于淼，王敬開(kāi)，林愷鋮，劉風(fēng)翔，唐玉國(guó)，宋一之

1. 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院(蘇州)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部，江蘇 蘇州 215163； 2. 中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，江蘇 蘇州 215163

目前，隨著抗生素的廣泛和大量使用，耐藥菌不斷出現(xiàn)，人類(lèi)面臨著可選擇的抗生素種類(lèi)越來(lái)越少而治療成本和難度日益增加的困局。因此，快速準(zhǔn)確的病原體檢測(cè)和診斷至關(guān)重要，既能降低耐藥菌感染的死亡率，也能有效抑制耐藥菌的傳播。

常規(guī)的臨床病原微生物實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要通過(guò)生物化學(xué)反應(yīng)或飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)分離純化后的純培養(yǎng)病原菌進(jìn)行鑒定，采用抗菌藥物敏感性試驗(yàn)(antimicrobial susceptibility test，AST)在鑒定的基礎(chǔ)上觀察藥物作用后病原菌的生長(zhǎng)變化[1]。但培養(yǎng)、純化和飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定通常需2 d以上，AST通常需1～3 d， “ 從樣本到報(bào)告” 往往需3～7 d，極大地降低了檢測(cè)效率[2]。同時(shí)，還存在無(wú)法區(qū)分生物化學(xué)反應(yīng)相似的病原菌、數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知病原菌種類(lèi)有限以及難培養(yǎng)微生物難以鑒定等局限，為克服以上問(wèn)題，近年來(lái)多種免培養(yǎng)的微生物快速檢測(cè)技術(shù)得到了發(fā)展。

目前，免培養(yǎng)的微生物檢測(cè)方法主要為分子遺傳學(xué)鑒定法，如聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、基因測(cè)序、核酸質(zhì)譜法、生物芯片等，主要針對(duì)核酸等遺傳物質(zhì)。雖然這些方法各有優(yōu)勢(shì)，但存在易受外界條件干擾、檢測(cè)步驟復(fù)雜等弊端，操作過(guò)程中還需操作技能嫻熟、工作經(jīng)驗(yàn)豐富且理論知識(shí)扎實(shí)的操作人員以及昂貴且精密的儀器[3]。以PCR為例，其主要原理為擴(kuò)增待測(cè)微生物的DNA片段，然而隨著DNA的擴(kuò)增，其在獲得極大檢測(cè)靈敏度的同時(shí)也對(duì)檢測(cè)中的錯(cuò)誤有放大作用，因此操作稍有不當(dāng)或?qū)嶒?yàn)條件微擾或核酸提取中的隨機(jī)誤差，均可能造成假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果[4]。PCR針對(duì)不同的病原菌須設(shè)計(jì)不同的引物，也增加了檢測(cè)的難度和成本。此外，耐藥基因的分子診斷只能針對(duì)已知的耐藥機(jī)制及對(duì)應(yīng)基因，且陽(yáng)性耐藥基因不能與耐藥表型完全對(duì)應(yīng)。因此，亟須建立可普遍用于臨床的基于表型的病原菌診斷方法。

近年來(lái)，拉曼光譜技術(shù)不斷發(fā)展，開(kāi)始在病原微生物檢測(cè)領(lǐng)域嶄露頭角。拉曼光譜技術(shù)作為一種典型的分析化學(xué)方法，具有快速、高靈敏度、高特異度、無(wú)破壞性、不受水樣干擾等特點(diǎn)[5]。與常規(guī)檢測(cè)相比，拉曼光譜技術(shù)無(wú)須培養(yǎng)病原菌，從鑒定菌種到獲得AST結(jié)果僅需幾小時(shí)，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和診斷方面有著巨大的潛力。

1 單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)原理

1928年，印度科學(xué)家Raman發(fā)現(xiàn)了拉曼散射效應(yīng)，其對(duì)應(yīng)產(chǎn)生的光譜稱(chēng)為拉曼光譜[6]。當(dāng)物質(zhì)分子被入射光照射時(shí)，入射光子與分子發(fā)生相互作用，散射出不同頻率的光。大部分散射光頻率與入射光頻率相同，稱(chēng)為“瑞利散射”，極少數(shù)散射光頻率與入射光頻率不同，稱(chēng)為“拉曼散射”[7]。拉曼光譜是基于光與物質(zhì)內(nèi)化學(xué)鍵的相互作用而產(chǎn)生，表明了分子中特定鍵的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)，因此可根據(jù)散射光的特點(diǎn)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。

