韋旭

平頂山市傳染病醫(yī)院，河南 平頂山 467000

非結核分枝桿菌(nontuberculousmycobacteria，NTM)是指除麻風分枝桿菌、結核分枝桿菌復合群以外的分枝桿菌，為一種條件致病菌。其種類繁多，目前已發(fā)現(xiàn)約190種，大多對人體沒有危害[1-2]。NTM感染后可侵犯皮膚、肺、淋巴結組織，臨床上最常見的是NTM肺病。目前，NTM感染居高不下，且對許多常用抗生素耐藥，已成為臨床研究熱點[3]。不同地區(qū)之間NTM的菌種分布及發(fā)病率差異較大，分離率差異也較大，我國東南沿海地區(qū)分離率較高，而北方內陸地區(qū)分離率較低[4]。鑒于NTM不同菌種對不同抗結核藥物的敏感性不同，臨床上須通過菌種鑒定及藥敏試驗結果合理選擇藥物[5]。本研究采用DNA微陣列芯片對河南省平頂山地區(qū)的NTM菌種進行鑒定，并通過藥敏試驗分析其耐藥性，以期為治療NTM感染相關疾病提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

選擇2018年1月—2020年12月河南省平頂山市傳染病醫(yī)院收集的分枝桿菌陽性標本3 801份，其中檢出326株NTM，分離自不同患者的標本(包括痰、尿液、支氣管肺泡灌洗液等)，其中女性125例，男性201例。同一患者重復送檢樣本不重復計算，將首次樣本送檢結果納入分析。

1.2 儀器與試劑

DNA微陣列芯片和LuxScan 10K微陣列芯片掃描儀購自北京博奧生物集團有限公司，K960 PCR儀購自力新儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 NTM菌種鑒定采用DNA微陣列芯片鑒定NTM菌種。在核酸提取管中添加80 μL核酸提取液，吸取10 μL菌懸液(≥1麥氏單位濁度)至核酸提取管，振蕩15 min，95 ℃加熱15 min，12 000 g離心1 min，將提取的核酸于-20 ℃保存。取出聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)試劑并融化，加至200 μL EP管，再加入2 μL DNA模板，同時設置陽性對照和陰性對照。擴增參數(shù)為：37 ℃ 600 s，94 ℃ 600 s，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，73 ℃ 40 s，35個循環(huán)，94 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，10個循環(huán)，延伸420 s，4 ℃保存。在微陣列芯片的雜交盒底部添加200 μL蒸餾水，芯片正面朝上。在200 μL離心管中加入9 μL雜交混合液，再加入6 μL PCR產物，總體積為15 μL，95 ℃反應5 min，于冰上靜置3 min，加入13.5 μL雜交反應混合物，50 ℃孵育2 h，用芯片洗滌液洗滌。最后用微陣列芯片掃描儀掃描，探針信號值≥參考值時判定為陽性，信號值<參考值時判為陰性。

1.3.2 藥敏試驗在改良羅氏基礎培養(yǎng)基中添加溶解的抗結核藥物，分裝于試管內，置于85 ℃傾斜放置50 min。37 ℃試培養(yǎng)24 h后，如無細菌生長，置于 4 ℃保存。藥物濃度如下：異煙肼為1 μg/mL和10 μg/mL，鏈霉素為10 μg/mL和100 μg/mL，利福平為50 μg/mL和250 μg/mL，左氧氟沙星為1 μg/mL 和10 μg/mL，阿米卡星為10 μg/mL和100 μg/mL，乙胺丁醇為5 μg/mL和50 μg/mL，對氨基水楊酸為1 μg/mL和10 μg/mL，丙硫異煙胺為25 μg/mL和100 μg/mL，卡那霉素為10 μg/mL和100 μg/mL。

藥敏試驗過程：用接種環(huán)取生長至對數(shù)期的細菌培養(yǎng)物，采用細菌超聲分散計數(shù)儀將細菌超聲分散，用生理鹽水稀釋，與1號麥氏比濁管比較，配制成密度為1麥氏濁度的菌液。然后，用生理鹽水將菌液10倍連續(xù)稀釋成密度為1×10-2、1×10-4麥氏濁度的菌液，吸取10 μL菌液接種至含有藥物的培養(yǎng)基斜面，37 ℃培養(yǎng)4周，根據(jù)《全國臨床檢驗操作規(guī)程》判定分枝桿菌藥敏結果。

