趙 瑩,尹丹陽,王 瑋,胡佳薇

(陜西省疾病預(yù)防控制中心,西安 710054)

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和生活水平的逐漸提高,人們對水產(chǎn)品的需求已不僅僅停留在其種類上,同時對其質(zhì)量和鮮活度也提出了更高的要求。為了使水產(chǎn)品?；畋ｕr,運(yùn)輸和暫養(yǎng)過程中開始廣泛使用漁用麻醉劑來降低水產(chǎn)品的代謝強(qiáng)度、抑制應(yīng)激反應(yīng),以減緩損傷,延長其存活時間。目前,在鮮活魚類的流通環(huán)節(jié)中常使用的漁用麻醉劑有三卡因、普魯卡因、利多卡因、丁香酚類化合物、二氧化碳、乙醚等。丁香酚類化合物屬于天然提取的植物性香料,常作為食品添加劑或化妝品的定香劑。同時,該類化合物對魚類有很強(qiáng)的麻醉作用,具有高效、價格低廉、在水產(chǎn)品體內(nèi)代謝快的優(yōu)點(diǎn)。雖然沒有充分的試驗數(shù)據(jù)證明丁香酚類化合物對人體具有致癌性,但毒理數(shù)據(jù)表明,其對肝細(xì)胞具有一定毒性,存在肝損傷的風(fēng)險。普魯卡因、利多卡因等常見的局部麻醉劑屬于神經(jīng)中樞阻滯藥品,根據(jù)中間鏈的不同,又可分為以普魯卡因為代表的苯甲酸酯類化合物和以利多卡因為代表的酰胺類化合物[1]。這些局部麻醉劑具有作用效果快、操作簡單的優(yōu)點(diǎn),但是過量攝入可能會引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性反應(yīng),如肌肉震顫、驚厥、昏迷、呼吸抑制等不良反應(yīng)[2]。三卡因是目前應(yīng)用最廣的漁用麻醉劑,具有易溶于水、麻醉效果快、對水產(chǎn)品無毒害性的特點(diǎn)[3-4]。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)三卡因在指定水產(chǎn)品的運(yùn)輸中使用,但需經(jīng)過21 d的停藥期才能投放市場銷售[5]。丙泊酚化學(xué)名為2,6-雙異丙基苯酚,常作為臨床靜脈麻醉劑,具有麻醉誘導(dǎo)起效快、可控性強(qiáng)且功能恢復(fù)完善等優(yōu)點(diǎn),過量使用會導(dǎo)致心衰及腎衰等[6]。丙泊酚作為一種新型的漁用麻醉劑雖然沒有被廣泛應(yīng)用,但已有文獻(xiàn)報道其在水產(chǎn)品中被檢出[7]。目前,大部分漁用麻醉劑的使用存在廣泛爭議,主要原因是麻醉劑殘留對人體的風(fēng)險危害還沒有完全明確,且國內(nèi)對各種麻醉劑的使用和殘留限量尚無明確的政策法規(guī)[8],缺乏有效的監(jiān)管和安全劑量的權(quán)威判定。

檢測漁用麻醉劑的主要方法有高效液相色譜法[9-10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-12]、氣相色譜法[13]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-15]等。但檢測對象局限于單一或有限種類,且方法檢出限較高,未見水產(chǎn)品中多種麻醉劑同時檢測的研究報道。本工作的檢測對象兼顧了傳統(tǒng)和新型麻醉劑,提出了氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)同時測定淡水魚中丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、順式-甲基異丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙?；惗∠惴?、丙泊酚、三卡因、苯佐卡因、利多卡因、普魯卡因、普莫卡因、丁卡因和布他卡因等14種麻醉劑殘留量的方法,以期為食用魚類產(chǎn)品的麻醉劑質(zhì)量安全監(jiān)管提供檢測參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

7890B-7000C型氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀;CPA225D型分析天平;TTL-DCⅡ型氮吹儀;SI-T256型渦旋振蕩器;TG16-WS型高速離心機(jī);SPE-24A型固相萃取裝置。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:準(zhǔn)確稱取適量的14種漁用麻醉劑標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.000 1 g),以甲醇為溶劑,配制成各自的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,于4℃冰箱避光密封保存;分別吸取一定量的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用丙酮稀釋,配制成質(zhì)量濃度為100.0 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,于4℃冰箱避光密封保存。使用時,用丙酮稀釋至所需質(zhì)量濃度。

