張林亞，徐然，周旭，楊文震，朱為

1. 上海生物制品研究所有限責(zé)任公司研發(fā)部第三研究室，上海 200051； 2. 上海生物制品研究所有限責(zé)任公司，上海 201400

麻疹是由麻疹病毒(measles virus，MV)引起的一種急性呼吸道傳染性疾病，通過呼吸道分泌物傳播，好發(fā)于兒童，多見于冬春季，人群普遍易感。2019年，全球麻疹病例激增至 869 770 例，創(chuàng)23年來最高紀(jì)錄；死亡人數(shù)超過 207 500 例，較2016年上升了50%[1]。預(yù)防麻疹的最有效手段是接種麻疹減毒活疫苗，而麻疹減毒活疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)為原代雞胚細(xì)胞。2020年版《中華人民共和國藥典》(三部)規(guī)定，原代細(xì)胞經(jīng)原始培養(yǎng)或傳代少數(shù)幾代內(nèi)(一般不超過5代)的細(xì)胞可用于病毒性疫苗的生產(chǎn)[2]。原代雞胚細(xì)胞在原代培養(yǎng)及早期傳代培養(yǎng)過程中成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞同時(shí)出現(xiàn)，利用成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞對胰蛋白酶的耐受性差異，將原代雞胚細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，可達(dá)到純化成纖維細(xì)胞的目的，提高疫苗用細(xì)胞基質(zhì)的均一性[3]。另外，將原代雞胚細(xì)胞進(jìn)行傳代可增加細(xì)胞外源因子的檢測次數(shù)，提高外源病毒的檢出率[4]，有利于實(shí)現(xiàn)對疫苗安全性的控制。

本研究將原代雞胚細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，采用不同代次雞胚細(xì)胞培養(yǎng)麻疹病毒滬191(Shanghai-191，S-191)株，并對病毒收獲物進(jìn)行滴度檢測和基因序列測定，為傳代培養(yǎng)的雞胚細(xì)胞用于病毒性疫苗生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞MRC-5細(xì)胞(人胚肺成纖維細(xì)胞)購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)，A549細(xì)胞(人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞)由上海生物制品研究所有限責(zé)任公司保存。

1.1.2 毒種麻疹病毒S-191株由上海生物制品研究所有限責(zé)任公司第三研究室保存。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)雞胚蛋購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2014-002；4～6周齡BALB/c雌性裸鼠購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2014-0016。

1.1.4 主要試劑及儀器M199培養(yǎng)液、青-鏈霉素、臺(tái)盼藍(lán)和0.25%胰蛋白酶均購自Gibco公司(美國)；新生牛血清購自上?；廴松锟萍脊こ萄芯克粴W氏液由上海生物制品研究所有限責(zé)任公司提供；0.1%苯扎溴銨購自上海運(yùn)佳黃浦制藥有限公司；RNA抽提試劑盒MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0及反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScriptTMII 1 st Strand cDNA Synthesis Kit購自TaKaRa公司(日本)。Countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自上海睿鈺生物科技有限公司；聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀購自Eppendorf公司(德國)。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng)取9～11日齡SPF級(jí)雞胚蛋，用0.1%苯扎溴銨消毒后，取出雞胚，斷頸去頭，刮除內(nèi)臟，收獲軀干部，用胰蛋白酶消化，制備成細(xì)胞懸液，接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37 ℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 傳代培養(yǎng)待原代雞胚細(xì)胞長至致密單層，用胰蛋白酶消化分散，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將原代細(xì)胞代次記為P0，傳代1次后記為P1，依此類推。P0傳代比率為1∶4，P1～P9傳代比率為 1∶2。用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定3批次傳代培養(yǎng)細(xì)胞的收獲數(shù)量，計(jì)算群體倍增水平(population doubling level，PDL)。

