楊逸，劉洋名，魏亞鹿，張正越，秦金紅，蔡慕楓

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院2018級臨床醫(yī)學(xué)(五年制)五大班，上海 200025； 2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與微生物學(xué)系，上海 200025

外膜囊泡(outer membrane vesicle，OMV)是革蘭陰性菌在各種特殊刺激條件下分泌至細(xì)菌胞外、直徑為10 nm～400 nm的球狀脂質(zhì)雙層顆粒，其主要成分包括細(xì)菌蛋白、核酸、毒素等[1]。在革蘭陰性菌生長各階段均可見到OMV以不對稱的小泡或囊泡形式分泌至細(xì)菌表面及胞外環(huán)境中[2]，但其組成和種類可因細(xì)菌種類、菌株特征、培養(yǎng)條件以及細(xì)菌生長階段的不同而產(chǎn)生差異[3]。

一般認(rèn)為OMV起源于革蘭陰性菌的細(xì)胞膜，因此各種影響胞膜穩(wěn)定性的因素均可導(dǎo)致OMV分泌量增加[4]，如異常高溫或低溫、低pH值、缺氧環(huán)境、營養(yǎng)條件、抗生素等外界壓力，它們既可通過內(nèi)源性途徑激活細(xì)菌應(yīng)激反應(yīng)或前噬菌體而引起細(xì)胞膜穩(wěn)定性下降，也可直接破壞細(xì)胞膜成分，使OMV分泌量明顯增加[5]。在OMV產(chǎn)生過程中，革蘭陰性菌外膜成分，如脂質(zhì)、蛋白、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)以及胞質(zhì)內(nèi)的部分遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)，均可被包裝進(jìn)OMV，進(jìn)而發(fā)揮生理作用[6-7]。該過程的具體機(jī)制尚未明確，但其有助于革蘭陰性菌耐受惡劣環(huán)境。OMV可引起人體局部或全身慢性炎癥和細(xì)胞損傷，這可能是臨床使用抗生素治療革蘭陰性菌感染的不良反應(yīng)之一。

廣譜抗生素會破壞人體正常微生物群而導(dǎo)致微生態(tài)紊亂，從而引發(fā)一系列非感染性疾病，這已引起臨床醫(yī)師重視。人體微生物群特別是腸道微生物群暴露于抗生素后，除了一些人體正常的敏感性細(xì)菌被殺死而導(dǎo)致微生態(tài)失衡以外，大量細(xì)菌在抗生素作用下釋放OMV也可能是引起臨床非感染性疾病的主要因素之一。根據(jù)作用機(jī)制，抗生素可被分為3類：蛋白質(zhì)合成抑制劑、核酸合成抑制劑及作用于細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的抗生素。它們均可引起各種革蘭陰性菌分泌OMV，但分泌機(jī)制及類型不同，本文對此進(jìn)行綜述。

1 蛋白質(zhì)合成抑制劑類抗生素

氨基糖苷類、四環(huán)素類等抗生素主要與細(xì)菌核糖體結(jié)合，抑制其蛋白質(zhì)合成，進(jìn)而起到抑菌作用。它們可破壞革蘭陰性菌細(xì)胞壁中的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和細(xì)菌表面蛋白等結(jié)構(gòu)，促使OMV釋放。此類OMV可介導(dǎo)感染部位的慢性炎癥反應(yīng)、細(xì)菌耐藥及機(jī)體組織細(xì)胞損傷等。

1.1 氨基糖苷類抗生素與銅綠假單胞菌OMV介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)