2 結果

2.1 NTM感染患者的年齡分布

NTM感染患者的年齡分布見表1。無論男女，從61～80歲患者分離得到的NTM菌株最多，其次是41～60歲患者。

表1 NTM菌株來源(n)

2.2 DNA微陣列芯片結果

利用DNA微陣列芯片對分離的NTM菌株進行鑒定，結果如表2所示。共鑒定出8個菌種，胞內分枝桿菌分離率最高，占35.28%；其次是龜/膿腫分枝桿菌，分離率為24.85%；其他依次為鳥分枝桿菌18.40%，堪薩斯分枝桿菌12.58%，偶然分枝桿菌5.21%，淺黃分枝桿菌1.53%，戈登分枝桿菌1.23%，瘰疬分枝桿菌0.92%。

表2 NTM菌種鑒定結果

2.3 NTM總體耐藥情況

NTM總體耐藥情況如表3所示。NTM對異煙肼的耐藥率高達97.85%，對鏈霉素、利福平、左氧氟沙星、阿米卡星、乙胺丁醇、對氨基水楊酸、丙硫異煙胺、卡那霉素的耐藥率分別為84.66%、76.38%、54.60%、73.01%、73.62%、86.81%、29.75%、77.61%。

表3 NTM總體耐藥情況

2.4 NTM不同菌種的耐藥情況

NTM不同菌種的耐藥情況如表4所示。除戈登分枝桿菌對異煙肼的耐藥率為75%外，胞內分枝桿菌、鳥分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌對異煙肼的耐藥率均>94%，其中淺黃分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌對異煙肼的耐藥率高達100%。龜/膿腫分枝桿菌對利福平的耐藥率為100%，戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌對利福平的耐藥率較低，分別為25.00%和41.46%，其余菌種對利福平的耐藥率介于60%～77%。除堪薩斯分枝桿菌外，其他NTM菌種對鏈霉素的耐藥率均>50%，其中龜/膿腫分枝桿菌、胞內分枝桿菌對鏈霉素的耐藥率>90%?？八_斯分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、鳥分枝桿菌對乙胺丁醇的耐藥率較低，而胞內分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌對乙胺丁醇的耐藥率較高，均>90%。胞內分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌對左氧氟沙星的耐藥率分別為60.87%、88.89%，其他NTM菌種對左氧氟沙星的耐藥率均<50%，其中堪薩斯分枝桿菌對左氧氟沙星的耐藥率最低，僅為7.32%。龜/膿腫分枝桿菌對阿米卡星的耐藥率較高，而淺黃分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、戈登分枝桿菌對阿米卡星的耐藥率較低。胞內分枝桿菌、鳥分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、偶然分枝桿菌對對氨基水楊酸的耐藥率較高，瘰疬分枝桿菌對對氨基水楊酸的耐藥率較低。偶然分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌對丙硫異煙胺的耐藥率>50%，其他NTM菌種對丙硫異煙胺的耐藥率均<50%。龜/膿腫分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌對卡那霉素的耐藥率>90%，而戈登分枝桿菌、淺黃分枝桿菌對卡那霉素的耐藥率為0。

表4 NTM不同菌種的耐藥情況(n，%)

3 討論

NTM是指除結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌之外的分枝桿菌的總稱，其曾用名很多，包括機會性分枝桿菌、非典型分枝桿菌、野種分枝桿菌、未分類分枝桿菌、副結核桿菌等。目前共發(fā)現(xiàn)14個亞種，多數(shù)為寄生菌，僅少數(shù)可致病，屬于條件致病菌[6]。近年來，結核病得到了有效控制，但NTM的分離率并不樂觀，其誘發(fā)的肺組織疾病受到全球的廣泛關注[7]。NTM在灰塵、土壤、水等自然環(huán)境中廣泛存在，有些對重金屬、消毒劑耐受，導致飲用水中也可能存在NTM，人主要從環(huán)境中獲得感染[8]。NTM患者個體和區(qū)域之間有明顯的差異表型。蘇州地區(qū)鑒定的NTM中，胞內分枝桿菌占比高達57.20%；其次為堪薩斯分枝桿菌，占比為25.00%；此外還分離出草分枝桿菌。徐州市分離的胞內分枝桿菌占比為42.86%，其次為鳥分枝桿菌。天津市分離的胞內分枝桿菌占比只有29.08%，分離的淺黃分枝桿菌占比最低。NTM種類較多，分離率逐年上升，很多NTM病的臨床表現(xiàn)與肺結核極為相似，只有通過分離鑒定NTM菌株，分析其耐藥性，才能提高臨床治療的效果[9-11]。

