郭燕菲,石璐璐,烏力雅素,郭文亮,杜海東,金 曉,徐元慶,史彬林

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

抗生素是過去幾年提高畜禽生產(chǎn)效益的常見添加劑，但因其累積效應會造成畜禽自身免疫力下降和病毒耐藥性增強，近年來抗生素已被明令禁止使用，因此尋找綠色、安全，能夠改善畜禽機體健康狀態(tài)的飼料添加劑已成為研究的重點。中草藥植物因其分布廣泛、資源豐富且含有多種有效活性成分成為替代抗生素的最佳選擇。已有研究表明，中草藥飼料添加劑在促進畜禽生長發(fā)育、提高其生產(chǎn)性能方面有著積極作用[1]。目前，國內(nèi)外常用的植物活性物質(zhì)提取方法有水提法以及醇提法，以此可得到較高含量的黃酮、多糖以及酚類化合物，已有研究表明，這些活性物質(zhì)可以提高動物增重水平，促進動物生長，增強炎性因子的釋放，提高免疫器官指數(shù)，是改善畜禽健康的天然高效免疫調(diào)節(jié)劑[2-4]。

黑沙蒿(Artemisia)俗稱沙蒿，為菊科蒿屬植物，其分布極為廣泛，是我國北方地區(qū)主要的灌木之一。黑沙蒿味辛苦，性微溫，全草均可入藥，其莖葉可用于抗炎和消腫，根可用于止血，而且富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和微量元素等營養(yǎng)成分[5]。近些年來已有研究報道，黑沙蒿作為飼料添加劑對動物可起到抗病、保健、促進生長、提高免疫功能的作用[6]，但基本集中于其水提物上，而有關(guān)黑沙蒿醇提物(Artemisiaordosicaethanol extract，AOEE)的研究鮮有報道。本研究以AOEE作為飼料添加劑添加到肉仔雞飼糧中，探討不同添加劑量的AOEE對肉仔雞生長性能和免疫功能的影響，從而得出AOEE在肉仔雞飼糧中的最適添加量，旨在為AOEE在動物生產(chǎn)中的推廣應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料實驗動物選取體質(zhì)量(37.35±0.23)g相近的240只1日齡AA肉雞，雌雄各半，于2020年8月26日至10月7日飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院動物營養(yǎng)代謝室。

試驗材料：黑沙蒿采自內(nèi)蒙古鄂爾多斯，自然陰干后粉碎，經(jīng)石油醚萃取脫色脫脂，采用超聲波輔助乙醇浸提處理，以60%乙醇為提取溶劑，料液比為 1∶30，在50℃、200 W功率下超聲1 h，將提取液濃縮凍干即為AOEE，經(jīng)NaNO2-Al(NO3)3-NaOH分光光度法[7]測定，AOEE中黃酮含量高達55.61%，經(jīng)苯酚硫酸法[8]測定，AOEE中多糖含量為14.59%。

1.2 試驗設(shè)計與飼糧本試驗采用單因子隨機區(qū)組設(shè)計，將240只肉仔雞按照體質(zhì)量相近原則隨機分成5 個日糧處理組，每組6 個重復，每個重復8只雞(雌雄各半)，試驗期為42 d。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加250，500，750，1 000 mg/kg的AOEE。參照NY/T(33-2004)肉雞營養(yǎng)需要量設(shè)計玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧?；A(chǔ)飼糧組成與營養(yǎng)水平值見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ)) %

1.3 飼養(yǎng)管理試驗期間肉雞均采用單層籠養(yǎng)方式，每籠為1個重復(8只雞)，雞只自由采食和飲水。試驗1～3 d每天保持23 h光照，4～21 d每天保持10 h光照，22～42 d每天保持23 h光照。試驗前對雞舍環(huán)境、雞籠和器具等進行徹底消毒。采用自然通風方式保持舍內(nèi)空氣清潔，雞籠統(tǒng)一采用紅外線加熱裝置的自動控溫系統(tǒng)，試驗前3 d保持舍內(nèi)溫度為(33±1)℃，之后每周降低3℃，直到降到21℃后保持恒定，試驗期間每天人工清糞1次并保證料槽飼料和飲水充足。盡量保證各組的試驗條件一致，并且每日觀察并記錄雞的精神狀態(tài)，及時剔除病雞。

