信建豪,侯巧芝,王聰穎,張利娟,張 蒙

(黃河科技學院 醫(yī)學院,鄭州 450063)

同型半胱氨酸(Hcy)是甲硫氨酸代謝過程中形成的一種非必需的含巰基氨基酸,血液中Hcy濃度水平升高會引起血管功能障礙,導致動脈硬化、心腦血管等疾病[1-2]。目前臨床測定Hcy含量大多依賴于色譜-質(zhì)譜法和免疫分析法[3-5],但這些方法都涉及繁瑣的分析過程以及昂貴的試劑和儀器。分子印跡技術(shù)具有成本低、分析快速、選擇性好、毒性低且模板分子可回收利用等優(yōu)點[6-8],在分離檢測[9]、仿生傳感器[10]、食品安全[11]等領(lǐng)域顯示出強大的發(fā)展?jié)摿?。本課題組曾用制備的分子印跡聚合物微球分離血液中的Hcy,采用紫外分光光度法進行檢測,但其靈敏度未達到實際樣品的檢測要求[12]。因此,本工作在前期研究的基礎(chǔ)上,通過優(yōu)化工藝條件,制備了磁性分子印跡材料,用于吸附血液中的Hcy,然后選擇靈敏度高、成本低的熒光分光光度法測定Hcy的含量,以該方法代替免疫分析法,對診斷高Hcy血癥的相關(guān)疾病具有重要意義。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

L9型紫外-可見分光光度計;970CRT型熒光分光光度計;FA1004型電子分析天平;E30-H型電動攪拌器;Quanta FEG250型掃描電子顯微鏡(SEM)。

Hcy標準儲備溶液:1 000 mg·L-1,準確稱取DL-Hcy標準品0.1 g,用0.1%(質(zhì)量分數(shù),下同)氫氧化鈉溶液溶解后,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,定容。

乙二醇二甲基丙烯酸酯、3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷、硅酸四乙酯、α-甲基丙烯酸、N-(1-芘基)馬來酰亞胺標準品的純度均不小于97%;所用氨基酸標準品的純度均為98%;其余試劑均為分析純;試驗用水為蒸餾水。

1.2 試驗方法

1.2.1 Hcy納米磁性分子印跡材料的制備

精密稱取六水合三氯化鐵11.626 g和四水合二氯化亞鐵4.351 g于三頸燒瓶中,加入水200 mL,室溫下用電動攪拌器以600 r·min-1速率攪拌10 min后,加入氨水30 mL,充入氮氣,于62℃水浴加熱下攪拌180 min,得到褐色沉淀。用磁鐵吸附分離沉淀,再分別用水和乙醇多次洗滌,真空干燥后,得到Fe3O4納米磁芯。

精密稱取Fe3O4納米磁芯1.609 g,加入乙醇80 mL和水8 mL,超聲15 min,緩慢加入硅酸四乙酯4 mL和氨水5 mL,室溫下用電動攪拌器以400 r·min-1速率攪拌12 h,產(chǎn)物經(jīng)磁鐵分離,分別用2.5 mol·L-1鹽酸溶液和水洗除雜質(zhì),真空干燥,得到Fe3O4-＠SiO2顆粒。

精密稱取Fe3O4-＠SiO2顆粒1.003 g,加入甲苯200 mL和3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷20 mL,在氮氣氛圍下于70℃以400 r·min-1速率攪拌12 h,經(jīng)磁鐵分離后,用水多次洗滌,真空干燥,得到Fe3O4-＠SiO2-＠C＝C磁珠。

精密稱取Fe3O4-＠SiO2-＠C＝C磁珠0.507 g,α-甲基丙烯酸0.223 g和DL-Hcy標準品0.117 g于三頸燒瓶中,加入乙醇80 mL,于62℃水浴以600 r·min-1速率攪拌12 h,再加入乙二醇二甲基丙烯酸酯1.144 g和偶氮二異丁腈0.010 g,超聲15 min,在氮氣氛圍下繼續(xù)攪拌24 h。反應(yīng)結(jié)束后,用磁鐵分離產(chǎn)物,并真空干燥。

以0.1%氫氧化鈉溶液為洗脫液,對上述產(chǎn)物進行洗脫,每隔1 h洗脫一次,至洗脫液在213.5 nm處的吸光度接近0,真空干燥,即得Hcy納米磁性分子印跡材料。

