鄭晨曦，郭興華，吳天鴿，徐少宇，馮嘉軒，孫 聰

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.吉林大學(xué) 第二臨床醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130041；3.敦化市畜牧站，吉林 敦化 133799；4.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種與腸道微生物生態(tài)失調(diào)、黏膜免疫系統(tǒng)受損及環(huán)境因素有關(guān)的炎癥性疾病，與克羅恩病(CD)統(tǒng)稱為炎癥性腸病(IBD)，發(fā)病機(jī)制暫不明確[1]。UC發(fā)病年齡趨于年輕化，患病率及死亡率在全球范圍內(nèi)逐漸上升[2]。目前，UC的治療藥物主要有5-氨基水楊酸、免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素，但長(zhǎng)期服用存在藥物毒性、感染等副作用[3]。因此探討UC可能的治療機(jī)制成為亟待解決的科學(xué)問(wèn)題。

UC發(fā)病過(guò)程中腸道菌群紊亂可導(dǎo)致大量細(xì)菌死亡溶解釋放脂多糖(LPS)入侵機(jī)體，LPS可能作為炎癥的起始環(huán)節(jié)影響UC的發(fā)生，常用于UC模型的制備和早期診斷指標(biāo)[4]。腸道免疫異常導(dǎo)致的黏膜免疫屏障功能受損是UC發(fā)病的重要因素，腸道免疫屏障中起核心作用的是分泌型免疫球蛋白A(sIgA)[5]。sIgA是腸道分泌最多的免疫調(diào)節(jié)蛋白，通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)有效保護(hù)腸道屏障的完整性，是維持腸黏膜穩(wěn)態(tài)的第一道防線[6]。外周血單核細(xì)胞(MONO)是血液中體積最大的白細(xì)胞，可分化為巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，臨床上常作為炎癥檢查的輔助診斷方法。UC患者M(jìn)ONO的數(shù)量與UC疾病活動(dòng)度密切相關(guān)，單核細(xì)胞計(jì)數(shù)可以作為潛在的UC生物標(biāo)志物[7]。

UC臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重等，屬于中醫(yī)“泄瀉”，“痢疾”，“腸澼”等范疇，葛根芩連湯(GQD)是治療濕熱所致腹瀉和痢疾的經(jīng)典方劑，被認(rèn)為是治療UC的經(jīng)典良方[8]。GQD能調(diào)節(jié)腸道菌群及其代謝途徑保護(hù)腸道[9]。但是其調(diào)節(jié)腸道菌群與炎性因子間相關(guān)性的機(jī)制仍不明確。因此，本研究旨在將腸道菌群和炎性因子相關(guān)聯(lián)，探究GQD治療UC小鼠的可能機(jī)制，為UC的防制及相關(guān)微生態(tài)制劑研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組48只SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠[SCXK(遼)-2020-0001]購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物科技股份有限公司。動(dòng)物在(22±1)℃的溫度，45%～65%的相對(duì)濕度下飼養(yǎng)，12 h光照/黑暗循環(huán)適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)、模型組(Model，4% DSS)、陽(yáng)性藥美沙拉嗪組(Mes，0.60 g/kg)、葛根芩連湯低劑量組(GQD-L，6.25 g/kg)、葛根芩連湯中劑量組(GQD-M，12.50 g/kg)、葛根芩連湯高劑量組(GQD-H，25.00 g/kg)，每組8只。Control組正常給予飲食和飲水，其余各組給予4% DSS自由飲用6 d。隨后，Mes組和GQD組每日灌胃相應(yīng)藥物治療，Control和Model組灌胃0.9%生理鹽水，每日1次，連續(xù)14 d，每天記錄小鼠體質(zhì)量和糞便狀態(tài)及隱血情況。試驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠收集結(jié)腸組織，結(jié)腸內(nèi)容物及血用于后續(xù)分析。