內(nèi)標(biāo)溶液:準(zhǔn)確稱取5.0 mg丁香酚-d3標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解后定容至10 mL,配制成500 mg·L-1內(nèi)標(biāo)儲備溶液;再用丙酮稀釋,配制成5.00 mg·L-1內(nèi)標(biāo)溶液,于4℃冰箱避光密封保存。

14種漁用麻醉劑標(biāo)準(zhǔn)品和丁香酚-d3標(biāo)準(zhǔn)品的純度均不小于95%;其余試劑均為色譜純;試驗用水為去離子水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

HP-5MS UI毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);載氣為高純氦氣,流量1.0 mL·min-1;進(jìn)樣口溫度250℃;進(jìn)樣量1μL,不分流進(jìn)樣。柱升溫程序:初始溫度80℃;以6℃·min-1速率升溫至170℃,保持1 min;再以50℃·min-1速率升溫至220℃;最后以15℃·min-1速率升溫至270℃,保持4 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊離子(EI)源;離子源溫度230℃;離子化能量70 e V;溶劑延遲時間8 min;傳輸線溫度280℃;碰撞氣為高純氮?dú)?流量1.5 mL·min-1;猝滅氣為高純氦氣,流量2.25 mL·min-1;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式,其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

將淡水魚樣品清洗干凈,去除頭、骨、內(nèi)臟,取肌肉等可食部位絞碎,混合均勻,于-18℃以下冷凍保存,備用。準(zhǔn)確稱取混勻樣品2 g(精確至0.000 1 g)于50 mL聚丙烯離心管中,加入5.00 mg·L-1內(nèi)標(biāo)溶液100μL和水5 mL,渦旋混勻,使樣品完全浸潤,靜置30 min。精密加入乙腈10 mL,渦旋混勻,以500次·min-1速率劇烈振蕩10 min后,加入氯化鈉2 g鹽析分層,以8 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min。取5 mL上清液加載到PRi ME HLB柱上,收集流出液。取2 mL流出液于10 mL離心管中,加入50μL二甲基亞砜(DMSO),常溫下氮吹至近干,用1.0 mL丙酮復(fù)溶,振蕩30 s,再用0.22μm微孔濾膜過濾,濾液供GCMS/MS測定。根據(jù)保留時間和特征離子對定性,內(nèi)標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

試驗發(fā)現(xiàn),進(jìn)樣口溫度、進(jìn)樣方式等色譜條件對目標(biāo)物的峰形和靈敏度都有較大影響,主要表現(xiàn)為:進(jìn)樣口溫度過低,后出峰的丁卡因、普莫卡因和布他卡因等靈敏度降低;進(jìn)樣口溫度過高,前出峰的丁香酚類目標(biāo)物拖尾嚴(yán)重。當(dāng)進(jìn)樣口溫度為250℃,不分流進(jìn)樣時,各目標(biāo)物的峰形尖銳、對稱且柱流失較小,后出峰的丁卡因、普魯卡因和布他卡因的靈敏度較高。

試驗選用HP-5MS UI、INNO-WAX毛細(xì)管色譜柱對14種目標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明:INNO-WAX毛細(xì)管色譜柱對丙泊酚、甲基丁香酚的分離能力較差,三卡因、苯佐卡因的響應(yīng)值較低,普莫卡因、布他卡因在該色譜柱上較難出峰;而HP-5MS UI毛細(xì)管色譜柱能夠?qū)?4種目標(biāo)物較好分離,且各組分的響應(yīng)值較高。

綜上分析,試驗選擇進(jìn)樣口溫度為250℃,進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣,選用HP-5MS UI毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行分離。MRM模式下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖如圖1所示。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of the mixed standard solution