1.2.2 Hcy納米磁性分子印跡材料的性能研究

精密量取2 mL Hcy標準儲備溶液于100 mL容量瓶中,加入磷酸鹽緩沖溶液(pH 3.0)10 mL和Hcy納米磁性分子印跡材料0.500 g,振蕩10 min,用水定容,測定體系在213.5 nm處的吸光度,以考察Hcy納米磁性分子印跡材料的吸附性能。采用磁鐵分離后,加入磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.0)10 mL和水90 mL,振蕩40 min,測定體系在213.5 nm處的吸光度,以考察Hcy納米磁性分子印跡材料的釋放性能。

1.2.3 樣品分析

精密量取血液樣品1 mL于10 mL容量瓶中,加入磷酸鹽緩沖溶液(pH 3.0)1 mL和二硫蘇糖醇2.0 mg,混勻,靜置5 min,用水定容,再加入Hcy納米磁性分子印跡材料0.100 g,振蕩10 min,磁分離后棄去溶液,接著加入磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.0)1 mL和水9 mL,振蕩40 min,磁分離后,在溶液中加入N-(1-芘基)馬來酰亞胺2.4 mg,靜置衍生10 min,以365 nm為激發(fā)波長,測定體系在378 nm處的熒光強度。

2 結(jié)果與討論

2.1 Hcy納米磁性分子印跡材料的SEM表征

采用SEM對制備的Hcy納米磁性分子印跡材料進行表征,結(jié)果見圖1。

圖1 SEM圖Fig.1 SEM diagram

由圖1可知,該材料粒徑約為40 nm。

2.2 Hcy納米磁性分子印跡材料的性能研究

2.2.1 吸附、釋放時間的選擇

按照1.2.2節(jié)試驗方法,繪制吸光度隨吸附、釋放時間變化的曲線,結(jié)果見圖2。

圖2 吸附、釋放時間對吸光度的影響Fig.2 Effects of the adsorption and release time on the absorbance

由圖2可知:該材料與Hcy混合振蕩10 min后,吸光度基本不變,即10 min時對Hcy的吸附達到平衡,因此選擇吸附時間為10 min;磁分離后,當振蕩釋放40 min時,吸光度基本不變,因此選擇釋放時間為40 min。與之前研究相比[13],吸附時間顯著縮短,可能是由于材料粒徑在納米級別,吸附速率較大。

2.2.2 吸附、釋放時酸度的選擇

按照1.2.2節(jié)試驗方法,考察了吸附時酸度對吸光度的影響,結(jié)果見圖3。

圖3 酸度對吸光度的影響Fig.3 Effect of the acidity on the absorbance

由圖3可知:當酸度為pH 3.0時,吸光度較小,說明此時Hcy磁性分子印跡材料的吸附量較大,因此選擇吸附時的酸度為pH 3.0;當酸度為pH 8.0時,吸光度較大,說明此時材料對Hcy的吸附量較小,便于釋放Hcy,因此選擇釋放時的酸度為pH 8.0。

2.2.3 Scatchard分析

根據(jù)Scatchard公式Q/ρ＝Qmax/KD-Q/KD(式中,Qmax為最大表觀吸附量,mg·g-1;KD為解離平衡常數(shù);Q為實際吸附量,mg·g-1;ρ為Hcy質(zhì)量濃度,g·L-1),以Q/ρ對Q進行擬合,結(jié)果得Q/ρ＝-0.034 21Q＋1.113,相關(guān)系數(shù)為0.996 4,則KD＝29.4,Qmax＝32.4 mg·g-1。

2.2.4 吸附選擇性試驗

將Hcy標準儲備溶液換成相同濃度水平的其他氨基酸的單標準溶液,按照1.2.2節(jié)試驗方法進行吸附?？疾炝斯泊娴某Ｒ姲被釋ξ降母蓴_情況。結(jié)果表明,該材料對Hcy的吸附量分別是L-半胱氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-丙氨酸、L-色氨酸、L-天冬氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺的19.3,23.8,31.6,243,213,31.7,39.7,33.4倍,并且振蕩吸附10 min時對Hcy吸附明顯,對其他8種氨基酸吸附可忽略。