NTM感染的發(fā)病率與年齡相關，隨著年齡的增加，其發(fā)病率逐漸上升。在中國，男性NTM感染的發(fā)病率高于女性[6]。本研究分離的326株NTM分別來自201例男性和125例女性，男性明顯多于女性，且61～80歲患者明顯多于≤60歲患者。

隨著分子生物學的發(fā)展，新的菌種不斷被發(fā)現(xiàn)，親緣關系也逐漸被鑒定，使得NTM的分類更加細化。例如：膿腫分枝桿菌復合群由3個亞群組成，分別為膿腫分枝桿菌、馬賽分枝桿菌、博萊分枝桿菌。鳥型分枝桿菌復合群亞種最多，包括胞內分枝桿菌、鳥分枝桿菌、馬薩分枝桿菌、奇美拉分枝桿菌、傷口分枝桿菌等[6]。本研究采用DNA微陣列芯片分析于河南地區(qū)分離獲得的326株NTM，共鑒定出8個菌種，其中胞內分枝桿菌占比最高，分離率為35.28%，其次是龜/膿腫分枝桿菌。對天津地區(qū)NTM菌種分布的調查也發(fā)現(xiàn)，胞內分枝桿菌的分離率最高，其次為龜/膿腫分枝桿菌[11]，與本研究結果一致。大理地區(qū)NTM菌種分布中，臨床分離率最高的為鳥分枝桿菌，其次為膿腫分枝桿菌[12]。本研究分離鑒定結果也符合河南省2013——2018年NTM的流行特征[13]，雖然分離率有差距，但總體趨勢一致，均為胞內分枝桿菌占比最高。

NTM對常見抗結核類藥物的耐藥性極高[14-15]。本研究中，NTM對異煙肼的耐藥率高達97.85%，對鏈霉素、利福平、左氧氟沙星、阿米卡星、乙胺丁醇、對氨基水楊酸、丙硫異煙胺、卡那霉素的耐藥率分別為84.66%、76.38%、54.60%、73.01%、73.62%、86.81%、29.75%、77.61%，僅對丙硫異煙胺的耐藥率較低。秦中華等[16]報道了339株NTM，對異煙肼的耐藥率最高，為96.9%，與本研究的結果基本一致。吳海良等[17]也報道NTM對利福平的耐藥率為70%，對異煙肼的耐藥率為97.5%，對阿米卡星的耐藥率為70%，表明NTM對異煙肼、利福平等抗結核藥物有極高的耐藥性，而對既往認為耐藥性較低的阿米卡星的耐藥性明顯上升。本研究的藥敏結果還顯示，除戈登分枝桿菌外，其余NTM菌種對異煙肼的耐藥率均>94%；分離率較高的龜/膿腫分枝桿菌對異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥率均>95%。NTM對丙硫異煙胺的總耐藥率較低，這對NTM病的治療具有指導意義。目前，雖然針對某些NTM有推薦的藥敏試驗方法及藥物臨界濃度，但僅經過為數(shù)不多的臨床病例評價，且體外藥敏試驗結果與臨床效果的關系尚不明確，比較明確的是阿米卡星耐藥與鳥型分枝桿菌復合群、膿腫分枝桿菌感染治療失敗有關[6]。本研究也發(fā)現(xiàn)，龜/膿腫分枝桿菌對阿米卡星的耐藥率為97.53%，胞內分枝桿菌和鳥分枝桿菌對阿米卡星的耐藥率分別為76.52%和61.67%。

NTM種類較多，且新的菌種不斷被發(fā)現(xiàn)，隨著分子生物學的發(fā)展，親緣關系亦逐漸被鑒定。但NTM對常見的抗結核類藥物的耐藥性極高，因此臨床治療NTM病時，應盡量通過菌株鑒定及藥敏試驗結果選擇合適的藥物，同時亟須研發(fā)新的抗NTM藥物，這對后續(xù)提高治療效果有重要的意義。