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

在選定的色譜條件下,對14種目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)進(jìn)行單桿全掃描(MS1 Scan)分析,得到每種物質(zhì)的總離子流色譜圖。依次選擇相對豐度較高的一級碎片為各目標(biāo)物的前級離子。在同樣的色譜條件下,選擇產(chǎn)物離子(Product Ion)掃描模式,設(shè)定適宜的碰撞電壓,使碰撞氣對目標(biāo)物的前級離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離,產(chǎn)生碎片離子,得到二級質(zhì)譜圖。依次選取3組豐度高且基質(zhì)干擾小的碎片離子與前級離子組成定量和定性離子對,選擇EI源和MRM模式,進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量,確保特征碎片離子產(chǎn)生的離子對強(qiáng)度達(dá)到最大。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3 凈化方法的選擇

水產(chǎn)品基質(zhì)復(fù)雜,需要對樣品進(jìn)行有效的凈化,以去除脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖類、有機(jī)酸等干擾物質(zhì),保證準(zhǔn)確定量的同時避免色譜柱和離子源的污染。常用的凈化方法主要有液液萃取法、分散固相萃取法和固相萃取法等。液液萃取法是將乙腈飽和的正己烷溶液直接加入到提取液中,利用目標(biāo)物和雜質(zhì)在兩相中重新分配的原理對基質(zhì)進(jìn)行除脂凈化。該方法能大大提高目標(biāo)物的回收率,但是對樣品中有機(jī)酸、糖類及其他極性較強(qiáng)的雜質(zhì)去除效果不好,上機(jī)檢測后雜質(zhì)峰明顯,對魚類基質(zhì)的凈化效果不理想。分散固相萃取法是使用Qu ECh ERS萃取包凈化樣品。雖然QuECh ERS已不再局限于果蔬中農(nóng)藥殘留的檢測,但檢測高脂肪和高油脂的動物性樣品時,需要對現(xiàn)有的QuECh ERS進(jìn)行改進(jìn)。這是因為市售成品萃取包中普遍采用的石墨化碳黑(GCB)對油脂類雜質(zhì)的凈化效果差,且GCB的吸附性較強(qiáng),目標(biāo)物不易洗脫,所以在試驗過程中需要根據(jù)待測樣品和目標(biāo)物的實際情況對C18吸附劑、N-丙基乙二胺(PSA)、GCB等吸附凈化材料及其配比進(jìn)行選擇和優(yōu)化。

常用的固相萃取法主要依靠硅膠柱、C18柱、HLB柱等實現(xiàn)樣品的凈化。使用硅膠柱等正相柱進(jìn)行固相萃取時,需在提取之后置換弱極性溶劑上樣,這不僅增加了前處理步驟,而且置換溶劑的氮吹過程易造成目標(biāo)物(如丁香酚類化合物,沸點(diǎn)較低)的損失。使用C18柱和HLB柱等反向柱進(jìn)行固相萃取時,需要活化、淋洗和洗脫等步驟,尤其C18柱不能干柱使用,在實際操作中更加繁瑣。與之相比,同為反向柱的PRiME HLB柱更具優(yōu)勢,使用通過式處理的方式,無需活化和平衡,提取液直接上柱,雜質(zhì)在柱上保留,目標(biāo)物直接通過,被收集于流出液中,簡化和加速了凈化過程。因此,試驗選擇PRiME HLB柱凈化樣品。

2.4 提取溶劑的選擇

提取液直接過柱后被收集,無需淋洗和洗脫條件的優(yōu)化,因此提取溶劑既要保證目標(biāo)物在提取步驟中的提取率,又要確保凈化過程中目標(biāo)物的回收率。常用80%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙腈溶液提取傳統(tǒng)水產(chǎn)品中的丁香酚類化合物[16]。在本方法中,為保證不同種類的麻醉劑過柱后均能獲得較好的回收率,考察了以乙腈和體積分?jǐn)?shù)分別為70%,80%,90%的乙腈溶液為提取溶劑時對各目標(biāo)物回收率的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 提取溶劑對14種麻醉劑回收率的影響Fig.2 Effect of the extract solvent on recovery of 14 anesthetics

結(jié)果表明:對于丁香酚類化合物,使用80%乙腈溶液的回收率比使用其他體積分?jǐn)?shù)的乙腈溶液要高,但是其他種類目標(biāo)物的回收率總體偏低;使用乙腈提取后,丁香酚類化合物的回收率雖然比使用80%乙腈溶液的偏低,但苯佐卡因、利多卡因、普莫卡因、普魯卡因、丁卡因和布他卡因等麻醉劑的回收率均有顯著提高,且14種麻醉劑的回收率均能達(dá)到85.0%以上,滿足同時檢測的需求。同時,用乙腈提取后,無需除水,更易氮吹濃縮,減少了后續(xù)步驟中目標(biāo)物的損失。因此,試驗選擇的提取溶劑為乙腈。