將拉曼光譜與顯微技術(shù)結(jié)合，能提供0.5～1 μm 空間分辨率的單個(gè)微生物細(xì)胞內(nèi)化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，其中包含核酸、蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、脂質(zhì)和色素(如類(lèi)胡蘿卜素)等信息[8-10]。每個(gè)細(xì)胞都有其特定的化學(xué)組成，因此這些信息被稱(chēng)為可鑒定細(xì)胞的獨(dú)特的“拉曼指紋圖譜”[11](見(jiàn)圖1)。由于拉曼光譜信號(hào)較弱，研究人員發(fā)明了多種拉曼增強(qiáng)技術(shù)，如共振拉曼散射(resonance Raman scattering，RRS)、相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-Stokes Raman scattering，CARS)、受激拉曼散射(stimulated Raman scattering，SRS)和表面增強(qiáng)拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering，SERS)。這些技術(shù)的出現(xiàn)使得單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)更加成熟，在感染檢測(cè)領(lǐng)域具有更大的潛力。

圖1 典型大腸埃希菌的拉曼圖譜

2 拉曼光譜在病原菌鑒定中的應(yīng)用

單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)可根據(jù)特異性“指紋圖譜”，對(duì)不同病原菌菌種甚至亞種進(jìn)行區(qū)分和鑒定，且具有非破壞性，細(xì)菌樣本還可用于其他研究分析(見(jiàn)表1)。與利用細(xì)菌“蛋白質(zhì)指紋”進(jìn)行鑒定的飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)相比，單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)對(duì)細(xì)菌的數(shù)量要求更低，且不要求樣品是純菌，因此不需要耗時(shí)的細(xì)菌培養(yǎng)步驟，可直接進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

2.1 革蘭陰性菌與革蘭陽(yáng)性菌的鑒別

在病原菌感染的診斷過(guò)程中，對(duì)革蘭細(xì)菌進(jìn)行分類(lèi)至關(guān)重要，可為后續(xù)診斷及抗生素的選擇提供參考。傳統(tǒng)的革蘭染色鑒定須進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，但細(xì)菌形態(tài)和過(guò)度脫色等問(wèn)題容易導(dǎo)致誤判。Paret 等[12]應(yīng)用類(lèi)胡蘿卜素的共振拉曼帶來(lái)區(qū)分幾種革蘭陰性菌和陽(yáng)性菌。Prucek 等[13]采用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)區(qū)分了2種革蘭陰性菌和2種革蘭陽(yáng)性菌。Oliveira等[10]采用代表肽聚糖的拉曼特征峰來(lái)進(jìn)行革蘭菌分類(lèi)，發(fā)現(xiàn)革蘭陽(yáng)性菌在540 cm-1和 1 380 cm-1的峰值明顯高于革蘭陰性菌，這2個(gè)峰值代表了N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine，NAG)和N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid，NAMA)，二者是肽聚糖的主要成分。Yi等[14]結(jié)合自發(fā)拉曼光譜與機(jī)器學(xué)習(xí)模型，建立了一個(gè)包含4株革蘭陰性菌和4株革蘭陽(yáng)性菌的拉曼譜庫(kù)，分類(lèi)準(zhǔn)確率達(dá)到100%，對(duì)真實(shí)血液和尿液標(biāo)本中未被數(shù)據(jù)庫(kù)覆蓋的菌種也實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確的革蘭菌分類(lèi)。