1.2.3 細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)分別將P3、P5和P10共3個(gè)代次的雞胚細(xì)胞密度調(diào)整至(2.0±0.5)×105個(gè)/mL，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每隔24 h取樣并計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.4 細(xì)胞凍存及復(fù)蘇后傳代P1代次雞胚細(xì)胞長至致密單層后，收獲P1代次細(xì)胞并凍存，采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法測定細(xì)胞凍存前及復(fù)蘇后的活率，并將復(fù)蘇后的細(xì)胞按照1∶2的傳代比率進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定各代次細(xì)胞的收獲數(shù)量，計(jì)算PDL。

1.2.5 細(xì)胞染色體檢查參照2020年版《中華人民共和國藥典》(三部)中關(guān)于染色體檢查的要求，采用G顯帶技術(shù)，對P5代次雞胚細(xì)胞進(jìn)行染色體檢查和核型分析。

1.2.6 細(xì)胞成瘤性檢查參照2020年版《中華人民共和國藥典》(三部)中關(guān)于成瘤性檢查的要求，用4～6周齡BALB/c雌性裸鼠對P8代次雞胚細(xì)胞進(jìn)行成瘤性檢查。同時(shí)設(shè)立A549細(xì)胞作為陽性對照，MRC-5細(xì)胞作為陰性對照。

1.2.7 病毒培養(yǎng)將麻疹病毒S-191株毒種按照感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為0.02～0.2分別接種至P0、P3和P5代次雞胚細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，每隔24 h收獲病毒。采用半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)感染量(50% cell culture infective dose，CCID50)法檢測3批次病毒收獲液的滴度，繪制病毒增殖曲線，比較不同代次雞胚細(xì)胞的產(chǎn)毒水平。

1.2.8 病毒基因序列測定根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)建立的DNA序列數(shù)據(jù)庫GenBank中錄入的麻疹病毒S-191株(登錄號(hào)：FJ416067.1)的基因序列，分別針對編碼病毒核蛋白(nucleoprotein，N)的基因序列(位于108～1 685，共 1 578 bp)和血凝素蛋白(hemagglutinin，H)的基因序列(位于 7 271～9 124，共 1 854 bp)設(shè)計(jì)引物，引物序列如表1所示。對 P0、P3和P5代次雞胚細(xì)胞培養(yǎng)的麻疹病毒的N基因和H基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送至BioSune公司進(jìn)行Sanger法測序。

表1 N、H基因PCR擴(kuò)增及序列測定引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用配對 t 檢驗(yàn)進(jìn)行病毒滴度比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)

將 P0代次雞胚細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)至P10代次，在顯微鏡下觀察各代次的細(xì)胞形態(tài)。P0代次多數(shù)為成纖維狀細(xì)胞，混雜有少量上皮細(xì)胞及少部分因消化不完全形成的細(xì)胞團(tuán)塊(見圖1A)。經(jīng)過傳代篩選，細(xì)胞均一性趨于良好，形態(tài)飽滿、修長，呈紡錘狀整齊排列(見圖1B、1C)。

A: P0 chicken embryo cells. B: P5 chicken embryo cells. C: P10 chicken embryo cells.

2.2 細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)

將P3、P5和P10代次雞胚細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，每隔24 h計(jì)數(shù)，繪制生長曲線。3個(gè)代次的雞胚細(xì)胞生長趨勢相似，整體呈“S”形，第4天達(dá)到平臺(tái)期，平臺(tái)期的細(xì)胞數(shù)為(5.0～6.0)×105個(gè)/mL(見圖2)。

圖2 不同代次雞胚細(xì)胞生長曲線

2.3 細(xì)胞傳代培養(yǎng)

將P1代次雞胚細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)至P10代次，3 d左右可長至致密單層，各代次平均細(xì)胞收獲數(shù)量為(4.85±0.31)×105個(gè)/mL，平均PDL為0.98±0.05(見圖3)。

圖3 不同代次雞胚細(xì)胞的收獲數(shù)量和PDL

2.4 細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)

