趙 強(qiáng)，趙云環(huán)，郭 禹，翟 剛，張 帥，郭曉旭，范京惠，左玉柱*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071001)

豬圓環(huán)病毒病(porcine circovirus associated diease,PCVAD)是由豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)感染導(dǎo)致的，患病豬可呈現(xiàn)多系統(tǒng)衰竭綜合征、皮炎腎病綜合征、呼吸綜合征、母豬繁殖障礙、仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭等癥狀，該病毒會(huì)破壞機(jī)體的免疫機(jī)能，造成免疫應(yīng)答能力減弱，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體易受其他病原體的侵襲[1]。此外，該病分布廣泛，存在于所有主要豬肉生產(chǎn)國(guó)，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)ORF2編碼的衣殼蛋白(Cap)是病毒的唯一結(jié)構(gòu)蛋白，決定病毒的抗原性，在一定情況下可自發(fā)組裝成17 nm左右的病毒樣顆粒(VLP)[3]。VLP不含病毒遺傳物質(zhì)，不能復(fù)制，不具有感染能力，具有天然病毒顆粒的類似空間立體結(jié)構(gòu)，可以有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)效應(yīng)[4]。因此，Cap已成為許多研究人員體外表達(dá)并研制成亞單位疫苗的理想目標(biāo)。

現(xiàn)有市場(chǎng)上暫無(wú)針對(duì)PCV2的特效藥，接種疫苗是控制PCV2感染的一種有效而經(jīng)濟(jì)的方法[5]。目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上多為滅活疫苗和亞單位疫苗。滅活疫苗通常在PK-15細(xì)胞中生產(chǎn)，但是PCV2在PK-15細(xì)胞中繁殖不良，產(chǎn)量較低[6]。亞單位疫苗中基于衣殼蛋白的VLP疫苗可以在真核表達(dá)系統(tǒng)或原核表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)并獨(dú)立自組裝形成VLPs，但在真核表達(dá)系統(tǒng)中，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，需要昂貴的超速離心或?qū)游鎏峒?，試?yàn)條件要求高。在原核表達(dá)系統(tǒng)中制備VLP疫苗則成本低，生產(chǎn)周期短，但由于Cap蛋白N端富含連續(xù)的稀有密碼子，使其在大腸桿菌中難以表達(dá)[7]。因此，為實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中PCV2 Cap蛋白全長(zhǎng)的可溶性表達(dá)，并通過(guò)鎳親和層析法純化，使其在體外組裝成VLP，本研究嘗試將臨床分離得到的PCV2 ORF2全長(zhǎng)密碼子優(yōu)化，并轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21中誘導(dǎo)表達(dá)，嘗試用改良的鎳親和層析法純化Cap蛋白并通過(guò)透析組裝VLP，在小鼠體內(nèi)初步評(píng)價(jià)了自制的VLP疫苗的免疫原性，為研制PCV2亞單位疫苗及相關(guān)生物制品奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料pET32a載體、T4DNA連接酶、pMD19-T 載體、DL5000/DL2000 DNA Marker、限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；PCV2 IgG抗體定性檢測(cè)試劑盒(ELISA)購(gòu)自江蘇博深生物科技有限公司；6～8周齡SPF BALB/c小鼠購(gòu)自北京斯貝福公司；Blue Plus Protein Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCV2滅活疫苗(ZJ/C株)購(gòu)自瑞普生物；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)購(gòu)自Cwbio Beijing公司；氨芐青霉素鈉、DAB顯色試劑盒、NC膜等購(gòu)自Solarbio Beijing公司；HRP標(biāo)記的6*His，His-Tag小鼠單克隆抗體、HRP標(biāo)記兔抗豬IgG抗體購(gòu)自 Proteintech Beijing公司;豬源PCV2 Cap多克隆抗體、E.coliDH5α、BL21感受態(tài)細(xì)胞由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.2 目的基因的獲得與重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定根據(jù)PCV2(GenBank：KX641138.1)ORF2序列，設(shè)計(jì)特異性引物PCV2-Cap-F：5′-ATGACGTATCCAAGGAGGCG-3′和PCV2-Cap-R：5′-TTAGGG-TTTAAGTGGGGGGT-3′。以臨床組織病料中提取的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段，送往上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序后得到的目的基因利用密碼子適配工具(http://www.friendbio.com/codon.html)將密碼子優(yōu)化至CAI=1，并交由上海生工生物有限公司合成重組質(zhì)粒pET-32a-yCap(含酶切位點(diǎn)BamHⅠ和HindⅢ)，優(yōu)化前后的序列詳見(jiàn)圖1。將重組質(zhì)粒pET-32a-yCap進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確后，膠回收優(yōu)化后的目的基因進(jìn)一步測(cè)序鑒定，鑒定成功的重組質(zhì)粒備用。