1.2 試劑及藥物制備葛根芩連湯由葛根15 g，黃芩9 g,黃連9 g，甘草6 g組成，均為中藥配方顆粒，購(gòu)自廣東一方制藥有限公司(0095453，0123763，0112593，0101713)。將所有配方顆?；靹蚝蠹尤胝麴s水分別配置成6.25，12.50，25.00 g/kg混懸液；葡聚糖硫酸鈉(DSS，M.W.=36 000～50 000)購(gòu)自MP Biomedicals(NO.S4140)。精密稱定4 g DSS溶于100 mL蒸餾水中，配制成4% DSS溶液，每日現(xiàn)用現(xiàn)配。美沙拉嗪腸溶片購(gòu)自葵花藥業(yè)集團(tuán)佳木斯鹿靈制藥有限公司(200403)，配制成0.60 g/kg水溶液；sIgA及LPS所需ELISA試劑盒購(gòu)自FEIMOBIO公司(E20210701A)；糞便隱血試劑盒購(gòu)自雷根生物(0615A21)；QIAamp?DNA Stool Mini Kit購(gòu)自德國(guó)Qiagen，Hilden；MiSeq Reagent Kit v3試劑盒購(gòu)自美國(guó)Illumina公司(MS-102-3003)；Agencourt AMPure XP PCR Purification Beads購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司(A-A63880)；TopTap DNA聚合酶試劑盒購(gòu)自Transgen(AP151-03)。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI) 通過(guò)小鼠體質(zhì)量變化、糞便特征和糞便隱血試驗(yàn)計(jì)算DAI分?jǐn)?shù)[10]。

1.3.2蘇木精伊紅(HE)染色和組織學(xué)分析 末次給藥后，小鼠禁食不禁水12 h，頸椎脫臼法處死小鼠，結(jié)腸組織用4%多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度洗脫，二甲苯浸泡，石蠟包埋后4 μm厚切片，蘇木精伊紅染色，鏡下觀察結(jié)腸損傷程度和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況，進(jìn)行組織學(xué)分析[11]。

1.3.3腸道菌群16S rRNA測(cè)序 收集結(jié)腸中糞便樣品進(jìn)行糞便基因組DNA提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DAN完整性。以341F:CCTACGGGNGGCWGCAG為上游引物，以805R:GACTACHVGGGTATCTAATCC為下游引物進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA的V3～V4區(qū)域PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳和QuantiFluorTM-ST熒光定量系統(tǒng)用于純化和定量檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物[12]。純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA文庫(kù)構(gòu)建，通過(guò)Genesky Biotechnologies Inc.(中國(guó)上海)在Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行樣本2×250 bp雙端測(cè)序和生物信息學(xué)分析。使用QIIME2、flash2和R等軟件對(duì)Reads進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控和統(tǒng)計(jì)，運(yùn)用Usearch10進(jìn)行Amplicon Sequence Variants(ASV)非聚類去噪，對(duì)質(zhì)控拼接好的序列按照97%相似性進(jìn)行OTU聚類分析，生成操作分類單元(OTU/ASV)[13]?；贠TU/ASV聚類分析結(jié)果，利用R對(duì)α、β多樣性及群落物種組成差異性進(jìn)行分析。

1.3.4炎性細(xì)胞因子檢測(cè) 小鼠眼球取血置于EDTA抗凝管內(nèi)，全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)MONO比例。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，將收集的血液3 000 r/min 離心10 min分離血清，洗板后各孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品和各組待測(cè)樣品50 μL，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，封口膜封住37℃溫育60 min，洗板后各孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min，每孔加入終止液50 μL，測(cè)定D450值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件單因素方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)，LSD法進(jìn)行多重比較。使用QIIME2、R ggplot2(v3.3.0)進(jìn)行腸道菌群多樣性指數(shù)分析和多樣本物種組成柱狀圖分析。P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量及疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)變化Control組小鼠飲水量、攝食量及毛色正常，大便成形，體質(zhì)量逐漸上升，各造模組小鼠飲水及攝食量減少，背毛粗糙且無(wú)光澤，體質(zhì)量下降，試驗(yàn)3 d出現(xiàn)便稀或便血現(xiàn)象。7 d，Model及Mes組各死亡1只小鼠，其余小鼠正常存活。治療結(jié)束后，與Control組比較，Model組小鼠體質(zhì)量顯著下降(P<0.001)，DAI評(píng)分顯著上升(P<0.001)。與Model組比較，Mes組體質(zhì)量上升(P<0.05)，GQD-L組體質(zhì)量升高(P<0.01)，GQD-M、GQD-H組體質(zhì)量顯著升高(P<0.001)，DAI評(píng)分均顯著下降(P<0.001)(圖1A，B)。

