李政志，陳秋慧，楊晶涵，劉曉雅，嚴(yán) 蕊，陳穎鈺,2，陳 曦,2，郭愛(ài)珍,2，胡長(zhǎng)敏*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070)

牛乳腺炎是導(dǎo)致奶牛產(chǎn)業(yè)損失最為嚴(yán)重的疾病之一，凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase-negativeStaphylococci,CoNS)為最常見(jiàn)導(dǎo)致?；既橄傺椎牟≡鶾1]。該菌于1880年首次鑒定，因不產(chǎn)生凝固酶而得名。其最初命名為白色葡萄球菌[2]，后被劃分為非金黃色葡萄球菌(non-aureusstaphylococci,NAS)[3]。CoNS能引起奶牛持續(xù)性乳腺內(nèi)細(xì)菌感染(intramammary bacterial infection,IMI)，表現(xiàn)為體細(xì)胞計(jì)數(shù)增加和奶產(chǎn)量下降[4]。最初CoNS被認(rèn)為是無(wú)害的乳房定植菌[5]，然而在過(guò)去的20年中，CoNS 已成為全世界致奶牛乳腺炎的最常見(jiàn)病原，其中產(chǎn)色葡萄球菌(Staphylococcuschromogenes)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri)等為優(yōu)勢(shì)菌株。據(jù)報(bào)道，美國(guó)、歐洲等國(guó)家CoNS的分離率為27%～55%[4]；SONG等[6]對(duì)我國(guó)15個(gè)大型奶牛場(chǎng)的牛乳汁樣本進(jìn)行病原學(xué)調(diào)查，其中27.93%的乳腺炎乳汁樣品中分離出CoNS，高于金黃色葡萄球菌11.1%的分離率，成為分離比率最高的病原。

伴隨著養(yǎng)殖業(yè)集約化以及抗生素為大量使用，具有β-內(nèi)酰胺、氨基糖苷和四環(huán)素抗性的CoNS已成為導(dǎo)致奶牛乳腺炎的重要原因[7]。除此以外，CoNS還可以產(chǎn)生生物被膜(biofilm,BF)、腸毒素及溶血素等毒力因子，造成牛乳腺內(nèi)持續(xù)感染[8]。為更好地預(yù)防及控制牛 CoNS性乳腺炎，現(xiàn)從導(dǎo)致牛乳腺炎源CoNS的病原學(xué)、致病機(jī)理、耐藥機(jī)制、檢測(cè)方法及治療與預(yù)防相關(guān)技術(shù)進(jìn)行綜述，供同行參考。

1 牛乳腺炎源 CoNS的病原學(xué)

CoNS作為一種條件致病菌，主要定植于奶牛皮膚及黏膜表面，或存在于草料倉(cāng)、墊草等處，致病力不強(qiáng)。當(dāng)牛由于各種不利因素導(dǎo)致免疫力下降時(shí)，或者牛乳腺受到損傷及異物侵入等，CoNS進(jìn)入牛乳腺組織生長(zhǎng)繁殖，誘發(fā)臨床或隱性乳腺炎。

研究顯示，在牛場(chǎng)墊料等相關(guān)生活環(huán)境中，CoNS主要為木糖葡萄球菌、松鼠葡萄球菌和腐生葡萄球菌；而在牛乳頭皮膚上最常見(jiàn)的CoNS為溶血葡萄球菌；牛奶中最常見(jiàn)的CoNS為表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌及產(chǎn)色葡萄球菌；除此以外，產(chǎn)色葡萄球菌還可在奶牛乳頭管、陰道等部位定植。DEVLIEGHER等[9]研究發(fā)現(xiàn)，20%的小母牛至少有1個(gè)乳頭頂端存在產(chǎn)色葡萄球菌，其乳腺炎發(fā)病率隨年齡的增長(zhǎng)而增加。