慶大霉素是典型的氨基糖苷類抗生素，不僅可與細(xì)菌30S亞基結(jié)合，抑制其蛋白質(zhì)合成，還可替代Ca2+、Mg2+等陽離子結(jié)合到細(xì)菌外膜 LPS，改變LPS結(jié)構(gòu)，破壞外膜穩(wěn)定性，最終引起OMV釋放[8](見圖1AⅠ)。有研究表明，慶大霉素可使銅綠假單胞菌的OMV釋放量增加3～5倍[9]，但OMV引發(fā)慢性炎癥的機(jī)制尚未明確。有研究認(rèn)為，銅綠假單胞菌OMV中的鞭毛蛋白、亞硝酸鹽還原酶和LPS等可刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生以白細(xì)胞介素8(interleukin-8，IL-8)為主的趨化因子，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞募集和激活，從而引起感染部位的慢性炎癥[10](見圖1CⅠ)。但另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌OMV所含的短鏈RNA(short RNA，sRNA)能夠靶向宿主mRNA，抑制IL-8等細(xì)胞因子分泌和中性粒細(xì)胞浸潤，降低宿主對其的免疫應(yīng)答[11](見圖1CⅡ)。這兩種機(jī)制可能在銅綠假單胞菌感染所引起的慢性肺炎中發(fā)揮了綜合作用，有待進(jìn)一步研究。

銅綠假單胞菌OMV還可通過改變細(xì)菌生存環(huán)境引起機(jī)體慢性炎癥。其富含的各類蛋白酶可破壞宿主組織結(jié)構(gòu)，使細(xì)菌更牢固地黏附于宿主表面，形成生物膜，以便細(xì)菌生長繁殖[12](見圖1BⅠ)。此外，銅綠假單胞菌可通過OMV向環(huán)境中釋放自溶素， 裂解其他細(xì)菌(如大腸埃希菌)的肽聚糖(peptidoglycan，PG)層以發(fā)揮殺菌作用[13]。

A：3種不同類型抗生素引起OMV分泌的機(jī)制。Ⅰ：慶大霉素和多黏菌素破壞LPS，外膜穩(wěn)定性降低；Ⅱ：在環(huán)丙沙星作用下，細(xì)菌SOS機(jī)制激活，導(dǎo)致胞質(zhì)周圍間隙內(nèi)細(xì)菌代謝廢物局部積累，對外膜施加局部膨脹壓力；Ⅲ：青霉素作用于肽聚糖層，使肽聚糖與外膜之間的脂蛋白交聯(lián)局部減少。B：OMV在細(xì)胞外發(fā)揮生理作用的機(jī)制。Ⅰ：OMV中的蛋白酶可破壞宿主組織結(jié)構(gòu)，形成生物膜，以便于細(xì)菌生長繁殖；Ⅱ：OMV中的β-內(nèi)酰胺酶可分解環(huán)境中的青霉素，增強(qiáng)細(xì)菌群落對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性；Ⅲ：OMV可以極高的效率將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至其他革蘭陰性菌。C：OMV在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的機(jī)制。Ⅰ：OMV中的鞭毛蛋白、亞硝酸鹽還原酶、LPS和孔蛋白等可刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生IL-8等趨化因子，引起中性粒細(xì)胞募集和炎癥反應(yīng)；Ⅱ：OMV中的sRNA能夠靶向宿主mRNA，抑制IL-8等細(xì)胞因子分泌和中性粒細(xì)胞浸潤；Ⅲ：OMV中的外膜蛋白A和溶血素可損傷線粒體，最終引起細(xì)胞死亡；Ⅳ：OMV中的志賀毒素、細(xì)胞致死性膨脹毒素V可導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷，通過caspase-9途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Ⅴ：OMV刺激感染部位形成炎癥后，可導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞趨化及細(xì)胞免疫強(qiáng)烈激活。