圖1 不同給藥對(duì)UC小鼠體質(zhì)量(A)及DAI評(píng)分(B)的影響

2.2 組織病理學(xué)觀察及評(píng)分結(jié)果如HE染色結(jié)果所示，Control組結(jié)腸組織黏膜上皮層完整，腺體結(jié)構(gòu)清晰，隱窩完整，沒(méi)有潰瘍點(diǎn)；Model組結(jié)腸可見(jiàn)廣泛的黏膜損傷和潰瘍，黏膜及黏膜下層有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體及隱窩缺失；Mes組結(jié)腸組織部分腺體恢復(fù)；GQD各組結(jié)腸組織潰瘍情況較Model組明顯改善，僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2A)。對(duì)結(jié)腸病理?yè)p傷進(jìn)行評(píng)分，Model組的組織學(xué)評(píng)分顯著高于Control組(P<0.001)，與Model組比較，Mes及GQD各組可顯著抑制結(jié)腸組織損傷(P<0.001)，其中GQD-H組效果最顯著(圖2B)。

A.小鼠結(jié)腸組織HE染色(×200)；B.組織病理學(xué)評(píng)分;*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。下同

2.3 葛根芩連湯對(duì)UC小鼠腸道菌群的影響

2.3.1多樣性分析 以抽取的序列數(shù)及其對(duì)應(yīng)的多樣性指數(shù)構(gòu)建Shannon-Wiener曲線，隨著測(cè)序數(shù)據(jù)量的增加曲線趨于平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息(圖3A)。采用OTU Venn圖分析菌群OTU數(shù)量及其種類交叉情況，Control和Model組的總 OTU分別為616，612個(gè)，特異性 OTU 分別為84，80個(gè)，共有 OTU為532個(gè)，占總OTU數(shù)的76.44%。與Control組比較，Model組腸道菌群物種豐度降低(圖3B)。

A.樣品Shannon-Wiener曲線；B.Venn圖

2.3.2門(mén)水平物種組成差異 門(mén)水平上各組小鼠腸道菌群主要由厚壁菌門(mén)(Firmicutes)，(各組占比60.231 9%，44.866 4%，54.479 1%，50.342 4%，52.925 3%，52.560 0%)，擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)(各組占比24.996 0%，36.009 7%，24.103 2%，39.295 0%，28.724 7%，33.303 1%)，變形菌門(mén)(Proteobacteria)(各組占比7.132 1%，10.259 4%，9.236 7%，4.988 0%，6.675 3%，5.335 6%)和放線菌門(mén)(Actinobacteria)(各組占比3.681 6%，2.206 0%，4.146 6%，1.469 8%，2.262 7%，1.607 4%)組成。與Control組比較，Model組小鼠的Firmicutes(P<0.001)和Actinobacteria(P<0.05)比例降低，Bacteroidetes(P<0.01)和Proteobacteria(P>0.05)比例升高，治療后部分菌群回調(diào)。Firmicutes與Bacteroidete比值(F/B)被證明與UC病程相關(guān)[14]。本研究中Model組F/B降低，符合UC腸道菌群失調(diào)的病理特征，經(jīng)Mes及不同濃度GQD干預(yù)后，F(xiàn)/B均上升(圖4A～D)。