1.4 樣品采集與制備分別于試驗21與42 d屠宰分離脾臟、胸腺、法氏囊并稱質(zhì)量，采集肝臟、脾臟各2份，一份置于錫箔紙中，-20℃保存用于免疫指標的測定，另一份置于凍存管中，-80℃保存用于基因表達的測定。

1.5 測定指標及方法

1.5.1生長性能 分別于試驗1，21，42 d早晨空腹稱質(zhì)量，以重復為單位計算試驗雞平均體質(zhì)量(ABW)、體增重(BWG)并準確記錄采食量和剩料量，計算試驗雞在試驗前期、試驗后期以及試驗全期的采食量(FI)和飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)，F(xiàn)CR=BWG/FI。

1.5.2免疫指標 于試驗21與42 d屠宰后分離雞的完整脾臟、胸腺和法氏囊，稱質(zhì)量并記錄，計算免疫器官指數(shù)。免疫器官指數(shù)(g/kg)=免疫器官鮮質(zhì)量(g)/活體質(zhì)量(kg)。

稱取0.5 g肝臟、脾臟組織樣分別放入10 mL離心管內(nèi)，按l∶9比例加入4.5 mL預冷生理鹽水進行勻漿，充分勻漿后用4℃離心機3 000 r/min離心15 min，離心后取上清液。采用考馬斯亮藍法測定勻漿液上清的蛋白濃度，用ELISA試劑盒測定勻漿液上清中白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素4(IL-4)、白細胞介素6(IL-6)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量。

1.5.3免疫相關(guān)基因表達量 使用Trizol試劑盒提取肝臟、脾臟組織總RNA；用Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；使用Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒實時熒光定量PCR，步驟如下：95℃ 30 s；95℃ 5 s,60℃ 33 s,35個循環(huán)反應。95℃ 15 s；60℃ 60 s,95℃ 1 s，1次循環(huán)。所有樣品做2個重復，并進行熔解曲線分析。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法[9]計算肝臟、脾臟免疫相關(guān)基因Toll樣受體4(TLR4)、髓樣分化因子88(MyD88)、核因子-κB p65(NF-κB p65)、NF-κB p50、IL-1β和IL-6的表達量。免疫相關(guān)基因引物序列如表2所示。

表2 免疫相關(guān)基因引物序

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.2分析軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，不同處理組的均值采用Duncan氏多重比較，采用回歸分析探討AOEE添加的劑量效應，P<0.01表示為差異或劑量效應極顯著，P<0.05表示為差異或劑量效應顯著，0.05≤P≤0.1為差異或劑量效應趨于顯著。

2 結(jié)果

2.1 AOEE對肉仔雞生長性能的影響如表3所示，在試驗21 d，各試驗組肉仔雞的平均體質(zhì)量無顯著性差異(P>0.05)，但有一次線性升高趨勢；在試驗42 d,隨著AOEE添加量的增加，肉仔雞的平均體質(zhì)量、體增重呈極顯著的一次線性或二次曲線升高效應(P<0.01)，且與對照組相比，飼糧中添加750和1 000 mg/kg AOEE對肉仔雞增重效果顯著(P<0.05)；各試驗組肉仔雞的采食量在前期和后期均無顯著性差異(P>0.05)；隨著AOEE添加量的增加，試驗前期的飼料轉(zhuǎn)化率呈顯著的二次曲線升高效應(P<0.05)，試驗后期的飼料轉(zhuǎn)化率呈顯著的一次線性升高效應(P<0.05)，試驗全期的飼料轉(zhuǎn)化率呈顯著的一次線性升高效應(P<0.05)，且有二次曲線升高趨勢。

表3 AOEE對肉仔雞生長性能的影響

2.2 AOEE對免疫器官指數(shù)的影響由表4可知，在試驗期21 d，隨著AOEE添加量的增加，各試驗組肉仔雞的胸腺指數(shù)有一次線性上升趨勢，法氏囊指數(shù)有一次線性或二次曲線上升趨勢；在試驗期42 d，隨著AOEE添加量的增加，肉仔雞脾臟指數(shù)呈顯著的一次線性升高效應(P<0.05)，有二次曲線上升趨勢，胸腺指數(shù)呈顯著的一次線性或二次曲線升高效應(P<0.05)。

