劉奕言，張紫森，包代琴，王洪晨，李 濤，劉良明

400042 重慶，陸軍特色醫(yī)學(xué)中心：野戰(zhàn)外科研究部戰(zhàn)傷休克與輸血研究室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，麻醉科2

膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，由機(jī)體過(guò)度炎癥所致，其本質(zhì)是宿主對(duì)感染反應(yīng)的失調(diào)，可導(dǎo)致多器官、多系統(tǒng)損傷。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年有膿毒癥患者逾3 100萬(wàn)，死亡人數(shù)更是高達(dá)600萬(wàn)，由于部分中、低收入國(guó)家膿毒癥流行病學(xué)數(shù)據(jù)缺失，因此，全球膿毒癥發(fā)病率還可能更高。目前針對(duì)膿毒癥雖有大量的研究，但其發(fā)病機(jī)制仍不十分明確，膿毒癥發(fā)生時(shí)機(jī)體存在劇烈的炎癥反應(yīng)，但臨床應(yīng)用炎癥因子抑制劑后膿毒癥患者病死率仍居高不下。近年來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)膿毒癥除炎癥風(fēng)暴外還有大量氧化產(chǎn)物堆積的特點(diǎn)，膿毒癥時(shí)病原體及其毒素激活的炎癥反應(yīng)以及宿主本身不斷釋放的炎癥介質(zhì)，可影響線粒體氧化呼吸鏈的偶聯(lián)過(guò)程，造成ROS生成增多，最終損傷組織細(xì)胞及多個(gè)器官。因此，針對(duì)氧化還原失衡的治療可能有助于更好地救治膿毒癥患者。

鐵死亡是一種被新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式，其主要機(jī)制是在二價(jià)鐵或酯氧合酶的作用下，催化細(xì)胞膜上高表達(dá)的不飽和脂肪酸，發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。此外，還表現(xiàn)在抗氧化體系(谷胱甘肽系統(tǒng))的調(diào)控核心酶GPX4的表達(dá)降低。鐵死亡抑制劑(ferrostatin-1，F(xiàn)er-1)可以減輕脂多糖(lipopolys-accharide, LPS)誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠急性肺損傷。

周細(xì)胞是血管周圍的一群具有多能干性的壁細(xì)胞，在調(diào)節(jié)多種微血管功能中起關(guān)鍵作用，如血管屏障、血腦屏障、血管生成等，周細(xì)胞的丟失會(huì)導(dǎo)致血管屏障功能的破壞。膿毒癥后周細(xì)胞是否會(huì)發(fā)生鐵死亡，周細(xì)胞鐵死亡是否在膿毒癥后血管滲漏中起重要作用，目前尚不清楚。因此，本研究擬采用膿毒癥大鼠模型和LPS處理周細(xì)胞，探討周細(xì)胞鐵死亡在膿毒癥肺血管屏障功能中的作用及鐵死亡抑制劑Fer-1對(duì)肺血管屏障功能的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自中國(guó)Elabscience公司；脂質(zhì)過(guò)氧化物(LPO)ELISA試劑盒購(gòu)自中國(guó)南京建成生物工程研究所；活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天公司；脂多糖、伊文思藍(lán)(Evens blue，EB)、Ⅰ型膠原酶購(gòu)自美國(guó)sigma公司；Fer-1購(gòu)自美國(guó)MedChem Express公司；山羊抗兔一抗、山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)LI-COR公司；周細(xì)胞專用培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Science cell公司；F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；GPX4、 COX2抗體、PFGFR-β抗體、神經(jīng)膠質(zhì)抗原2(neuron-glia antigen 2, NG2)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；流式抗體染色液、CD146抗體、血小板衍生生長(zhǎng)因子β(platelet-derived growth factor receptor beta, PDGFR-β)抗體購(gòu)自BD公司；二價(jià)鐵離子檢測(cè)探針購(gòu)自日本同仁化學(xué)公司，BODIPY581/591 C11購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型建立

健康成年SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(200±220)g，由陸軍特色醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，自由飲食，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。本研究經(jīng)陸軍特色醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物處置過(guò)程符合倫理要求。