A～D.不同給藥對(duì)UC小鼠Firmicutes，Bacteroidetes，Proteobacteria和Actinobacteria的影響

2.3.3屬水平物種組成差異 為進(jìn)一步比較組間差異菌群，本試驗(yàn)基于屬水平以P<0.05作為差異顯著性篩選閾值，分析各組中具有顯著差異的物種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、韋榮球菌科未定屬(Erysipelotrichaceae_incertae_sedis)、埃希菌/志賀菌屬(Escherichia/Shigella)和腸球菌屬(Enterococcus)是組間差異較大菌屬。與Control組比較，Model組Lactobacillus比例降低15.678 1%(P<0.001)，其余3種菌屬比例分別上升0.110 8%(P<0.001)，0.090 0%(P<0.001)和0.023 9%(P<0.001)。與Model組比較，Mes組Lactobacillus比例升高5.754 4%(P>0.05)，其余3種菌屬比例分別下降0.117 9%(P<0.001)，0.090 2%(P<0.001)和0.023 5%(P<0.001)。GQD-L組與Model組比較，Lactobacillus比例上升9.97%(P<0.05)，Erysipelotrichaceae_incertae_sedis、Escherichia/Shigella和Enterococcus比例分別下降0.088 1%(P<0.01)，0.090 7%(P<0.001)和0.030 6%(P<0.001)。GQD-M組與Model組比較，Lactobacillus比例上升2.920 0%(P>0.05)，另3種菌屬比例分別下降0.118 1%(P<0.001)，0.062 7%(P<0.01)和0.026 2%(P<0.001)。GQD-H組與Model組比較，Lactobacillus比例上升8.087 8%(P>0.05)，另3種菌屬比例分別下降0.115 2%(P<0.001)，0.091 3%(P<0.001)和0.030 6%(P<0.001)。4種菌屬在Mes組和不同GQD組間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 屬水平小鼠腸道差異菌群豐度 %

2.4 葛根芩連湯對(duì)UC小鼠炎癥因子的調(diào)節(jié)作用與Control組比較，Model組小鼠MONO比例(P<0.01)及LPS水平(P<0.001)升高，sIgA水平(P<0.001)水平降低。與Model組比較，經(jīng)Mes干預(yù)后，MONO比例下降(P<0.05)，sIgA水平上升(P<0.001)。GQD-L組對(duì)3種炎性因子水平無(wú)顯著性影響(P>0.05)。GQD-M組降低MONO比例(P<0.05)和LPS水平(P<0.05)，升高sIgA水平(P<0.01)。GQD-H組降低MONO比例(P<0.05)和LPS水平(P<0.01)，升高sIgA水平(P<0.01)(圖5A～C)。

A.MONO比例變化;B.LPS水平變化;C.sIgA水平變化

3 討論

在UC的治療中，以GQD為主的中藥復(fù)方在治療方法總有效率、不良反應(yīng)發(fā)生率方面優(yōu)于西藥[15]。GQD能夠通過(guò)改善腸道炎癥反應(yīng)和修復(fù)腸道黏膜屏障顯著治療UC[16-17]。在這項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)UC小鼠毛發(fā)稀疏無(wú)光澤，體質(zhì)量減輕，DAI評(píng)分升高，大便松散不成形，腹瀉甚至便血。HE染色觀察到小鼠結(jié)腸組織潰瘍點(diǎn)，局部隱窩消失，腺體不完整及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。GQD可明顯改善DSS所誘導(dǎo)的UC的病理癥狀，表現(xiàn)DAI評(píng)分和組織病理學(xué)評(píng)分降低，結(jié)腸組織潰瘍點(diǎn)及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少等。