表4 AOEE對肉仔雞免疫器官指數(shù)的影響 g/kg

2.3 AOEE對肉仔雞肝臟、脾臟免疫指標及相關(guān)基因表達的影響從圖1中可以看出，在試驗期21 d，隨著AOEE添加量的增加，肉仔雞肝臟中IgA含量呈顯著的一次線性或二次曲線升高效應(P<0.05)，IgM含量呈極顯著的二次曲線升高效應(P<0.01)，IL-1β含量呈顯著的二次曲線降低效應(P<0.05)，IL-6呈極顯著的一次線性或二次曲線降低效應(P<0.01)；方差分析結(jié)果表明，與對照組相比，飼糧中添加750 mg/kg AOEE顯著提高了肝臟中IgM的含量(P<0.05)，并顯著降低了IL-1β和IL-6的含量(P<0.05)；在試驗期42 d，隨著AOEE添加量的增加，肉仔雞肝臟中IgM含量呈極顯著的二次曲線升高效應(P<0.01)，IL-2含量呈極顯著的一次線性或二次曲線升高效應(P<0.01)，IL-4含量有一次線性升高效應(P<0.05)，IL-1β含量有一次線性降低趨勢；與對照組相較，飼糧中添加500 mg/kg AOEE顯著提高了IgM的含量(P<0.05)，飼糧中添加500，750，1 000 mg/kg AOEE顯著提高了IL-2的含量(P<0.05)。

注：Lin.為一次線性;Qua.為二次曲線。柱狀圖上方無肩標字母或含相同字母表示單因素方差分析差異不顯著(P>0.05)；不同小寫字母表示單因素方差分析差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示單因素方差分析差異極顯著(P<0.01)。下同

如圖2所示，在試驗期21 d，隨著AOEE添加量的增加，肉仔雞肝臟中TLR4表達量有一次線性降低趨勢，MyD88表達量呈顯著的二次曲線降低效應(P<0.05)，NF-κB p65表達量呈顯著的一次線性降低效應(P<0.05)，有二次曲線降低趨勢，IL-6表達量呈極顯著的一次線性或二次曲線降低效應(P<0.05)，且方差分析結(jié)果表明，與對照組相比，飼糧中添加不同劑量的AOEE，均可下調(diào)肉仔雞肝臟中IL-6表達量，且效果極顯著(P<0.01)；在試驗期42 d，隨著AOEE添加量的增加，TLR4表達量呈顯著的一次線性或二次曲線降低效應(P<0.05)，MyD88和NF-κB p50表達量呈極顯著的一次線性或二次曲線降低效應(P<0.01)，NF-κB p65表達量有二次曲線降低趨勢，IL-6表達量呈極顯著的一次線性(P<0.01)或顯著的二次曲線(P<0.05)降低效應，方差分析結(jié)果表明，與對照組相比，飼糧中添加750和1 000 mg/kg AOEE極顯著下調(diào)了MyD88表達水平(P<0.01)，顯著下調(diào)了NF-κB p50和IL-6表達量(P<0.05)。

圖2 AOEE對肉仔雞肝臟免疫相關(guān)基因表達的影響

從圖3中可以看出，在試驗期21 d，隨著AOEE添加量的增加，肉仔雞脾臟中 IgA含量有一次線性或二次曲線升高趨勢，IgG和IgM含量呈極顯著的一次線性或二次曲線升高效應(P<0.01)，IL-6含量有一次線性降低趨勢，且方差分析結(jié)果表明，飼糧中添加500～1 000 mg/kg AOEE均可提高肉仔雞脾臟中IgG和IgM的含量，且效果極顯著(P<0.01)；在試驗期42 d，隨著AOEE添加量的增加，肉仔雞脾臟中IgA和IL-2含量呈極顯著的一次線性(P<0.01)或顯著的二次曲線(P<0.05)升高效應，IL-4含量呈顯著的一次線性或二次曲線升高效應(P<0.05)，IL-6含量呈顯著的二次曲線降低效應(P<0.05)，有一次線性降低趨勢。