1.2 四環(huán)素類抗生素與鮑曼不動(dòng)桿菌OMV的分泌及致病機(jī)制

依拉環(huán)素是一類新型含氟四環(huán)素類抗生素，適用于多重耐藥菌引起的嚴(yán)重感染。最近研究發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動(dòng)桿菌暴露于依拉環(huán)素后，其OMV分泌大量增加，且OMV的蛋白組成發(fā)生了改變，但其具體機(jī)制尚未明確[14]。諸多研究發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動(dòng)桿菌OMV的多種成分在其致病過程中起關(guān)鍵作用，其中外膜蛋白A(outer membrane protein A，OmpA)是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和細(xì)胞損傷的重要因素之一[15]。OmpA可激活宿主的GTPase動(dòng)力相關(guān)蛋白，引起線粒體斷裂、活性氧產(chǎn)生增加和細(xì)胞死亡[16](見圖1CⅢ)。除OmpA外，鮑曼不動(dòng)桿菌OMV的孔蛋白可使其在免疫和結(jié)締組織細(xì)胞中持續(xù)存在并產(chǎn)生細(xì)胞毒性[17]。OMV還可通過Toll 樣受體(Toll-like receptor，TLR)途徑介導(dǎo)肺部炎癥，引起在中性粒細(xì)胞聚集感染部位[18]。另有報(bào)道認(rèn)為，鮑曼不動(dòng)桿菌可通過OMV將自身的β-內(nèi)酰胺酶基因轉(zhuǎn)移至其他細(xì)菌(如大腸埃希菌或其他種類鮑曼不動(dòng)桿菌)，從而增加受體菌株對β-內(nèi)酰胺類抗生素的抗性[19]。

2 核酸合成抑制劑類抗生素

喹諾酮類、硝咪唑類、新生霉素等抗生素可抑制細(xì)菌DNA合成相關(guān)的酶，或直接損傷細(xì)菌DNA，從而發(fā)揮殺菌作用。此類抗生素可能還會激活細(xì)菌內(nèi)RecA依賴的SOS應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致OMV分泌增加及成分改變，造成嚴(yán)重的宿主細(xì)胞損傷或感染加重。

2.1 喹諾酮類抗生素與大腸埃希菌OMV介導(dǎo)的細(xì)胞毒性

環(huán)丙沙星是合成的第三代喹諾酮類藥物，具有廣譜抗菌活性，是目前臨床常用抗生素之一。但研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)丙沙星可刺激腸出血型大腸埃希菌(enterohemorrhagicEscherichiacoli，EHEC)、銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌等革蘭陰性菌分泌大量OMV。這可能是環(huán)丙沙星激活了細(xì)菌內(nèi)RecA依賴的SOS應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致受損或折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)等代謝廢物在胞質(zhì)周圍間隙中局部積累，并不斷對外膜施加局部膨脹壓力，最終外膜外凸形成OMV。其具體機(jī)制尚未明確，有待進(jìn)一步探討[20](見圖1AⅡ)。

EHEC在環(huán)丙沙星刺激下所分泌的OMV含有溶血素、志賀毒素、細(xì)胞致死性膨脹毒素V等致病因子，其中溶血素可損傷線粒體并破壞其膜電位(見圖1CⅢ)，而志賀毒素、細(xì)胞致死性膨脹毒素V可引起DNA損傷，通過caspase-9介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21](見圖1CⅣ)。環(huán)丙沙星對EHEC的刺激還上調(diào)了OMV中志賀毒素2a的水平，其隨OMV進(jìn)入血液循環(huán)后可引起溶血性尿毒癥綜合征和心功能不全等[22-23]。此外，大腸埃希菌OMV的外膜蛋白會誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞表達(dá)趨化因子CXCL1，促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞向肺組織遷移，介導(dǎo)急性肺損傷[24]。某些大腸埃希菌產(chǎn)生的OMV還能與環(huán)境中的多黏菌素類抗生素結(jié)合并將其降解，從而保護(hù)自身及菌群中的其他細(xì)菌[25]。甚至，某些抗生素的抗性基因可通過OMV轉(zhuǎn)移至其他種類大腸埃希菌中，而環(huán)丙沙星的刺激可顯著增強(qiáng)這一過程[26]。