除奶牛不同部位CoNS菌株存在差異外，從不同國(guó)家和地區(qū)分離出的牛乳腺炎源CoNS也存在差異，KIM等[10]從2013—2017年在韓國(guó)收集3 692份牛奶樣品分離得到311株CoNS，其中最主要的CoNS為產(chǎn)色葡萄球菌、模擬葡萄球菌及表皮葡萄球菌。據(jù)報(bào)道，近10年來(lái)我國(guó)從牛乳腺炎中分離出來(lái)的CoNS比例不斷上升，其中分離率最高的為產(chǎn)色葡萄球菌，其次為松鼠葡萄球菌和表皮葡萄球菌[11]。綜合已有文獻(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)階段全球主要流行的CoNS為產(chǎn)色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、模擬葡萄球菌及松鼠葡萄球菌等。

2 CoNS感染奶牛乳腺的機(jī)理

2.1 CoNS入侵乳腺組織與BF形成CoNS的乳腺感染擴(kuò)散過(guò)程可劃分為3個(gè)階段，其對(duì)乳腺組織細(xì)胞的黏附是乳腺感染的第1階段[12](圖1A)。CoNS進(jìn)入乳腺組織后首先自由移動(dòng)，隨后附著在乳腺細(xì)胞表面分裂，繁殖并形成需要細(xì)胞間黏附的多層細(xì)胞簇[13]，CoNS也可產(chǎn)生胞外多糖等物質(zhì)促進(jìn)聚集。部分CoNS產(chǎn)生黏連蛋白結(jié)合蛋白和纖連蛋白結(jié)合蛋白，促進(jìn)病原與宿主細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，增加細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附[14]。CoNS增殖、多個(gè)細(xì)菌組成聚集結(jié)構(gòu)及形成BF為乳腺感染的第2階段(圖1B)，CoNS可通過(guò)表面多糖連接[15]，如表皮葡萄球菌可產(chǎn)生細(xì)胞間多糖黏附素，促進(jìn)細(xì)菌聚集。在上述過(guò)程中許多CoNS產(chǎn)生糖萼(一種黏液層)，將其封閉在自生基質(zhì)中并附著于細(xì)菌表面[16]。糖萼也稱為BF，能夠保護(hù)細(xì)菌抵抗宿主的免疫清除。CoNS擴(kuò)散為感染的第3階段(圖1C)，擴(kuò)散的CoNS可以入侵血管或再黏附乳腺組織導(dǎo)致感染蔓延。LEWIS等[17]發(fā)現(xiàn)使用抗生素治療牛CoNS乳腺炎時(shí)，部分細(xì)菌在BF的保護(hù)下發(fā)生殘留，造成牛乳腺的反復(fù)感染。

A. 第1階段CoNS黏附乳腺上皮細(xì)胞;B.第2階段CoNS聚集增殖并形成生物膜;C.第3階段CoNS擴(kuò)散及再黏附

2.2 CoNS的毒力因子CoNS的主要毒力因子包括BF、腸毒素及溶血素等，不同CoNS的毒力因子存在差異[18]。BF是CoNS最重要的毒力因子，具有提高CoNS產(chǎn)生耐藥性與抵抗多種不利因素的能力，并使其在宿主內(nèi)自由增殖。腸毒素等熱源性毒素可形成超抗原，與主要組織相容性復(fù)合體 Ⅱ類分子結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和高水平細(xì)胞因子表達(dá)。CoNS能產(chǎn)生α、β和δ溶血素，溶解細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)容物外泄。NASAJ等[19]通過(guò)分析CoNS的表型與基因型，發(fā)現(xiàn)耐藥CoNS BF形成與溶血素相關(guān)。與金黃色葡萄球菌相似，CoNS的毒力基因也位于可移動(dòng)的遺傳元件上，這使得他們能夠獲得更多的外源基因，提高CoNS適應(yīng)能力[20-21]。ARGEMX等[22]通過(guò)鑒定幾種攜帶抗性基因并與金黃色葡萄球菌同源的質(zhì)粒，推測(cè)表皮葡萄球菌的一些可遺傳元件可能來(lái)自金黃色葡萄球菌，且存在毒力因子的轉(zhuǎn)移。