1.3 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中37℃過(guò)夜培養(yǎng)；次日挑取單個(gè)菌落于含5 μL氨芐青霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)14 h。以此菌液為母液，在含100 μL氨芐青霉素的100 mL LB液體培養(yǎng)基中加入1 mL母液，37℃，200 r/min 培養(yǎng)至D600值為0.6左右時(shí)加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后在4℃情況下10 000 r/min離心10 min，收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體沉淀。按每100 mg濕菌體加入3 mL菌體裂解液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，10%甘油，0.1%吐溫80，10 mmol/L β-巰基還原劑)進(jìn)行重懸，在冰浴中進(jìn)行超聲破碎菌體。待菌體充分裂解后，在4℃情況下10 000 r/min離心3 min，分別收集上清與沉淀，沉淀用等量上清液的PBS進(jìn)行重懸。上清與重懸后的沉淀各取40 μL并加入10 μL 5×SDS上樣緩沖液，105℃變性5 min，用于后續(xù)SDS-PAGE分析蛋白的表達(dá)與表達(dá)方式。

1.4 鎳親和層析法純化Cap蛋白收集超聲裂解后的蛋白，10 000 r/min 4℃離心3 min，收集上清中的可溶性蛋白。以平衡液(50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，5%甘油，0.05%Tween 80)平衡Ni-NTA親和層析柱，將可溶性蛋白以0.3 mL/min流速，通過(guò)重力作用與Ni-NTA親和層析柱填料充分結(jié)合；再以洗滌液(20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑，5%甘油，0.05%Tween 80)徹底洗脫與Ni-NTA親和層析柱結(jié)合弱的雜蛋白；最后，以洗脫液(20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，5%甘油，0.05%Tween 80)對(duì)目的蛋白進(jìn)行洗脫，洗脫后利用透析的方式將β-巰基還原劑除去。樣品置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 可溶性蛋白Cap的 Western blot分析取純化后的蛋白上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分別命名為His-Cap和PCV2多抗-Cap。將電泳結(jié)束后的蛋白膠在半干轉(zhuǎn)膜儀上，23 V，30 min轉(zhuǎn)印至2張NC膜上，NC膜在4℃情況下用5%脫脂奶粉過(guò)夜封閉；封閉結(jié)束后分別以1∶1 000和1∶5 000的比例在含5%脫脂奶粉的PBST中加入PCV2多克隆抗體和HRP標(biāo)記的6*His，His-Tag小鼠單克隆抗體，室溫?fù)u床孵育1 h；孵育完畢用PBST洗膜5次，每次4 min;用潔凈的濾紙將His-Cap膜表面多余水分吸收，用DAB顯色試劑避光顯色2 min后，用蒸餾水沖洗，終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。PCV2多抗-Cap用含5%脫脂奶粉的PBST按1∶5 000的比例稀釋HRP標(biāo)記兔抗豬IgG抗體，室溫?fù)u床孵育1 h；PBST洗膜5次，每次5 min，隨后進(jìn)行顯色，觀察結(jié)果。

1.6 可溶性蛋白Cap VLP的透射電鏡觀察透射電鏡型號(hào)為JEM-1400，取經(jīng)鎳親和層析法純化后的蛋白懸液10 μL滴到銅網(wǎng)上，靜置10 min后，然后用濾紙的毛邊吸去多余的液體，滴上10 μL磷鎢酸負(fù)染色液，靜置2 min，用濾紙吸去負(fù)染色液，自然干燥后用于電鏡觀察。