除大腸埃希菌外，環(huán)丙沙星的刺激還可促使嗜麥芽窄食單胞菌分泌OMV，增加其細(xì)胞毒性和抗生素耐藥性[27]。

2.2 作用于DNA的抗生素與志賀菌OMV疫苗

絲裂霉素C(mitomycin C，MMC)可直接作用于細(xì)菌DNA，從而抑制細(xì)菌合成，但其對正常細(xì)胞也有較強(qiáng)的毒性，故一般不用于細(xì)菌感染的常規(guī)治療。與喹諾酮類抗生素相似，MMC在細(xì)菌內(nèi)可引發(fā)RecA依賴的SOS應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而激活細(xì)菌內(nèi)前噬菌體，通過編碼內(nèi)溶素破壞細(xì)菌PG層，從而降低外膜穩(wěn)定性，產(chǎn)生OMV[28-29]。研究發(fā)現(xiàn)，與喹諾酮類抗生素不同的是，經(jīng)MMC處理后，痢疾志賀菌的OMV釋放量和OMV中志賀毒素含量均顯著增加，但具體機(jī)制尚未明確[30]。

有趣的是，不同于其他革蘭陰性菌OMV的致病作用，志賀菌OMV在體內(nèi)更多地表現(xiàn)為保護(hù)性而非致病性。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過皮下注射、口服等多種途徑，OMV可刺激感染部位形成炎癥，導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞趨化及細(xì)胞免疫強(qiáng)烈激活，明顯增強(qiáng)了小鼠對福氏志賀菌的免疫力[31](見圖1CⅤ)。

3 作用于細(xì)菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的抗生素

常見的細(xì)胞壁合成抑制劑類抗生素包括β-內(nèi)酰胺類和糖肽類，細(xì)胞膜功能抑制劑類抗生素主要有多黏菌素類、多烯類及吡咯類。此類抗生素可直接破壞細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)或抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成，引起結(jié)構(gòu)異常，進(jìn)而導(dǎo)致OMV釋放。

3.1 β-內(nèi)酰胺類抗生素與嗜麥芽窄食單胞菌OMV建立的群落抗生素抗性

頭孢菌素和青霉素在臨床廣泛應(yīng)用，其通過與青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合干擾細(xì)菌合成PG，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)而發(fā)揮殺菌作用。與MMC激活細(xì)菌內(nèi)前噬菌體后前噬菌體編碼的內(nèi)溶素破壞細(xì)菌PG層不同，此類抗生素可直接干擾細(xì)菌PG的合成，使細(xì)菌PG層與外膜層的交聯(lián)減少，外膜相對過度延伸，進(jìn)而形成OMV[32](見圖1AⅢ)。諸多研究證實(shí)，亞致死濃度的β-內(nèi)酰胺類抗生素可誘導(dǎo)多種革蘭陰性菌(如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌、嗜麥芽窄食單胞菌等)分泌OMV并增強(qiáng)其對宿主細(xì)胞的損傷和致炎作用[33-36]。

以嗜麥芽窄食單胞菌為例，研究發(fā)現(xiàn)其OMV可刺激肺上皮細(xì)胞表達(dá)促炎細(xì)胞因子和趨化因子，造成肺上皮細(xì)胞損傷[37]。更重要的是，嗜麥芽窄食單胞菌常與其他種類的細(xì)菌(如銅綠假單胞菌、盲腸伯克霍爾德菌等)形成細(xì)菌群落，受青霉素刺激后其OMV分泌增加，而OMV中大量的β-內(nèi)酰胺酶可有效分解環(huán)境中的青霉素，使細(xì)菌群落對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性大大增強(qiáng)[33](見圖1BⅡ)。