2.2 菌種和菌株水平的識(shí)別

Sundaram等[15]采用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)對(duì)2種革蘭陽(yáng)性菌和2種革蘭陰性菌進(jìn)行鑒別，發(fā)現(xiàn) 1 200～1 700 cm-1為識(shí)別4種細(xì)菌的指紋區(qū)域，準(zhǔn)確率為97%。Avci等[16]應(yīng)用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)對(duì)引起尿路感染的大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis，E.faecalis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus，S.saprophyticus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，K.pneumoniae)等7種病原菌進(jìn)行識(shí)別，在1 h內(nèi)成功獲得結(jié)果。Moawad 等[17]結(jié)合主成分分析(principal component analysis，PCA)與支持向量機(jī)(support vector machine，SVM)方法，成功區(qū)分了難區(qū)分的鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderiamallei，B.mallei)和類(lèi)鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderiapseudomallei，B.pseudomallei)，識(shí)別率高于90%。Lu等[18]采用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(convolutional neural networks，CNN)對(duì)14種細(xì)菌和真菌進(jìn)行了鑒定。

同種細(xì)菌之間光譜差異很小，因此菌株水平的識(shí)別難度更高。機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)的不斷發(fā)展，使其對(duì)光譜信息有了更準(zhǔn)確的分析。 Yuan等[19]對(duì)拉曼光譜進(jìn)行線(xiàn)性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)，成功區(qū)分了一類(lèi)導(dǎo)致腦膜炎的伊麗莎白金菌(Elizabethkingiaspp.)與其他常見(jiàn)革蘭陰性菌，且實(shí)現(xiàn)了不同來(lái)源伊麗莎白金菌的溯源。Walter 等[20]采用SVM算法處理細(xì)菌的表面增強(qiáng)拉曼光譜數(shù)據(jù)，成功區(qū)分了9種大腸埃希菌，準(zhǔn)確率為92%，實(shí)現(xiàn)了大腸埃希菌在菌株水平的識(shí)別。

2.3 臨床樣本中的細(xì)菌識(shí)別

直接識(shí)別體液中的細(xì)菌是拉曼光譜技術(shù)的一個(gè)重大進(jìn)步，加快了其在臨床應(yīng)用的步伐。近年來(lái)，大量研究者嘗試?yán)美庾V技術(shù)對(duì)臨床樣本進(jìn)行分析并開(kāi)展臨床轉(zhuǎn)化研究。Schr?der等[21]將拉曼光譜技術(shù)與雙電泳芯片結(jié)合，從尿液樣本中捕獲并采集細(xì)菌的拉曼光譜，成功識(shí)別了尿液中的大腸埃希菌和糞腸球菌。Premasiri 等[22]采用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)直接檢測(cè)尿液中的細(xì)菌，不到1 h 即成功識(shí)別了尿液中的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌等，敏感度為95.8%，特異度為99.3%。Liu等[23]在血液中用萬(wàn)古霉素涂層銀納米顆粒列陣捕獲細(xì)菌，進(jìn)而分離細(xì)菌和血細(xì)胞等其他雜質(zhì)，使細(xì)菌捕獲量增加了1 000倍，對(duì)人類(lèi)血液中細(xì)菌實(shí)現(xiàn)了免培養(yǎng)的分析和識(shí)別。表1對(duì)單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)在病原菌鑒定中的研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)。

3 單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)在AST中的應(yīng)用

AST可測(cè)定抗生素在體外對(duì)病原菌的抑制效果，并確定抗生素的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。目前，基于單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)的AST主要有2種，即非標(biāo)記拉曼光譜特征峰識(shí)別法和重水標(biāo)記拉曼技術(shù)(Raman-deuterium isotope probing，Raman-DIP)。