3 CoNS的耐藥表型與機(jī)制

3.1 CoNS的耐藥表型與金黃色葡萄球菌相比，CoNS更易獲得耐藥性[23]。由于內(nèi)酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素被廣泛用于治療CoNS感染，研究顯示全球范圍內(nèi)CoNS對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素，特別是青霉素和氨芐青霉素的耐藥性正在增加[24-25]。耐甲氧西林的 CoNS(methicillin resistant coagulase negativeStaphylococcus,MRCNS)從20世紀(jì)90年代出現(xiàn)，已迅速成為牛乳腺炎在內(nèi)的動(dòng)物感染性疾病治療的挑戰(zhàn)[26]，在南美洲國(guó)家中耐藥率高達(dá)70%～80%[27]。

調(diào)查顯示從患乳腺炎奶牛的乳汁中分離的CoNS其耐藥性不斷增加。歐洲耐青霉素CoNS的分離比例(29.1%)高于金黃色葡萄球菌的分離比例(25.1%)，其中表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌的mecA基因介導(dǎo)的甲氧西林耐藥率達(dá)43.9%[28]。在牛源性CoNS中，37.3%的分離株具有多重耐藥；而與人類密切相關(guān)的CoNS中，89.5%的分離株具有多重耐藥性[29]。除此以外，不同CoNS的耐藥率也表現(xiàn)出種屬差異，牛奶中表皮葡萄球菌的耐藥率高于其他種屬CoNS[10]。

3.2 CoNS的耐藥機(jī)制研究顯示CoNS耐藥機(jī)制與CoNS形成BF的能力，及其BF形成基因，如icaA、icaB、icaC、icaD、atlE和bhp相關(guān)[19]。根據(jù)CoNS基因組的特性，人源CoNS的抗生素抗性基因(antibiotic resistance gene,ARG)可作為ARG庫(kù)，促使ARG水平轉(zhuǎn)移到其他葡萄球菌中；牛乳腺炎源CoNS的ARG同樣也可能轉(zhuǎn)移到人葡萄球菌中。松鼠葡萄球菌是唯一擁有甲氧西林抗性基因mecC的CoNS，DHAOUADI等[30]首次從奶牛糞便樣本中分離出攜帶mecC基因的松鼠葡萄球菌，而另外一些來(lái)自人的樣本分離出的松鼠葡萄球菌也攜帶mecC基因，提示松鼠葡萄球菌mecC存在從牛向人類轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。

4 CoNS的檢測(cè)與鑒定

由于 CoNS缺乏特別的生理生化特征，沒(méi)有明確的分類依據(jù)，對(duì)CoNS的鑒定主要通過(guò)表型和基因型鑒定進(jìn)行。CoNS的分離培養(yǎng)影響因素多，耗時(shí)長(zhǎng)，因此對(duì)CoNS的鑒定大都基于其基因型特征，如16S DNA或Tuf基因測(cè)序等。研究表明，CoNS的表型與基因型鑒定并不完全一致[31]。DOSSANTOS等[32]對(duì)牛乳腺炎源產(chǎn)色葡萄球菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)1株能凝結(jié)血漿的產(chǎn)色葡萄球菌，這種特殊的表型可能導(dǎo)致該CoNS被錯(cuò)誤的識(shí)別為金黃色葡萄球菌。因此將CoNS的表型與基因型結(jié)合起來(lái)進(jìn)行鑒定，對(duì)于發(fā)現(xiàn)CoNS新特征及其進(jìn)化具有重要意義。此外基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜也可用來(lái)對(duì)CoNS進(jìn)行鑒定，研究顯示其在CoNS的鑒定方面與常規(guī)基因型鑒定準(zhǔn)確性相當(dāng)，且易于操作[33]。