將156只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：假手術(shù)組(Sham組)、盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)組(CLP組)和鐵死亡抑制劑組(Fer-1組)。CLP組、Fer-1組通過(guò)盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP) 術(shù)制備大鼠膿毒癥模型， Fer-1組在CLP術(shù)前1 h經(jīng)腹腔注射Fer-1(10 mg/kg)，Sham組只進(jìn)行探查操作，不進(jìn)行盲腸結(jié)扎和穿孔。各組術(shù)后均按5 mL/200 g劑量腹腔注射無(wú)菌生理鹽水。流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)取假手術(shù)組大鼠肺單細(xì)胞懸液增設(shè)空白未染色組(Blank組)。

1.3 大鼠原代周細(xì)胞的提取、培養(yǎng)及模型建立

取初斷乳大鼠視網(wǎng)膜，剪碎，轉(zhuǎn)入2 g/L的Ⅰ型膠原酶中，置于37 ℃水浴鍋消化30 min后，立即加入含有10%FBS的周細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化。參照本實(shí)驗(yàn)室之前的方法進(jìn)行過(guò)濾、收集、離心。獲取的周細(xì)胞，加入適量周細(xì)胞培養(yǎng)基，將沉淀吹散重懸，轉(zhuǎn)入25 cm的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)消化傳代。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(Normal組)、脂多糖刺激組(LPS組)和Fer-1組，LPS組用10 μg/mL LPS處理周細(xì)胞12 h，F(xiàn)er-1組用2 μmol/L Fer-1預(yù)處理周細(xì)胞12 h后，再用10 μg/mL LPS處理周細(xì)胞12 h。

1.4 樣本采集與指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 HE染色 CLP術(shù)后12 h，將大鼠麻醉固定，在大鼠吸氣末夾閉并結(jié)扎氣管，使肺充盈，打開胸腔，經(jīng)心臟灌注等滲生理鹽水直至肺組織幾乎不見血色，而后用4%多聚甲醛繼續(xù)灌注。取下肺組織，用4%多聚甲醛固定后，用石蠟包埋并切片。將肺組織石蠟切片于60℃烘烤，于二甲苯和梯度酒精中脫蠟并水化。蘇木精染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)，脫水封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察各組肺組織形態(tài)。

1.4.2 肺伊文思藍(lán)(Evans blue, EB)測(cè)定 CLP術(shù)后12 h，將大鼠麻醉固定，經(jīng)頸靜脈插管注射EB 60 mg/kg，30 min后用生理鹽水灌肺直至肺組織基本不見血色，處死大鼠，取完整肺組織。用冷PBS漂洗表面血液，濾紙吸干組織表面水分，拍照后取左肺上葉稱量，加入PBS(組織質(zhì)量∶PBS體積=0.07 mg/mL)在冰上利用勻漿器勻漿，勻漿液移至離心機(jī)離心(4 ℃、8 000×

g

、10 min)，取上清液再次離心(4 ℃、16 000×

g

、10 min)，取上清液利用全波長(zhǎng)酶標(biāo)測(cè)定儀在590 nm測(cè)定光密度值[

D

(590)]，根據(jù)EB標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得上清液EB濃度。另取上清液利用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，最終用EB質(zhì)量與蛋白質(zhì)量的比值作為肺血管通透性指標(biāo)。

1.4.3 肺濕干質(zhì)量比測(cè)定 CLP術(shù)后12 h，將大鼠麻醉固定并處死，打開胸腔，取左肺上葉，用濾紙吸干肺組織表面血液，并稱量，而后放置在錫箔紙上。50 ℃烤箱烘干72 h后再次稱量，以濕干質(zhì)量比作為評(píng)價(jià)肺水腫情況的指標(biāo)。

1.4.4 TNF-α和IL-6測(cè)定 CLP術(shù)后12 h，取各組靜脈血2 mL，室溫靜置2 h后，離心取上層血清(4 ℃、1 000×

g

、10 min)。ELISA試劑盒測(cè)定血清TNF-α和IL-6水平。1.4.5 肺組織細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)分析 CLP術(shù)后12 h，將大鼠麻醉固定并處死，打開胸腔，取右肺上葉，生理鹽水清洗后置于無(wú)血清1640培養(yǎng)基中。將肺置于3～5 mL肺組織消化液Ⅰ中，用眼科剪將肺組織剪碎，置于37 ℃水浴鍋中30 min，1 mL移液器每隔10分鐘吹打數(shù)次后過(guò)濾，剩余組織用消化液Ⅱ 37 ℃消化30 min后過(guò)濾。取過(guò)濾液體400×