UC患者的腸道菌群失調(diào)是腸道黏膜損傷的主要因素，也是衡量病程的參數(shù)之一[18]。本研究發(fā)現(xiàn)UC小鼠的腸道菌群多樣性及F/B比值降低，與先前報(bào)道一致[19]。GQD提高了F/B比值，調(diào)節(jié)了菌群失衡狀態(tài)。在門(mén)水平，各組小鼠腸道菌群主要由Firmicutes，Bacteroidetes，Actinobacteria和Proteobacteria組成。在屬水平，GQD主要通過(guò)調(diào)節(jié)Lactobacillus、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis、Escherichia/Shigella和Enterococcus水平發(fā)揮作用。Lactobacillus是腸道中的優(yōu)勢(shì)有益菌群，能拮抗致病菌，保持機(jī)體健康狀態(tài)[20]。Erysipelotrichaceae與腸道炎癥密切相關(guān)，研究表明小鼠中-重度回腸炎及結(jié)腸炎急性炎癥期時(shí)腸道菌群多樣性降低，Erysipelotrichaceae豐度增加[21]。用促炎因子TNF誘導(dǎo)引發(fā)CD樣小鼠結(jié)腸透壁性炎癥時(shí)，Erysipelotrichaceae的豐度也顯著增加，表明Erysipelotrichaceae和 TNF水平有相關(guān)性[22]。另有研究探討了包括 UC、CD、偽膜性結(jié)腸炎和結(jié)腸癌的3 048個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)的人類腸道炎癥疾病菌群表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)腸道發(fā)生炎癥疾病時(shí)Erysipelotrichaceae家族豐度增高[23]。這些研究都表明Erysipelotrichaceae與UC密切相關(guān)，并且能促進(jìn)腸道炎癥發(fā)展。運(yùn)用四氯化碳預(yù)處理豚鼠后灌入Escherichia/Shigella，豚鼠們表現(xiàn)出了致命的腸道感染。同樣有研究檢測(cè)UC患者腸道菌群，發(fā)現(xiàn)其腸道微生態(tài)失調(diào)主要表現(xiàn)為Escherichia/Shigella豐度增加，與本研究結(jié)果一致[24]。Enterococcus是腸道表層的代表菌群，在特定條件下能直接侵襲機(jī)體，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病[25]。Enterococcus在小鼠模型中促進(jìn)結(jié)腸炎的發(fā)生，與健康人相比，UC患者的Enterococcus數(shù)量增加[26]。本試驗(yàn)結(jié)果與上述理論相符，提示GQD升高了有益菌豐度，降低了有害菌豐度，調(diào)節(jié)了UC小鼠的腸道菌群失衡狀態(tài)。

腸道菌群失調(diào)通過(guò)引發(fā)腸道黏膜持續(xù)慢性炎癥以及免疫異常促進(jìn)UC的發(fā)生[27]。研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群紊亂會(huì)導(dǎo)致LPS釋放菌以及腸道LPS釋放增加，使腸道攝入更多LPS入血并持續(xù)激活炎癥通路，LPS可能是腸道菌群激發(fā)炎癥反應(yīng)的源頭，因此LPS在UC的發(fā)展中極其重要[28]。sIgA可以中和LPS，防止細(xì)菌黏附于腸壁上，UC發(fā)病時(shí)sIgA的分泌受到抑制，腸道的抗菌定植能力減弱，有利于LPS和細(xì)菌入侵體內(nèi)。sIgA通過(guò)促進(jìn)細(xì)菌凝集，阻斷病原體對(duì)黏膜的黏附，同時(shí)調(diào)節(jié)腸道微生物群結(jié)構(gòu)維持腸腔內(nèi)穩(wěn)態(tài)，在腸道黏膜免疫中發(fā)揮主要作用[29]。研究表明，UC患者腸道免疫屏障受損是由于sIgA分泌障礙，減少的sIgA使病原體黏附增加，引起腸道穩(wěn)態(tài)失衡，腸道黏膜受損后，腸道屏障通透性增加，進(jìn)入腸道的細(xì)菌、LPS等抗原成分增多，引起炎癥反應(yīng)和組織破壞[30]。嚴(yán)偉等[31]通過(guò)研究不同嚴(yán)重程度的UC患者M(jìn)ONO計(jì)數(shù)，結(jié)果提示其與UC嚴(yán)重程度具有重要關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)GQD可以回調(diào)UC小鼠MONO，LPS及sIgA水平。已知Mes主要通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)治療UC，本試驗(yàn)中GQD-M和GQD-H組與Mes對(duì)炎性因子的影響無(wú)顯著差別，表明GQD同樣有效抑制了UC的炎癥反應(yīng)，但GQD具體調(diào)節(jié)哪些信號(hào)通路發(fā)揮作用仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，GQD可有效修復(fù)UC結(jié)腸病變程度，升高腸道中有益菌豐度，降低有害菌豐度，調(diào)節(jié)菌群失衡狀態(tài)，從而降低菌群紊亂造成的LPS水平升高，同時(shí)增加sIgA水平發(fā)揮抗炎作用。這將為UC臨床上的新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。