圖3 AOEE對肉仔雞脾臟免疫指標的影響

由圖4可知，在試驗期21 d，隨著AOEE添加量的增加，肉仔雞脾臟中TLR4 和IL-1β表達量有二次曲線降低趨勢(P<0.05)；在試驗期42 d，隨著AOEE添加量的增加，肉仔雞脾臟中TLR4表達量有一次線性降低趨勢，NF-κB p65表達量呈顯著的一次線性降低效應(P<0.05)，有二次曲線降低趨勢。

圖4 AOEE對肉仔雞脾臟免疫相關(guān)基因表達的影響

3 討論

3.1 AOEE對肉仔雞生長性能的影響已有研究表明，蒿屬植物富含黃酮類、有機酸以及微量化學元素，作為飼料添加劑能夠顯著提高動物新陳代謝，進而發(fā)揮促生長作用[10]。飼糧中添加黑沙蒿水提物可提高肉仔雞日增重，且隨著添加劑量的增加呈現(xiàn)出顯著的一次線性或極顯著的二次曲線升高效應[11]。此外，張晶等[12]報道，艾蒿醇提物可以顯著提高肉仔雞的末體質(zhì)量，改善動物的生長性能，進一步研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加艾蒿醇提物可顯著緩解免疫應激下肉雞的平均日增重的下降[13]。本試驗結(jié)果表明，在飼糧中添加750 mg/kg AOEE可顯著提高肉仔雞的末體質(zhì)量和增重，隨著AOEE添加量的增加，肉仔雞飼養(yǎng)后期以及全期的體增重和飼糧轉(zhuǎn)化率呈顯著的一次線性或二次曲線升高效應，說明適宜劑量的AOEE具有促進肉仔雞生長的作用。經(jīng)分析AOEE中的大部分活性物質(zhì)為黃酮類化合物，而黃酮是一類具有抗菌活性的植物化學物質(zhì)，它含有大量的羥基，酚羥基的氫鍵能夠與堿性氨基酸側(cè)鏈的氮原子結(jié)合，進入大腸桿菌內(nèi)，導致細菌死亡，還可以對抗消化道中的致病菌和其他有害細菌，改善腸道菌群平衡，促進腸道消化吸收，從而提高肉雞的飼料轉(zhuǎn)化率[14]，因此推斷AOEE的促生長效果可能是黑沙蒿黃酮發(fā)揮作用。

3.2 AOEE對肉仔雞免疫器官指數(shù)的影響禽類的免疫器官主要是脾臟、胸腺和法氏囊。脾臟是禽類最大的外周免疫器官，富含吞噬病菌的免疫細胞，并產(chǎn)生免疫球蛋白，是機體細胞免疫和體液免疫的中心[15]；胸腺是細胞免疫的中樞器官，也是T淋巴細胞分化成熟的場所，與細胞免疫和體液免疫密切相關(guān)，在維持機體免疫穩(wěn)定方面起重要作用[16]；法氏囊又稱腔上囊，是禽類特有的中樞免疫器官，是B淋巴細胞分化、發(fā)育、成熟以及免疫球蛋白基因分化和基礎(chǔ)基因庫形成及擴展的主要器官，對維持機體體液免疫功能十分重要[17]。因此，脾臟、胸腺和法氏囊的大小可反映禽類的免疫狀況,免疫器官相對質(zhì)量增加，預示著機體免疫機能增強[18]。本試驗結(jié)果表明，試驗期內(nèi)肉仔雞的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)隨AOEE添加量的增加呈現(xiàn)出顯著的一次線性或二次曲線升高效應，對法氏囊發(fā)育也有一定的促進作用，這與先前的研究柑橘乙醇提取物以劑量依賴方式提高肉仔雞免疫器官指數(shù)結(jié)果相符[19]。

