛋白-3(PBP-3,ftsI編碼)的活性，影響細(xì)胞壁的完整性，受損的PBP-3激活雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)DpiA/DpiB。DpiA與復(fù)制起點(diǎn)的相互作用與復(fù)制蛋白DnaA和DnaB的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng),當(dāng)過度表達(dá)時(shí)，DpiA可以中斷DNA復(fù)制并誘導(dǎo)SOS反應(yīng)[20]，從而抑制細(xì)胞分裂。

2.2 金黃色葡萄球菌在金黃色葡萄球菌中，只發(fā)現(xiàn)了16個(gè)LexA調(diào)控基因，包括容易出錯(cuò)的聚合酶UmuC[21]。相關(guān)研究顯示，SOS反應(yīng)在金黃色葡萄球菌抗菌藥物耐藥性的產(chǎn)生以及毒力島SaPI上編碼的毒力因子的表達(dá)和傳播中起關(guān)鍵作用。在金黃色葡萄球菌中，抗生素誘導(dǎo)的SOS反應(yīng)增加了小菌落變異(SCVs)的形成。帶有AddAB復(fù)合體(在金黃色葡萄球菌中稱為RexAB)、RecA和PolV的誘變DNA修復(fù)途徑，通過增強(qiáng)過氧化氫酶的產(chǎn)生，激發(fā)了SCVs的亞群體對(duì)H2O2的抗性[22]。同時(shí)，SCVs是細(xì)菌對(duì)抗生素高度耐受的形式，SCVs可在高抗生素壓力下存活，并導(dǎo)致慢性和反復(fù)感染。SCVs有幾個(gè)表型特征可能會(huì)導(dǎo)致感染期間的持留，如細(xì)胞內(nèi)存活、生物膜發(fā)育以及對(duì)抗生素的高度耐受性[23]。據(jù)報(bào)道，低濃度的過氧化氫通過誘導(dǎo)SOS反應(yīng)誘導(dǎo)慶大霉素耐藥SCVs的出現(xiàn)[23]。因此，SOS抑制劑也有可能被用作減少SCVs的形成，基于此可能開發(fā)一種新的治療策略。

2.3 結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染MTB的宿主，會(huì)使用一系列的壓力來抑制MTB增殖，然而MTB可在宿主體內(nèi)持續(xù)存在數(shù)十年，這表明其可能擁有有效的分子機(jī)制來抵抗宿主造成的損傷。在分枝桿菌中，有兩種機(jī)制控制DNA損傷修復(fù)，一種是相對(duì)較小的LexA調(diào)節(jié)機(jī)制；另一種是由ClpR因子控制的較大的LexA獨(dú)立機(jī)制[24]。相關(guān)研究顯示，由dnaE2編碼的DNA聚合酶Ⅲ中容易出錯(cuò)的α亞基對(duì)于感染期間的持留性和抗生素耐藥性的產(chǎn)生是必需的，與含有容易出錯(cuò)的聚合酶的大腸桿菌不同，MTB攜帶一個(gè)分離盒imuA’-imuB/dnaE2。ImuA’和ImuB是Y家族DNA聚合酶，與C家族DNA聚合酶DnaE2一起對(duì)誘變和損傷耐受性至關(guān)重要[25]。ImuB與ImuA’和C家族DNA聚合酶DnaE2以及β-鉗相互作用。細(xì)菌基因組由DNA聚合酶Ⅲ DNA聚合酶亞基(PolⅢ DNA)復(fù)制，屬于α聚合酶C家族。Pol Ⅲα的兩種主要形式被認(rèn)為是Polc和DnaE(3個(gè)組：DnaE1、DnaE2、DnaE3)，推測(cè)是通過復(fù)制進(jìn)化而來的[26]。而DnaE2是SOS誘變盒的一部分，存在于許多細(xì)菌基因組中，包括MTB，同時(shí)DnaE3的出錯(cuò)，也容易導(dǎo)致SOS反應(yīng)的產(chǎn)生[27]。

3 SOS抑制劑

上述研究發(fā)現(xiàn)，SOS在不同致病菌耐藥形成中發(fā)揮重要作用，為此研發(fā)SOS反應(yīng)抑制劑受到了國內(nèi)外科研工作者的高度關(guān)注。目前，已有多種SOS通路相關(guān)的基因作為抗菌藥物抑制劑靶標(biāo)被表征，如表1所示。理論上，SOS通路可以通過RecA的失活或抑制LexA的自切割活性來發(fā)揮作用[28]。ALAM等[29]已經(jīng)鑒定和表征了酞菁四磺酸作為RecA抑制劑，它可以阻斷抗生素誘導(dǎo)的SOS反應(yīng)的激活。這些抑制劑增強(qiáng)了殺菌劑如氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類對(duì)革蘭陰性和革蘭陽性細(xì)菌的殺菌活性，并降低了細(xì)菌獲得抗生素耐藥性突變的能力。LAN等[30]研究發(fā)現(xiàn)酚類化合物對(duì)香豆酸可以抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌中RecA與ssDNA結(jié)合、鏈交換、ATP水解的能力。雙香豆酸這種抑制作用的機(jī)制涉及其干擾RecA蛋白與DNA結(jié)合的能力，還阻斷了環(huán)丙沙星誘導(dǎo)的RecA表達(dá)，從而抑制了該菌株的SOS響應(yīng)，減緩細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)?？梢?，基于RecA的耐藥抑制劑具有良好的與抗菌藥物協(xié)同作用。但是相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，LexA因沒有真核同源物，宿主DNA修復(fù)系統(tǒng)中使用與RecA不同的RAD51家族同源物[31]，CIRZ等[12]研究發(fā)現(xiàn)，通過突變LexA的裂解活性來阻止SOS反應(yīng)的啟動(dòng)，使得致病性大腸桿菌不能在體內(nèi)對(duì)氟喹諾酮類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。因此LexA也可能是SOS抑制劑的理想的靶點(diǎn)，但還需要進(jìn)一步展開研究。

表1 參與SOS反應(yīng)的蛋白質(zhì)抑制劑

4 總結(jié)與展望

總之，隨著近年來對(duì)耐藥機(jī)制的深入研究，SOS反應(yīng)與耐藥形成之間的關(guān)系受到了極大的關(guān)注。細(xì)菌SOS反應(yīng)通過誘導(dǎo)病原菌水平基因轉(zhuǎn)移、促進(jìn)生物被膜形成、引起SCVs的形成等手段密切參與致病菌耐藥性形成的過程中。SOS反應(yīng)相關(guān)基因可用作抗菌藥物耐藥抑制劑的靶標(biāo)。國內(nèi)外科研工作者也以基于SOS反應(yīng)相關(guān)重要靶點(diǎn)開展了耐藥抑制劑的研究，這些耐藥抑制劑可以增強(qiáng)抗菌藥物的抑菌活性并延緩其耐藥性形成的時(shí)間。但如何確定耐藥抑制劑的作用位點(diǎn)、SOS抑制劑是通過何種途徑與抗生素聯(lián)合作用于病原菌中仍有待研究。在未來，解決抗生素耐藥性的問題可能需要多種藥物的結(jié)合，包括毒力抑制劑和耐藥性抑制劑。而所有SOS誘導(dǎo)蛋白的意義、它們的生理作用、SOS的環(huán)境和細(xì)胞誘導(dǎo)物、對(duì)其他細(xì)菌細(xì)胞的影響、全局調(diào)控機(jī)制以及SOS激活等都需要在未來的研究中進(jìn)行深入研究。