將P1代次雞胚細(xì)胞凍存，復(fù)蘇后進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)。臺(tái)盼藍(lán)拒染法測定細(xì)胞凍存前活率為93.76%～97.09%，復(fù)蘇后活率為91.56%～95.97%。復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)的各代次平均細(xì)胞收獲數(shù)量為(4.76±0.30)×105個(gè)/mL，平均PDL為0.96±0.07(見圖4)。

圖4 凍存復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)的雞胚細(xì)胞的收獲數(shù)量和PDL

2.5 細(xì)胞染色體檢查

采用G顯帶技術(shù)對P5代次雞胚細(xì)胞進(jìn)行染色體檢查，結(jié)果為正常染色體核型，染色體數(shù)目78條，包括9對大染色體和30對微小染色體，大染色體中未發(fā)現(xiàn)染色體缺失及多倍體等異常染色體(見圖5)。

圖5 P5代次雞胚細(xì)胞染色體核型

2.6 細(xì)胞成瘤性檢查

對P8代次雞胚細(xì)胞進(jìn)行成瘤性檢查，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組(P8代次雞胚細(xì)胞)注射部位組織病理切片正常，無腫瘤樣細(xì)胞。陽性對照組(A549細(xì)胞)于第7天注射部位全部出現(xiàn)結(jié)節(jié)，組織病理學(xué)檢查為腫瘤細(xì)胞。陰性對照組(MRC-5細(xì)胞)注射部位未見結(jié)節(jié)形成，組織病理學(xué)檢查無腫瘤樣細(xì)胞(見圖6)。

A: A549 cells. B: MRC-5 cells. C: Chicken embryo cells.

2.7 麻疹病毒在不同代次雞胚細(xì)胞中的增殖

將麻疹病毒S-191株毒種分別接種P0、P3和P5代次雞胚細(xì)胞，測定病毒收獲液滴度，結(jié)果顯示病毒在3個(gè)代次雞胚細(xì)胞中的增殖趨勢相似(見圖7)。P0代次雞胚細(xì)胞病毒收獲液滴度為(5.87±0.21)lgCCID50/mL；P3代次雞胚細(xì)胞病毒收獲液滴度為(6.03±0.15)lgCCID50/mL，高于P0代次雞胚細(xì)胞，但無顯著性差異(P>0.05)；P5代次雞胚細(xì)胞病毒收獲液滴度為(6.00±0.10)lgCCID50/mL，高于P0代次雞胚細(xì)胞，但無顯著性差異(P>0.05)(見圖8)。

圖7 麻疹病毒在不同代次雞胚細(xì)胞中的增殖曲線

圖8 麻疹病毒在不同代次雞胚細(xì)胞中的產(chǎn)毒水平

2.8 麻疹病毒基因序列測定

對 P0、P3和P5代次雞胚細(xì)胞培養(yǎng)的麻疹病毒分別進(jìn)行N和H基因序列測定，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示條帶N1(900 bp)、N2(1 000 bp)、H1(1 000 bp)、H2(1 200 bp)與理論值N1(902 bp)、N2(995 bp)、H1(992 bp)、H2(1 179 bp)大小相符(見圖9、10)?；驕y序結(jié)果顯示，3個(gè)代次雞胚細(xì)胞培養(yǎng)的麻疹病毒N、H基因序列與S-191株毒種完全一致，未發(fā)生變異。

圖9 麻疹病毒N基因PCR產(chǎn)物電泳圖

圖10 麻疹病毒H基因PCR產(chǎn)物電泳圖

3 討論

原代雞胚細(xì)胞可用于多種病毒性疫苗的生產(chǎn)，如麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、狂犬病疫苗、黃熱病疫苗、新城疫疫苗、流感疫苗等[5-8]。原代雞胚細(xì)胞獲取容易，對病毒具有廣泛的敏感性，但其也存在固有缺點(diǎn)，如對供體動(dòng)物需求量大，成本高，制備耗時(shí)費(fèi)力，易污染外源病毒等。原代雞胚細(xì)胞傳代5代內(nèi)可用于病毒性疫苗的生產(chǎn)[2]。