2.2.5 使用次數(shù)的選擇

按照1.2.2節(jié)試驗方法分析Hcy磁性分子印跡材料使用1～8次時體系的吸光度,結(jié)果見圖4。

圖4 使用次數(shù)對吸光度的影響Fig.4 Effect of the using times on the absorbance

由圖4可知:該材料使用不超過4次時,吸附前后體系吸光度無明顯變化;使用超過4次時,吸附后體系吸光度開始逐漸增大,表明該材料最多可重復使用4次。

2.3 Hcy測定條件的選擇

2.3.1 熒光發(fā)射光譜圖

以365 nm為激發(fā)波長,繪制Hcy的熒光發(fā)射光譜圖,結(jié)果見圖5。

圖5 Hcy的熒光發(fā)射光譜圖Fig.5 Fluorescence emission spectrum of Hcy

由圖5可知,Hcy在波長387 nm處有特征發(fā)射峰,因此試驗測定體系在387 nm處的熒光強度。

2.3.2 酸度

分別用pH 7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,10.0的磷酸 鹽緩沖溶液配制6份0.04 mg·L-1Hcy標準溶液,各加入N-(1-芘基)馬來酰亞胺2.4 mg,考察了酸度對Hcy熒光強度的影響,結(jié)果見圖6。

由圖6可知:在pH 8.0時,Hcy熒光強度最大,pH低于或高于8.0時,Hcy熒光強度均會降低,結(jié)合Hcy釋放時酸度的選擇,最終確定測定Hcy時的體系酸度也為pH 8.0。

圖6 酸度對Hcy熒光強度的影響Fig.6 Effect of the acidity on the fluorescence intensity of Hcy

2.3.3 衍生時間

用磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.0)配制0.04 mg·L-1Hcy標準溶液,加入2.4 mgN-(1-芘基)馬來酰亞胺,在靜置衍生1,5,10,15,20 min時用熒光分光光度計測定,結(jié)果見圖7。

圖7 衍生時間對Hcy熒光強度的影響Fig.7 Effect of the derivative time on the fluorescence intensity of Hcy

由圖7可知,衍生反應(yīng)10 min后,體系熒光強度基本不變,因此選擇衍生時間為10 min。

2.4 標準曲線和檢出限

用磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.0)配制0.02,0.04,0.06,0.08,0.10 mg·L-1Hcy標準溶液系列,各加入2.4 mgN-(1-芘基)馬來酰亞胺,靜置衍生10 min,以體系在387 nm處的熒光強度對Hcy質(zhì)量濃度進行線性回歸。結(jié)果顯示,Hcy質(zhì)量濃度在0.02～0.10 mg·L-1內(nèi)與其對應(yīng)的熒光強度呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y＝3.559×104x＋2.538×103,相關(guān)系數(shù)為0.999 6。

對空白樣品溶液連續(xù)測定11次,以3倍標準偏差與稀釋因子的乘積計算檢出限,結(jié)果得檢出限為0.008 mg·L-1。

2.5 精密度和穩(wěn)定性試驗

按照試驗方法對0.04 mg·L-1Hcy標準溶液重復測定5次,計算測定值的相對標準偏差(RSD)。結(jié)果顯示,測定值的RSD為1.8%,表明該方法的精密度較好。

接著將0.04 mg·L-1Hcy標準溶液靜置衍生30,60,90,120,150,180 min,然后測定體系的熒光強度。結(jié)果得測定值的RSD為3.8%,表明Hcy在180 min內(nèi)較穩(wěn)定。

2.6 回收試驗

取5只成年家兔,用靜脈采血針取血,然后用血細胞過濾器過濾,按照1.2.3節(jié)試驗方法對兔血中Hcy含量進行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),兔血中均未檢出Hcy。

對上述空白樣品進行加標回收試驗,計算回收率,結(jié)果見表1。

表1 回收試驗結(jié)果Tab.1 Results of test for recovery

由表1可知,Hcy的回收率為91.2%～109%,方法準確度滿足臨床分析的要求。

本工作提出了一種基于磁性分子印跡材料的熒光分光光度法測定血液中Hcy含量的方法。該方法分析快速、精密度和穩(wěn)定性好、準確度高,滿足臨床分析的要求,所制備的磁性分子印跡材料可替代臨床分析中常用的免疫物質(zhì),降低了檢測成本。