3.1 非標(biāo)記拉曼光譜特征峰識(shí)別法

抗生素作用于細(xì)菌時(shí)，會(huì)引起易感菌株內(nèi)部發(fā)生一系列生物化學(xué)反應(yīng)。因此，可通過(guò)觀察細(xì)菌某些特征峰峰值的變化，來(lái)判斷抗生素是否起作用及其療效，還可區(qū)分易感與耐藥菌株并確定MIC值。Uysal Ciloglu等[31]采用PCA、分級(jí)聚類(lèi)算法(hierarchical cluster analysis，HCA)、k最近鄰(k-nearest neighbor，KNN)算法等方法，分析了光譜極其相似的甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，準(zhǔn)確率達(dá)到97.8%。Ho等[26]采用深度學(xué)習(xí)方式中的CNN算法，成功區(qū)分了甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。Liu 等[33]發(fā)現(xiàn)，在抗生素作用期間，金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌位于730 cm-1和 1 095 cm-1的代表細(xì)胞壁成分的表面增強(qiáng)拉曼光譜特征峰，可用于區(qū)分易感與耐藥菌株。Liu等[34]發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌等在甲氧西林等抗生素的作用下，表面增強(qiáng)拉曼光譜中的特定生物標(biāo)記強(qiáng)度在2 h內(nèi)明顯下降，以此可對(duì)金黃色葡萄球菌和野生大腸埃希菌進(jìn)行AST并確定MIC值，所得結(jié)果與“金標(biāo)準(zhǔn)”方法一致。Kirchhoff 等[35]檢測(cè)從血液感染者血培養(yǎng)標(biāo)本中分離的大腸埃希菌，發(fā)現(xiàn)代表C—H振動(dòng)的 1 458 cm-1光譜峰峰值隨著環(huán)丙沙星濃度的增高而增高，而代表核酸的 1 485 cm-1峰值隨之降低，兩個(gè)振動(dòng)帶的強(qiáng)度比值反映了環(huán)丙沙星的抑菌效果，進(jìn)而可確定其MIC值。該方法不到2 h即完成了AST并確定了MIC值，所得結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法一致。以上通過(guò)觀察光譜特征峰變化的方法須針對(duì)不同種類(lèi)的細(xì)菌和抗生素進(jìn)行逐案評(píng)估，因此其在AST中的通用性尚待進(jìn)一步評(píng)估。

3.2 Raman-DIP

Berry等[36]首次報(bào)道了在含有重水(D2O)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)大腸埃希菌，僅20 min后于其單細(xì)胞拉曼光譜中檢測(cè)到碳-氘(C—D)峰(見(jiàn)圖1)，由此認(rèn)為C—D峰的出現(xiàn)完全是由細(xì)菌代謝引起的。細(xì)菌在含有重水的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，氘原子會(huì)參與細(xì)胞脂質(zhì)合成過(guò)程，形成C—D鍵替換原有的C—H鍵，新形成的C—D鍵的特征峰出現(xiàn)在2 000～2 300 cm-1區(qū)域，而該區(qū)域通常不存在其他標(biāo)志性峰，因此被稱(chēng)為靜默區(qū)?；诖隧?xiàng)研究，Song等學(xué)者提出了Raman-DIP方法，以C—D峰強(qiáng)度代表抗生素作用下的細(xì)菌代謝活性，并依此識(shí)別耐藥菌，從而判斷抗生素的敏感性[37-38]。由于細(xì)菌代謝不以細(xì)菌分裂增殖為先決條件，且單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)可在單細(xì)胞水平分析樣品的拉曼散射特征，因此可進(jìn)行免培養(yǎng)的AST。Song等[37]應(yīng)用Raman-DIP在數(shù)小時(shí)內(nèi)即成功識(shí)別了未培養(yǎng)的環(huán)境樣品中的抗生素敏感菌和耐藥菌。Tao等[38]將其用于識(shí)別口腔微生物變形鏈球菌(Streptococcusmutans，S.mutans)。Ueno等[39]用該方法發(fā)現(xiàn)，恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)耐藥菌在利福平的作用下表現(xiàn)出一定的代謝活性。Hong等[40]和Zhang等[41]將Raman-DIP與受激拉曼散射成像結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)活菌中的葡萄糖代謝來(lái)進(jìn)行AST，在一個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)就確定了耐萬(wàn)古霉素糞腸球菌的MIC值，并用于8種細(xì)菌和14種抗生素的檢測(cè)。Yi等[14]發(fā)現(xiàn)，將抗生素與重水在不同時(shí)間點(diǎn)加入菌液或標(biāo)本，可減小氨芐西林等抗生素對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和代謝活性抑制效果的差異，提高AST的準(zhǔn)確率，基于此建立了快速拉曼AST(fast Raman-assisted antibiotic susceptibility test, FRAST)方法，此法適用于38種抗生素。他們采用FRAST方法檢測(cè)了9份泌尿系統(tǒng)感染患者的尿液樣本和3份敗血癥患者的血液樣本，結(jié)果與常規(guī)自動(dòng)化藥敏結(jié)果一致，但將檢測(cè)時(shí)間分別縮短至3 h和21 h，進(jìn)一步證實(shí)了其在臨床應(yīng)用的可行性。Yuan等[19]在對(duì)伊麗莎白屬細(xì)菌的快速藥敏研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RAST方法可以對(duì)細(xì)菌濃度達(dá)到106CFU/mL以上的血液標(biāo)本直接進(jìn)行藥敏檢測(cè)。