3.3 AOEE對肉仔雞肝臟、脾臟免疫指標的影響在畜禽飼養(yǎng)的過程中，由于各種外界因素會引起機體產(chǎn)生應激，損傷機體免疫功能。免疫球蛋白作為體液免疫的重要組成部分，不僅能夠促進單核細胞和巨噬細胞的吞噬作用，還可以與抗原結(jié)合產(chǎn)生多種生物學效應，在機體的特異性免疫應答中發(fā)揮十分重要的作用[20]。肝臟作為機體最大的網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞吞噬系統(tǒng)，在防御毒性物質(zhì)侵襲、防止病原體感染中發(fā)揮重要作用[21]。本試驗結(jié)果表明，與對照組相比，飼糧中添加500～1 000 mg/kg AOEE顯著提高肉仔雞肝臟中IgM的含量，極顯著提高脾臟中IgG及IgM的含量，且呈劑量依賴性地隨飼糧中AOEE添加量的增加而升高，這說明適宜劑量的AOEE可以促進肉仔雞體液免疫。細胞因子是細胞間信息傳遞的信使，是反映機體免疫應答與炎癥調(diào)控的重要指標[22]。門連超等[23]在研究藏藥兔耳草醇提物對小鼠免疫功能的影響時發(fā)現(xiàn)，藏藥兔耳草醇提物可顯著提高小鼠機體內(nèi)IL-2和IL-4的水平，在本研究中，AOEE提高了肝臟和脾臟中抗炎因子IL-2和IL-4的分泌，降低了促炎因子IL-1β和IL-6的水平，因此可以確定，適宜劑量的AOEE可以通過調(diào)節(jié)肉仔雞免疫球蛋白和細胞因子的水平來調(diào)節(jié)機體免疫功能。這可能與黃酮類化合物能夠增強巨噬細胞吞噬能力，通過調(diào)節(jié)先天性和適應性免疫系統(tǒng)中免疫細胞因子和免疫球蛋白的產(chǎn)生來減輕炎癥，還能夠通過與細胞因子受體的結(jié)合起到抗炎作用，從而增強機體免疫能力有關(guān)[24]。

3.4 AOEE對肉仔雞肝臟、脾臟免疫相關(guān)基因表達量的影響TLR4是細胞膜上的一種模式識別受體，可對不同病原相關(guān)分子模式進行識別、結(jié)合，并傳遞信號給下游的炎癥信號轉(zhuǎn)導因子NF-κB[25]。NF-κB是細胞核內(nèi)調(diào)節(jié)免疫基因表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，主要由p65和p50結(jié)合成二聚體保持沉默狀態(tài)[26]。當TLR4受到細胞外信號刺激時，通過信號轉(zhuǎn)導銜接蛋白MyD88激活NF-κB，進而促進末端炎癥因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-1和IL-6等的轉(zhuǎn)錄釋放，誘發(fā)免疫反應[27]。有研究報道，濱蒿總黃酮可作用于信號通路中病毒感染相關(guān)靶點，使TLR3、NF-κB mRNA表達水平明顯下調(diào)，同時也顯著降低IL-6、TNF-α和iNOS mRNA表達水平，由此認為濱蒿總黃酮可通過抑制TLR3/NF-κB信號通路的作用和機體炎癥反應來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎的作用[28]。李昆[29]研究發(fā)現(xiàn)，注射LPS后顯著上調(diào)了肉雞各組織中TLR4、MyD88和NF-κB的表達量，說明免疫應激導致了TLR4的過度表達，MyD88、NF-κB的表達量也顯著上升，然而在飼糧中添加黑沙蒿提取物可以不同程度地降低上述基因的表達水平。在本試驗中，與對照組相比，飼糧中添加AOEE可顯著降低MyD88、NF-κB/p50的mRNA的表達，并顯著下調(diào)了炎癥因子IL-6的mRNA表達水平，且隨著AOEE添加量的增加，肉仔雞肝臟中TLR4受到抑制，其下游信號分子MyD88、NF-κB/p65、NF-κB/p50的轉(zhuǎn)錄水平均呈現(xiàn)顯著的一次線性或二次曲線降低效應，從而調(diào)控了IL-6的表達量，在試驗后期尤為顯著。這可能由于黃酮類化合物在胞外可與細胞表面的TLR4相互作用，抑制下游通路NF-κB的激活[30]，也有可能是黃酮類化合物進入細胞直接抑制IKK(NF-κB激酶)的活性，下調(diào)NF-κB的激活，從而降低肉仔雞免疫器官的炎癥反應[31]。因此可以推斷，AOEE可能通過黃酮類化合物抑制TLR4/NF-κB信號通路來調(diào)節(jié)機體免疫。