3.2 多黏菌素類抗生素與肺炎克雷伯菌OMV介導(dǎo)的基因水平轉(zhuǎn)移

近年來革蘭陰性菌對抗生素的耐藥性增加，多黏菌素類已成為治療多重耐藥革蘭陰性菌感染的最后一道防線[38]。但最近研究發(fā)現(xiàn)，與慶大霉素介導(dǎo)OMV產(chǎn)生的機(jī)制類似，多黏菌素類可與多種革蘭陰性菌(如肺炎克雷伯菌、空腸彎曲桿菌、大腸埃希菌等)表面LPS的脂質(zhì)A結(jié)合，破壞細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)的完整性，進(jìn)而促進(jìn)OMV釋放并上調(diào)OMV中部分脂質(zhì)和蛋白的含量[39-40](見圖1AⅠ)。以肺炎克雷伯菌為例，研究發(fā)現(xiàn)其OMV中的LPS、孔蛋白和鞭毛蛋白等可強(qiáng)烈誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子等炎癥因子，進(jìn)而導(dǎo)致大量中性粒細(xì)胞浸潤和強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)[41-42](見圖1CⅠ)。對肺炎克雷伯菌OMV刺激的支氣管上皮細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞內(nèi)除相關(guān)細(xì)胞因子的基因表達(dá)明顯上調(diào)外，DNA損傷和細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因表達(dá)也有所上調(diào)，證明肺炎克雷伯菌OMV對支氣管上皮細(xì)胞同樣存在毒性[43]。

此外，肺炎克雷伯菌通過OMV將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至其他革蘭陰性菌(如大腸埃希菌、腸沙門菌和銅綠假單胞菌等)的效率極高，使不同細(xì)菌在較大范圍內(nèi)傳遞抗生素耐藥基因成為可能[44](見圖1BⅢ)。不同于質(zhì)粒，OMV介導(dǎo)的基因水平轉(zhuǎn)移受環(huán)境因素的影響較小，基因轉(zhuǎn)移更高效且穩(wěn)定[45]，這是因?yàn)镺MV可借助膜脂質(zhì)的流動(dòng)性將基因轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞內(nèi)釋放。

3.3 其他作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的抗生素

其他作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的抗生素有糖肽類和磷霉素等。有研究稱磷霉素、環(huán)丙沙星和多黏菌素類均可強(qiáng)烈刺激大腸埃希菌分泌OMV，但有關(guān)磷霉素的作用機(jī)制尚無報(bào)道[22]。有研究認(rèn)為，糖肽類抗生素萬古霉素可誘導(dǎo)糞腸球菌產(chǎn)生膜囊泡，但目前尚無糖肽類抗生素誘導(dǎo)革蘭陰性菌產(chǎn)生OMV的報(bào)道[46]。

4 結(jié)語

許多研究顯示，抗生素治療革蘭陰性菌感染不僅會影響人體正常菌群導(dǎo)致菌群失調(diào)，還會刺激細(xì)菌產(chǎn)生大量OMV，而OMV不斷刺激人體免疫系統(tǒng)，可引發(fā)感染部位的慢性炎癥，這也是目前臨床上使用抗生素治療革蘭陰性菌感染導(dǎo)致不良反應(yīng)的機(jī)制之一。此外，OMV中的諸多毒力因子在某些特殊情況下可能大量進(jìn)入宿主血液，引起嚴(yán)重的毒血癥，甚至死亡。

早在1919年抗生素尚未被發(fā)現(xiàn)時(shí)，就有利用噬菌體治療細(xì)菌感染的報(bào)道，但1929年后，隨著越來越多的抗生素被發(fā)現(xiàn)并投入使用，噬菌體治療的相關(guān)研究大幅減少。近年來，隨著對人體微生物群功能認(rèn)識的深入及抗生素耐藥問題的日益嚴(yán)重，抗生素治療引起的諸多不良反應(yīng)越來越受重視。相比之下，噬菌體治療的不良反應(yīng)報(bào)道較少，這可能與其特異性靶向殺滅細(xì)菌有關(guān)。噬菌體在殺滅細(xì)菌的過程中可利用大部分細(xì)菌物質(zhì)合成自身，從而在很大程度上減少了細(xì)菌內(nèi)毒力物質(zhì)的釋放，降低了不良反應(yīng)的發(fā)生率。目前，噬菌體在人體內(nèi)與細(xì)菌及人體免疫系統(tǒng)的相互作用還有待進(jìn)一步研究，但開發(fā)利用噬菌體靶向細(xì)菌的治療是解決多重耐藥菌感染及減少抗生素治療不良反應(yīng)的重要途徑。