樣品經(jīng)乙腈提取凈化后,將乙腈置換成丙酮,便于上機(jī)檢測。在使用常規(guī)的氮吹方法對凈化液進(jìn)行濃縮時,發(fā)現(xiàn)丁香酚類化合物因沸點(diǎn)低、易氣化的原因,很容易造成損失,其回收率均小于60.0%,其中丁香酚和異丁香酚的回收率不足50.0%。為解決丁香酚類化合物損失問題,試驗選擇在凈化液中加入微量的DMSO。由于DMSO的沸點(diǎn)高,能與大多數(shù)有機(jī)溶劑互溶,且對丁香酚類化合物的溶解性好,通過微量的加入,可使其保留在DMSO中,減少了加熱氮吹過程中的氣化損失,有效提高了目標(biāo)物的回收率。

2.5 工作曲線、檢出限和測定下限

選取陰性樣品為空白基質(zhì),依次加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液,配制成各目標(biāo)物質(zhì)量濃度為0,0.005,0.010,0.020,0.040,0.060,0.080,0.100,0.200,0.400 mg·L-1,內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為0.100 mg·L-1的基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按照儀器工作條件進(jìn)行測定,以各目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的峰面積比為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。結(jié)果顯示:14種麻醉劑工作曲線的線性范圍為0.005～0.400 mg·L-1,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab.2 Linear regression equations and correlation coefficients

采用逐級稀釋空白基質(zhì)加標(biāo)溶液的方式,以信噪比(S/N)為3時對應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為檢出限,以S/N為10時對應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為測定下限,結(jié)果得14種麻醉劑的檢出限均為0.001 mg·kg-1,測定下限均為0.002 5 mg·kg-1。

2.6 精密度和回收試驗

在空白基質(zhì)中加入低、中、高等3個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和一定量的內(nèi)標(biāo)溶液,每個濃度水平平行處理6份,按照儀器工作條件進(jìn)行分析,計算各目標(biāo)物的日內(nèi)回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD);按照同樣的方法,連續(xù)6 d,每天制備低、中、高等3個濃度水平的空白加標(biāo)樣品,按照儀器工作條件進(jìn)行分析,計算各目標(biāo)物的日間回收率和測定值的RSD,結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

表3(續(xù))

結(jié)果顯示:14種目標(biāo)物的日內(nèi)回收率為78.2%～120%,測定值的RSD為1.6%～10%,日間回收率為75.3%～118%,測定值的RSD為1.3%～9.7%,表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度、精密度和重現(xiàn)性,滿足魚類樣品中麻醉劑殘留檢測分析的要求。

2.7 樣品分析

按照試驗方法對市售的草魚、黑魚、鮰魚、鯽魚、江團(tuán)、鯉魚、鰱魚、鱸魚、鱘魚等33份鮮活淡水魚樣品進(jìn)行分析,其中草魚樣品的總離子流色譜圖見圖3。

圖3 總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram

結(jié)果顯示,4份草魚、1份黑魚、1份鮰魚、2份鯽魚、1份江團(tuán)、3份鯉魚、2份鰱魚、1份鱸魚共15份樣品中檢出丁香酚,檢出率為45.5%,最低檢出量為0.013 6 mg·kg-1(草魚),最高檢出量為0.462 mg·kg-1(草魚),其余麻醉劑均未檢出。

本工作提出了通過式固相萃取-GC-MS/MS同時測定淡水魚中14種麻醉劑含量的方法。樣品經(jīng)乙腈提取后,使用通過式PRiME HLB柱凈化,在濃縮過程中加入微量DMSO,有效減少了目標(biāo)物的損失,提高了檢測的靈敏度。該方法具有雜質(zhì)干擾小、準(zhǔn)確度好、靈敏度高、方法簡便快捷等優(yōu)點(diǎn),各項技術(shù)指標(biāo)均能滿足日常檢測分析要求,適用于魚類樣品中多種麻醉劑殘留的同時檢測和快速確證。