1.7 疫苗的制備將形成VLP的蛋白懸液質(zhì)量濃度調(diào)整為0.5 g/L后，取100 μL VLP與100 μL弗氏佐劑等體積混勻，乳化。一免選用弗氏完全佐劑，二免選用弗氏不完全佐劑。配置好的疫苗置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.8 VLP免疫小鼠后抗體水平的測(cè)定將18只BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，每組6只。第1組為VLP組，第2組為PCV2滅活疫苗(ZJ/C株)，第3組為佐劑對(duì)照組。免疫方式為皮下多點(diǎn)注射，各組劑量為200 μL/只，VLP組含抗原50 μg，首次免疫后第2周加強(qiáng)免疫。免疫后第2周開(kāi)始每7 d尾部采血1次，直至第42天，及時(shí)分離血清，避免反復(fù)凍融，用于抗體的檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PCV2 ORF2基因與重組表達(dá)質(zhì)粒鑒定以臨床仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)發(fā)病豬中提取的DNA為模板，PCR擴(kuò)增出的基因片段大小為702 bp(圖1)，經(jīng)過(guò)測(cè)序比對(duì)證實(shí)獲得的基因?yàn)镻CV2 ORF2基因，隨后將目的基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化并交由生工生物(上海)有限公司進(jìn)行質(zhì)粒合成，不含終止密碼子，具體序列見(jiàn)圖2。

將合成的質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，在700 bp左右處有1條明顯的條帶，符合理論大小(圖1)。將雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒送至生工生物(上海)有限公司測(cè)序，結(jié)果與密碼子優(yōu)化后的序列完全相符。

M1.DL2000 DNA Marker；1.PCV2 ORF2基因(含終止密碼子)；2.陰性對(duì)照；M2.DL5000 DNA Marker;3.pET-32a-yCap BamHⅠ/HindⅢ酶切；4.pET-32a空載體BamHⅠ/HindⅢ酶切

2.2 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析將經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的重組菌體與誘導(dǎo)前作對(duì)比，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析如圖3所示，誘導(dǎo)后的重組菌pET-32a-Capb在47 kDa左右有明顯的條帶，與預(yù)期大小相符，證明成功表達(dá)了Cap蛋白。收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體沉淀，重懸沉淀后超聲裂解，分別對(duì)上清和沉淀進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示，絕大部分蛋白以可溶性方式存在，只有少許蛋白存在于包涵體中。

M.蛋白Marker(14～100 kDa);1.誘導(dǎo)后pET-32a載體蛋白；2.重組蛋白誘導(dǎo)前；3.重組蛋白誘導(dǎo)后；4.重組蛋白超聲沉淀；5.重組蛋白超聲上清

M.蛋白Marker(14～100 kDa);1.上樣流穿液；2～12.純化的Cap蛋白

2.3 鎳親和層法純化Cap蛋白重組菌表達(dá)的可溶性蛋白經(jīng)鎳親和層析純化后，得到了純度高、單一的目的蛋白。

2.4 可溶性蛋白Cap的Western blot分析將純化后的蛋白進(jìn)行Western blot鑒定。一抗為豬源多克隆抗體、二抗為HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG抗體；抗體為HRP標(biāo)記的6*His，His-Tag小鼠單克隆抗體。結(jié)果如圖5所示，在47 kDa處有1條明顯的特異性條帶，與預(yù)期大小符合。

1.一抗“豬源多克隆抗體”;2.二抗HRP標(biāo)記免抗豬IgG抗體；3.HRP標(biāo)記6*His;4.His-Tag小鼠單克隆抗體;M.蛋白Marker(14～100 kDa)

2.5 可溶性蛋白Cap VLP病毒樣顆粒的透射電鏡觀察取10 μL經(jīng)過(guò)磷鎢酸負(fù)染色后的蛋白懸液，在透射電鏡下放大20 000倍，可觀察到大小均一、形態(tài)規(guī)則，直徑在20 nm左右的病毒樣顆粒，與天然的豬圓環(huán)病毒粒子極為相似。由圖6可知，本研究中所制備的Cap蛋白能夠自發(fā)的組裝成VLP且形態(tài)結(jié)構(gòu)良好。

圖6 Cap蛋白自組裝成VLP的透射電鏡觀察(200 000×)

