劉志榮,劉東升,張明童,謝 楠,李冬華

(甘肅省藥品檢驗研究院 甘肅省中藏藥檢驗檢測技術(shù)工程實驗室國家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點實驗室,蘭州 730070)

黑枸杞富含蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸、維生素、微量元素、花青素等大量人體所需的營養(yǎng)物質(zhì),是一種營養(yǎng)豐富的膳食材料[1],不僅具有極高的食用價值,而且具有一定的保健醫(yī)用價值。《晶珠本草》記載,黑枸杞果實對心臟病、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等疾病具有治療作用?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明,黑枸杞中的花青素具有抗氧化活性[2]。目前,黑枸杞短缺的野生資源已經(jīng)無法滿足市場需求。隨著人工種植的推廣,黑枸杞中農(nóng)藥殘留問題日益凸顯,引起食用群體的廣泛關(guān)注。國家標準GB 2763-2021《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定了各種食品中常見農(nóng)藥的殘留限量,但黑枸杞未收錄其中,也沒有相應(yīng)的檢測方法。另外,2020年版《中華人民共和國藥典》四部通則0212和2341分別規(guī)定了33種禁用農(nóng)藥的檢測方法和測定下限,但研究對象中也不含黑枸杞。因此,有必要建立黑枸杞中農(nóng)藥殘留的分析方法。

黑枸杞中的化學成分復(fù)雜,農(nóng)藥殘留分析容易受到基質(zhì)的干擾,因此減少基質(zhì)效應(yīng)(ME),進行基質(zhì)凈化是黑枸杞中農(nóng)藥殘留分析的關(guān)鍵。QuECh-ERS具有“綠色化學”以及操作簡便的特點,在許多國家和地區(qū)的農(nóng)業(yè)、食品、藥品質(zhì)量安全等領(lǐng)域應(yīng)用,并得到農(nóng)藥殘留分析者的廣泛關(guān)注[3-5]。文獻[6]用9種不同的QuEChERS吸附劑凈化當歸基質(zhì),采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLCMS/MS)考察了86種農(nóng)藥的回收率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)無石墨化碳黑(GCB)的Qu ECh ERS吸附劑對當歸基質(zhì)的凈化效果最佳。文獻[7]改進QuEChERS吸附劑構(gòu)成比例,結(jié)合UHPLC-MS/MS同時測定了甘草中86種農(nóng)藥殘留量。文獻[8]采用QuECh ERS凈化白芷基質(zhì),以UHPLC-MS/MS同時測定了白芷中50種農(nóng)藥殘留量。

本工作根據(jù)產(chǎn)地調(diào)研結(jié)果,選取了黑枸杞種植中經(jīng)常使用的46種農(nóng)藥為檢測指標,比較了不同組合的Qu ECh ERS吸附劑對黑枸杞基質(zhì)的凈化效果,結(jié)合UHPLC-MS/MS對黑枸杞中46種農(nóng)藥回收率進行考察,篩選出最有效的Qu ECh ERS吸附劑組合,并對12批黑枸杞樣品中46種農(nóng)藥殘留量進行測定。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

1290-6400型超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀;BSA224S型電子天平;TG16-W型高速離心機。

混合標準溶液:取適量的46種農(nóng)藥標準品,用丙酮配制成100.0 mg·L-1混合標準溶液,于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)標溶液:取適量的磷酸三苯酯標準品,用丙酮配制成100.0 mg·L-1內(nèi)標溶液,于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

46種農(nóng)藥標準品的純度均大于95%;磷酸三苯酯標準品的純度為99%;丙酮、乙腈、甲醇均為色譜純;試驗用水為純化水;N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)和GCB的粒徑均為40μm。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Eclipse Plus C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.8μm);柱溫40℃;流動相A為含10 mmol·L-1甲酸銨的0.1%(體積分數(shù),下同)甲酸溶液,B為乙腈;流量0.3 mL·min-1;進樣量5μL。梯度洗脫程序:0～0.2 min時,B為30%;0.2～10.0 min時,B由30%升至100%;10.0～11.0 min時,B由100%降至30%,保持3.0 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源,正、負離子掃描(ESI＋,ESI-);動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式;檢測窗時間2 min;干燥氣溫度350℃,干燥氣流量10 L·min-1;霧化器壓力310.3 k Pa;鞘氣溫度300℃,鞘氣流量10 L·min-1;毛細管電壓4.5 kV(ESI＋),4.0 kV(ESI-);噴嘴電壓500 V。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