5 奶牛 CoNS乳腺炎的治療

對(duì)于牛 CoNS乳腺炎的治療方法，首選仍是使用抗生素。大部分CoNS對(duì)于青霉素類藥物具有耐藥性，對(duì)四環(huán)素、克林霉素、恩諾沙星等非β-內(nèi)酰胺類藥物也存在不同程度的耐藥[34]，而CoNS對(duì)利奈唑胺、達(dá)托霉素、莫西沙星等新一代抗生素具有較高的敏感性[35]。在對(duì)奶牛CoNS乳腺炎開(kāi)展治療時(shí)，首先需選擇合適的抗菌藥物，并采用足夠的劑量，以及確保臨床癥狀消失后仍繼續(xù)使用一段時(shí)間藥物。在奶牛CoNS乳腺炎的治療過(guò)程中，應(yīng)避免對(duì)群體使用抗生素，減少細(xì)菌耐藥性及動(dòng)物性產(chǎn)品藥物殘留。除傳統(tǒng)抗生素以外，一些天然產(chǎn)物，如紫檀芪、白藜蘆醇等已被證實(shí)具有抗菌效果[36]，用于預(yù)防和治療奶牛CoNS乳腺炎。除此以外，一些新療法，如植物精油療法[37]、噬菌體療法[38]、納米顆粒療法[39]等為奶牛CoNS乳腺炎治療提供了更多方案。

6 奶牛 CoNS乳腺炎的預(yù)防

預(yù)防奶牛 CoNS乳腺炎的關(guān)鍵環(huán)節(jié)為阻斷CoNS傳播與入侵。根據(jù)奶牛養(yǎng)殖及生產(chǎn)特征，擠奶是奶牛乳腺組織最容易受到病原體入侵的環(huán)節(jié)，因此在擠奶過(guò)程中應(yīng)避免機(jī)械損傷，并積極做好擠奶前后奶牛乳房及擠奶機(jī)的消毒，對(duì)預(yù)防牛CoNS乳腺炎至關(guān)重要。

防止奶牛乳頭區(qū)域污染，在擠奶前后使用消毒劑對(duì)奶牛乳頭區(qū)域浸漬消毒，可有效減少奶牛CoNS乳腺炎的發(fā)生。消毒時(shí)需使用適宜濃度的消毒劑，避免微生物對(duì)消毒劑耐藥，或與其他類型消毒劑產(chǎn)生共同及交叉耐藥[40]。此外，嚴(yán)格飼養(yǎng)管理，減少飼養(yǎng)人員與牛群的不合理流動(dòng)，可有效避免耐藥CoNS的傳播。其他預(yù)防措施如合理設(shè)置牛群規(guī)模、采用優(yōu)質(zhì)飼料、強(qiáng)化飼養(yǎng)環(huán)境的消殺及保持飼養(yǎng)環(huán)境的干燥等。

7 展望

CoNS不僅是牛乳腺炎的主要病原，近年來(lái)也成為人類醫(yī)療系統(tǒng)中院內(nèi)感染的重要病原[23]。因此控制CoNS的感染不僅是獸醫(yī)學(xué)問(wèn)題，更是與人類生命健康及食品安全息息相關(guān)的重要問(wèn)題。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于CoNS感染導(dǎo)致牛乳腺炎的致病機(jī)理及高效防控措施相關(guān)研究較少，CoNS耐藥機(jī)制及其流行病學(xué)變遷亦值得深入探究。除此以外，CoNS致病性變化與人源超級(jí)耐藥CoNS是否存在關(guān)聯(lián)尚無(wú)答案?；贑oNS BF的結(jié)構(gòu)、功能特點(diǎn)及致病機(jī)制開(kāi)發(fā)特異性藥物以及疫苗，亦具有較大前景。