2.6 免疫后小鼠PCV2 IgG抗體水平的測(cè)定ELISA結(jié)果顯示，兩組疫苗在免疫后14 d時(shí)抗體均已達(dá)到臨界值且VLP組顯著高于滅活疫苗組(P<0.01)，免疫后42 d，VLP組抗體水平顯著高于滅活疫苗組(P<0.01)且仍維持在一個(gè)較高水平，VLP組誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平高于滅活疫苗組。為進(jìn)一步驗(yàn)證VLP刺激小鼠所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)類型和水平，本研究測(cè)定了免疫后14，28 d時(shí)，Th1型細(xì)胞因子IFN-γ,TNF-α和Th2型細(xì)胞因子IL-4的含量。結(jié)果顯示，在免疫后14，28 d時(shí)，VLP組所產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平均高于滅活疫苗組，具有顯著差異性(P<0.01)(圖7)。

圖7 免疫小鼠后PCV2 IgG抗體及細(xì)胞因子水平的測(cè)定

3 討論

PCV2分布廣泛，呈世界性流行，豬場(chǎng)一旦發(fā)生PCVAD，就會(huì)造成無(wú)法挽回的經(jīng)濟(jì)損失，接種疫苗是防控此病的重要措施[8]。VLP疫苗模仿了天然病毒粒子的整體結(jié)構(gòu)，但不含有病毒的基因組結(jié)構(gòu)；在抗原性上，保留了天然的抗原構(gòu)象，與其來(lái)源的病毒難以區(qū)分；在安全性上，它是絕對(duì)非傳染性和不可復(fù)制的，具有重要的優(yōu)勢(shì);VLP能激發(fā)機(jī)體強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫與體液免疫，適合作為同源病毒的疫苗[9]。

已有研究發(fā)現(xiàn)，PCV2 Cap蛋白可在大腸桿菌中組裝形成VLP，但需要將N端的核定位信號(hào)區(qū)進(jìn)行密碼子優(yōu)化或截短[10]。密碼子優(yōu)化可以顯著提高蛋白的表達(dá)水平，但過(guò)度優(yōu)化可能會(huì)導(dǎo)致表達(dá)速度過(guò)快，表達(dá)產(chǎn)物不能正確折疊和修飾而以無(wú)活性的包涵體形式表達(dá)，增加蛋白純化的難度。此外，由于PCV2衣殼蛋白可在體外自發(fā)組裝成VLP的特性，致使N端的His-Tag標(biāo)簽折疊到VLP內(nèi)部，常規(guī)的鎳親和層析純化法無(wú)法將其進(jìn)行純化[11]。雖然已有學(xué)者利用離子層析、凝膠過(guò)濾層析、CsCl密度梯度離心或多種方法相結(jié)合的方式純化PCV2 VLP，但提高了蛋白純化的成本，不適用獸用疫苗的生產(chǎn)[12]。因此，本研究嘗試將PCV2 ORF2完整的基因進(jìn)行密碼子全優(yōu)化，并在純化過(guò)程中添加β-巰基還原劑，以期探索出一種制備PCV2 VLP的簡(jiǎn)易方法。

本研究成功從臨床樣本中分離擴(kuò)增出PCV2 ORF2序列并將其全長(zhǎng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，獲得重組質(zhì)粒pET-32a-yCap，在大腸桿菌表達(dá)菌株BL21中實(shí)現(xiàn)了Cap蛋白的可溶性表達(dá)，并通過(guò)改良鎳親和層析法將目的蛋白成功純化，表明密碼子全優(yōu)化是一種制備PCV2 VLP的可行策略，β-巰基還原劑可成功抑制VLP的組裝。經(jīng)SDS-PAGE與Western blot鑒定，重組蛋白帶有His-Tag標(biāo)簽并具有良好的反應(yīng)原性，能與PCV2多克隆抗體和HRP標(biāo)記的6*His，His-Tag小鼠單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合。重組蛋白經(jīng)透射電鏡觀察，能在體外成功自發(fā)組裝成直徑17～20 nm的VLP。小鼠免疫試驗(yàn)顯示，重組Cap蛋白所組裝的VLP誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平強(qiáng)于PCV2滅活疫苗(ZJ/C株)。為研制出成本低廉、安全有效、效果穩(wěn)定的PCV2亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。