表1(續(xù))

1.3 試驗方法

黑枸杞樣品冷凍干燥12 h,粉碎,過孔徑(250±9.9)μm的篩網(wǎng)。稱取5.00 g黑枸杞粉末至50 mL聚丙烯離心管中,精密加入100μg·L-1內(nèi)標溶液15μL和水5 mL,渦旋混勻,浸泡10 min,使樣品吸水完全溶脹。然后加入含1%(體積分數(shù))乙酸的乙腈溶液10 mL,劇烈渦旋2 min,使樣品完全浸潤。接著加入無水硫酸鎂4.0 g和氯化鈉1.0 g于上述離心管中,立即搖散,防止結(jié)塊,劇烈振蕩3 min,以轉(zhuǎn)速5 000 r·min-1離心5 min。將上清液全部轉(zhuǎn)移至預(yù)先裝有1.0 g無水硫酸鎂的15 mL聚丙烯離心管中,劇烈振蕩2 min,以轉(zhuǎn)速5 000 r·min-1離心5 min。精密量取上清液2 mL于裝有PSA 20 mg、C1820 mg和GCB 25 mg的5 mL聚丙烯離心管中,劇烈振蕩2 min,以轉(zhuǎn)速8 000 r·min-1離心5 min,取上清液待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)課題組先前的工作[7,9],考察了不同流動相體系和梯度洗脫程序?qū)?6種農(nóng)藥分離效果的影響。結(jié)果表明:大多數(shù)農(nóng)藥在流動相體系為0.1%甲酸溶液-乙腈時的峰形較0.1%甲酸溶液-甲醇時的好,但是部分農(nóng)藥響應(yīng)值較低;以含10 mmol·L-1甲酸銨的0.1%甲酸溶液-乙腈為流動相體系進行梯度洗脫時,46種農(nóng)藥分離效果較佳,大多數(shù)目標物色譜峰峰形較好,響應(yīng)值較高。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

為了提高檢測靈敏度,保證46種農(nóng)藥均具有較高的響應(yīng)強度,選擇以響應(yīng)強度最低的甲基對硫磷為指標優(yōu)化質(zhì)譜條件。結(jié)果表明,當干燥氣溫度為350℃,鞘氣溫度為300℃時,甲基對硫磷的響應(yīng)強度較高,此時對其他目標物的定量影響不大。優(yōu)化后的其他質(zhì)譜條件見1.2.2節(jié),46種農(nóng)藥的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 46種農(nóng)藥的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of 46 pesticides

2.3 QuEChERS吸附劑的優(yōu)化

試驗考察了不同組合的Qu ECh ERS吸附劑(C1820 mg＋PSA 20 mg、C1820 mg＋PSA 20 mg＋GCB 10 mg、C1820 mg＋PSA 20 mg＋GCB 15 mg、C1820 mg＋PSA 20 mg＋GCB 25 mg、C1820 mg＋PSA 20 mg＋GCB 35 mg)對空白加標樣品中46種農(nóng)藥的回收率和測定值的相對標準偏差(RSD,n＝6)的影響。

結(jié)果顯示:當C18和PSA用量均為20 mg時,46種農(nóng)藥的回收率為45.4%～110%,測定值的RSD為3.2%～21%,回收率滿足70.0%～120%要求的農(nóng)藥占43.5%,說明該組合Qu ECh ERS吸附劑的凈化效果不佳,不能有效避免基質(zhì)干擾。黑枸杞乙腈提取液呈紫黑色,色素含量較高,為有效去除這些色素,通過添加一定量的GCB,可達到減少色素干擾的目的。隨著GCB用量的增加,46種農(nóng)藥的回收率范圍逐漸縮窄;當GCB用量增加到25 mg時,回收率為47.5%～125%,測定值的RSD均小于17%,回收率在70.0%～120%內(nèi)的農(nóng)藥增加至87.0%,此時大多數(shù)目標物不受基質(zhì)干擾影響,凈化效果較好。因此,試驗選擇以PSA 20 mg＋C1820 mg＋GCB 25 mg為QuEChERS吸附劑。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