4 結(jié)語(yǔ)

拉曼光譜技術(shù)在生物領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，尤其在病原微生物檢測(cè)方面優(yōu)點(diǎn)突出，可直接對(duì)細(xì)菌感染臨床樣品進(jìn)行非接觸快速檢測(cè)。相較于傳統(tǒng)方法，拉曼光譜技術(shù)具有無(wú)須制備樣品、無(wú)須進(jìn)行微生物培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)，是微生物感染的重要診斷方法。單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)將臨床標(biāo)準(zhǔn)藥敏檢測(cè)時(shí)間從48 h縮短至2.5 h內(nèi)，為臨床快速診斷與精準(zhǔn)選擇抗生素提供了依據(jù)，但其臨床應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)。首先，拉曼光譜技術(shù)與樣品前處理的結(jié)合至關(guān)重要。為了更高效地收集高密度的細(xì)菌，或分離出單細(xì)胞水平的細(xì)菌，其可結(jié)合微流控器件等方式，實(shí)現(xiàn)高通量、智能化的細(xì)菌細(xì)胞收集、分離和分選。其次，目前商業(yè)化飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)具有包含上萬(wàn)株菌株的數(shù)據(jù)庫(kù)，與其相比，利用拉曼光譜技術(shù)建立病原微生物物種的拉曼統(tǒng)一數(shù)據(jù)庫(kù)及其校準(zhǔn)方法已迫在眉睫。高質(zhì)量的數(shù)據(jù)庫(kù)可為后續(xù)數(shù)據(jù)處理提供豐富且準(zhǔn)確的信息，進(jìn)而提高辨識(shí)菌種的精確度。有些實(shí)驗(yàn)室已做出努力，建立了適合自己研究方向的小型數(shù)據(jù)庫(kù)，如鑒定多種分枝桿菌的數(shù)據(jù)庫(kù)[23]、快速檢測(cè)尿路感染(urinary tract infection，UTI)細(xì)菌的數(shù)據(jù)庫(kù)[27]等。然而，這些小型數(shù)據(jù)庫(kù)均是針對(duì)不同分析目的而特別制定的，且不同實(shí)驗(yàn)室拉曼光譜設(shè)備不同、參考樣本來(lái)源不同等因素，導(dǎo)致各譜庫(kù)之間有細(xì)微偏差。D?rfer等[42]應(yīng)用化學(xué)計(jì)量技術(shù)微調(diào)校準(zhǔn)參數(shù)和例程，進(jìn)而消除實(shí)驗(yàn)記錄的拉曼光譜中的設(shè)置差異，為拉曼譜庫(kù)的校準(zhǔn)做出了貢獻(xiàn)，也進(jìn)一步為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立提供了實(shí)踐基礎(chǔ)。

綜上所述，拉曼光譜技術(shù)在感染領(lǐng)域蘊(yùn)含著巨大潛力。盡管目前其在臨床應(yīng)用方面仍有較大的優(yōu)化空間，但相信在不久的將來(lái)，隨著操作進(jìn)一步規(guī)范化、器材更加便捷和智能化、數(shù)據(jù)處理技術(shù)達(dá)到更高的精確度，以及全病原微生物物種標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，于臨床廣泛應(yīng)用快速、靈敏、自動(dòng)化、智能化的拉曼光譜技術(shù)將成為可能，這項(xiàng)技術(shù)將為臨床感染領(lǐng)域帶來(lái)變革。