本研究在雞胚細(xì)胞原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，建立了雞胚細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法，可將雞胚細(xì)胞穩(wěn)定傳至第10代，細(xì)胞均一性趨于良好，各代次細(xì)胞生長趨勢相似。將第1代雞胚細(xì)胞凍存復(fù)蘇后進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，可穩(wěn)定傳至第5代，初步為雞胚細(xì)胞建庫奠定了基礎(chǔ)。染色體檢查結(jié)果顯示，第5代雞胚細(xì)胞為正常染色體核型，染色體數(shù)目以及9對大染色體結(jié)構(gòu)保持不變，為傳代雞胚細(xì)胞用于疫苗生產(chǎn)提供了遺傳穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。但30對微小染色體過于微小，無法進(jìn)行染色體結(jié)構(gòu)分析。對傳代培養(yǎng)的第8代雞胚細(xì)胞進(jìn)行成瘤性檢查，未見成瘤，表明傳代雞胚細(xì)胞安全性良好。將麻疹病毒接種原代、第3代和第5代雞胚細(xì)胞，傳代培養(yǎng)的雞胚細(xì)胞與原代雞胚細(xì)胞的產(chǎn)毒水平無顯著性差異，收獲的病毒經(jīng)N、H基因測序，發(fā)現(xiàn)基因序列未發(fā)生改變，為傳代培養(yǎng)雞胚細(xì)胞替代原代雞胚或原代雞胚細(xì)胞生產(chǎn)其他病毒性疫苗提供了數(shù)據(jù)支撐。

與原代雞胚細(xì)胞生產(chǎn)病毒性疫苗相比，傳代培養(yǎng)的雞胚細(xì)胞具有明顯的優(yōu)勢。①節(jié)約原代雞胚的使用量，顯著提高了雞胚的利用率，降低生產(chǎn)成本和醫(yī)療廢棄物處理成本。如果使用傳至5代的雞胚細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量至少可擴(kuò)大30倍，可顯著提高雞胚的疫苗產(chǎn)量。②雞胚細(xì)胞經(jīng)過傳代培養(yǎng)，細(xì)胞均一性增加，可避免因來自不同動(dòng)物個(gè)體而造成的細(xì)胞質(zhì)量和敏感性差異[9]，從而提高了疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)的均一性和穩(wěn)定性。③采用傳代培養(yǎng)的雞胚細(xì)胞制備病毒性疫苗無須頻繁從雞胚中制備細(xì)胞，不僅可降低由細(xì)胞制備程序繁瑣費(fèi)時(shí)帶來的污染風(fēng)險(xiǎn)，還可降低雞胚本身可能帶來的潛在外源因子污染風(fēng)險(xiǎn)，從而提高了疫苗用細(xì)胞基質(zhì)的安全性。原代雞胚細(xì)胞來源于SPF級(jí)雞胚，其安全性與終產(chǎn)品的安全性密切相關(guān)。外源因子污染是影響細(xì)胞基質(zhì)安全性的一個(gè)重要因素，用于制備雞胚細(xì)胞的雞群須經(jīng)過廣泛的外源性因子檢測[10]。美國Charles River Laboratories International, Inc.(CRL)公司是全球 SPF 級(jí)雞和雞胚的最大供應(yīng)商，其監(jiān)測的病原微生物多達(dá)32種[11]，我國國家標(biāo)準(zhǔn)《SPF雞微生物學(xué)監(jiān)測總則(GB /T 17999. 1-2008)》中規(guī)定必須對19種病原體進(jìn)行監(jiān)測[12 ]。本研究對購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司的SPF級(jí)雞胚進(jìn)行了21種細(xì)菌和病毒檢測，包括禽流感病毒、馬立克病毒、新城疫病毒等。將雞胚細(xì)胞經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)，可增加外源因子的檢測次數(shù)，延長外源因子污染的觀察期，提高外源因子的檢出率，繼而降低外源因子污染細(xì)胞的概率，保證疫苗的安全性。

疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)需要大量檢定合格、質(zhì)量相同、持續(xù)穩(wěn)定的雞胚細(xì)胞，基于以上傳代培養(yǎng)的雞胚細(xì)胞生產(chǎn)病毒性疫苗的優(yōu)勢，傳代雞胚細(xì)胞比原代雞胚細(xì)胞更易實(shí)現(xiàn)疫苗的規(guī)?；a(chǎn)。因此，可考慮將原代雞胚細(xì)胞傳至5代內(nèi)建立細(xì)胞庫，按照2020年版《中華人民共和國藥典》(三部)中對細(xì)胞檢定項(xiàng)目的要求進(jìn)行檢定，檢定合格后與細(xì)胞工廠、微載體、片狀載體、固定床等大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)結(jié)合[13-14]，用于病毒性疫苗生產(chǎn)?？傊?，利用檢定合格的雞胚細(xì)胞庫和大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)疫苗，多批次的疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)來源于同一細(xì)胞庫，不僅可減少不同批次雞胚的細(xì)胞質(zhì)量差異，還可降低細(xì)胞外源因子污染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)可提高生產(chǎn)效率，為疫苗生產(chǎn)提供大量穩(wěn)定、均一、安全的細(xì)胞基質(zhì)，有利于提高疫苗產(chǎn)量與質(zhì)量。

然而，采用傳代雞胚細(xì)胞進(jìn)行病毒疫苗生產(chǎn)仍然面臨較多挑戰(zhàn)。①傳代雞胚細(xì)胞的安全性有待進(jìn)一步驗(yàn)證，將雞胚細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)后，其遺傳物質(zhì)是否會(huì)改變，宿主細(xì)胞殘留蛋白(host cell protein，HCP)、宿主細(xì)胞殘留DNA是否會(huì)因傳代增加，尚不清楚。②雞胚細(xì)胞在大規(guī)模培養(yǎng)的介質(zhì)中能否穩(wěn)定傳代，培養(yǎng)介質(zhì)的改變可能需要改變一系列培養(yǎng)條件才能滿足雞胚細(xì)胞的正常生長。如果細(xì)胞工廠通氣能力有限，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室中5% CO2的培養(yǎng)體系可能不再適用，須對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，研究出無需CO2環(huán)境的雞胚細(xì)胞培養(yǎng)方法。③采用傳代雞胚細(xì)胞生產(chǎn)其他病毒性疫苗，可能會(huì)對疫苗病毒的基因組和病毒的生物學(xué)特性產(chǎn)生影響。病毒能在雞胚細(xì)胞中增殖是因?yàn)榧?xì)胞上有病毒受體。Brandt等[15 ]研究發(fā)現(xiàn)，雞傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)超強(qiáng)毒株無雞胚成纖維細(xì)胞受體，在其傳代致弱過程中，VP2基因的幾處核苷酸改變導(dǎo)致其細(xì)胞嗜性改變，致弱后的毒株可在雞胚成纖維細(xì)胞中增殖，但致弱毒株與雞胚細(xì)胞如何作用及病毒的雞胚細(xì)胞受體還未見相關(guān)報(bào)道。雞胚細(xì)胞cDNA文庫的成功構(gòu)建，為篩選和研究雞胚成纖維細(xì)胞上的病毒受體及其細(xì)胞嗜性提供了理論基礎(chǔ)，也為研究其他適于雞胚細(xì)胞生長的病毒與雞胚細(xì)胞的相互作用奠定了基礎(chǔ)[16-17 ]。

本研究建立了原代雞胚細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法，傳代培養(yǎng)的第3、5代細(xì)胞擴(kuò)增麻疹病毒的能力與原代細(xì)胞無顯著差異，且未觀察到病毒N、H基因序列的變異。然而，采用傳代雞胚細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增生產(chǎn)仍面臨諸多挑戰(zhàn)，本文結(jié)論對于采用傳代培養(yǎng)雞胚細(xì)胞替代原代雞胚或原代雞胚細(xì)胞進(jìn)行病毒疫苗的擴(kuò)增生產(chǎn)具有重要的參考價(jià)值。