在痕量分析中,ME對分析結(jié)果的準確度和精密度影響顯著。為進一步研究Qu ECh ERS吸附劑減少ME的性能,以空白樣品為基質(zhì),分別用溶劑乙腈、未經(jīng)QuECh ERS凈化的基質(zhì)匹配溶液和經(jīng)QuEChERS凈化的基質(zhì)匹配溶液配制質(zhì)量濃度為5.0,10.0,20.0,50.0,100.0μg·L-1的混合標準溶液系列(其中內(nèi)標質(zhì)量濃度為15.0μg·L-1),按照儀器工作條件進行測定,根據(jù)公式(1)計算ME值[10],結(jié)果見表2。

式中:k1為溶劑標準曲線的斜率;k2為基質(zhì)匹配溶液標準曲線的斜率。

由表2可看出,未凈化的樣品中46種農(nóng)藥的ME值為-98.2%～159%,凈化后的ME值為-48.4%～39.5%,并且大部分目標物的ME值均在可接受范圍內(nèi)(-20%～20%)[9],說明所選的QuEChERS吸附劑可以較好地凈化黑枸杞樣品。

表2 ME值Tab.2 ME Values

2.5 標準曲線、檢出限和測定下限

按照2.4節(jié)中的方法配制質(zhì)量濃度為3.0,5.0,10.0,20.0,50.0,100.0,300.0μg·L-1的 經(jīng)QuECh-ERS凈化的基質(zhì)匹配混合標準溶液系列(其中內(nèi)標質(zhì)量濃度為15.0μg·L-1),按照儀器工作條件進行分析。以各目標化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標,對應(yīng)的峰面積與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標繪制工作曲線。結(jié)果顯示,46種農(nóng)藥工作曲線的線性范圍為3.0～300.0μg·L-1(相 當 于6.0～600.0μg·kg-1),線性參數(shù)見表3。

分別以信噪比為3和10時對應(yīng)的質(zhì)量分數(shù)為檢出限和測定下限,結(jié)果見表3。

表3 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.3 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.6 精密度和回收試驗

按照試驗方法對空白樣品進行3個濃度水平的加標回收試驗,計算回收率和測定值的RSD,結(jié)果見表4。

表4(續(xù))

由表4可知,46種農(nóng)藥的回收率為47.5%～129%,測定值的RSD為3.0%～17%,基本符合準確度和精密度的分析要求[11]。PSA中的氨基對黑枸杞基質(zhì)中的酸性物質(zhì)有較好的吸附效果,但同時也會吸附部分酸性農(nóng)藥,如甲胺磷、氧化樂果、地蟲硫磷、治螟磷;并且GCB吸附色素干擾物的同時,也會吸附部分與GCB具有相似平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥,如多菌靈、地蟲硫磷。因此,甲胺磷、氧化樂果、多菌靈、地蟲硫磷和治螟磷的回收率較低。

2.7 樣品分析

按照試驗方法分析12批黑枸杞樣品,每個樣品重復(fù)分析兩次,結(jié)果見表5。

表5 樣品分析結(jié)果Tab.5 Analytical results of the samples μg·kg-1

結(jié)果顯示,6批黑枸杞樣品中共13種目標物被檢出,其余目標物均未檢出。參考GB 2763-2021,除克百威外,其余農(nóng)藥的檢出量均低于殘留限量。GB 2763-2021規(guī)定藥用植物中克百威的殘留限量為20μg·kg-1,樣品S3中克百威檢出量高于殘留限量,表明黑枸杞存在克百威殘留超標的安全隱患。

本工作通過優(yōu)化QuECh ERS吸附劑配比,提出了UHPLC-MS/MS測定黑枸杞中46種農(nóng)藥殘留量的方法。該方法回收率較高、精密度較好,為黑枸杞中多農(nóng)藥殘留的測定提供了技術(shù)參考。