g

離心5 min，收集沉淀，加入紅細(xì)胞裂解液3～5 mL，吹打混勻后室溫放置10 min，400×

g

離心5 min。將細(xì)胞按100 μL每管分裝到1.5 mL EP管用于后續(xù)流式抗體染色。周細(xì)胞標(biāo)志性抗體染色：PDGFR-β(APC)，按照1∶20稀釋，CD146(PE)，按照1∶20稀釋，室溫避光放置30 min后，流式抗體染色液洗滌細(xì)胞，400×

g

離心5 min，重懸細(xì)胞沉淀后上機(jī)檢測(cè)。脂質(zhì)過(guò)氧化物探針：用Liperfluo(1 μmol/L,37 ℃)孵育細(xì)胞1 h后洗滌，400×

g

離心5 min，重懸細(xì)胞沉淀后上機(jī)檢測(cè)。

1.4.6 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) CLP術(shù)后12 h，顯微鏡下取肺微小靜脈組織，提取組織總蛋白，Western blot 檢測(cè)GPX4、COX2、NG2和PDGFR-β。經(jīng)電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉，孵育GPX4一抗(稀釋度1∶1 000)、COX2一抗(稀釋度1∶1 000)、NG2一抗(稀釋度1∶1 000)、PDGFR-β一抗(稀釋度1∶1 000)、β-actin一抗(稀釋度1∶6 000)，4 ℃冰箱過(guò)夜。次日TBST洗膜3次，5 min/次，室溫孵育二抗(稀釋度1∶20 000)。Odyssey紅外激光掃描成像系統(tǒng)(LI-COR公司，美國(guó))曝片。采用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值反應(yīng)目的蛋白的表達(dá)。

3.2.1 低碳綠色材料的應(yīng)用 在綠道規(guī)劃設(shè)計(jì)中，采用多種綠色手段與生態(tài)建設(shè)方法，盡可能實(shí)現(xiàn)綠道的低碳減排，將廢棄材料以新的設(shè)計(jì)語(yǔ)言呈現(xiàn)，使之得以在綠道景觀中重生。如利用綠道內(nèi)廢棄構(gòu)筑物為基礎(chǔ)建造景觀建筑、利用場(chǎng)地廢棄枕木、山崖剝落的巖石等作為場(chǎng)地鋪裝，以及利用湖中枯木造景、廢棄輪胎等打造景觀小品等。

1.4.7 周細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè) 接種周細(xì)胞于共聚焦培養(yǎng)皿中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理細(xì)胞。按照1∶1 000用無(wú)血清F12培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。去除培養(yǎng)基，加入1 mL稀釋好的DCFH-DA。在37 ℃，5%CO細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無(wú)血清F12培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。在FITC通道用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.4.8 周細(xì)胞內(nèi)Lipid ROS檢測(cè) 周細(xì)胞處理同上。去除培養(yǎng)基后，用無(wú)血清F12培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次。加入1 mL濃度為10 μmol/L的BODIPY工作液，在37 ℃，5%CO細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。去除上清，無(wú)血清F12培養(yǎng)基清洗3次后用激光共聚焦顯微鏡觀察[Nonoxidized (595 nm), Oxidized (520 nm)]。

1.4.9 周細(xì)胞內(nèi)Fe檢測(cè) 周細(xì)胞處理同上。棄去培養(yǎng)基，用無(wú)血清F12培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次。加入1 mL濃度為1 μmol/L的FerroOrange工作液，在37 ℃，5%CO細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。無(wú)需清洗，直接在激光共聚焦顯微鏡下觀察(Ex543 nm，Em580 nm)。

1.4.10 動(dòng)物存活情況 每組按隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)取16只SD大鼠，CLP術(shù)后12 h開始算起，記錄動(dòng)物的72 h存活時(shí)間和計(jì)算72 h存活率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用

t

檢驗(yàn)，存活率和存活時(shí)間單獨(dú)采用Kaplan-Meier生存分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥后肺血管周細(xì)胞大量丟失及Fer-1的保護(hù)作用

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，CLP組膿毒癥后肺微小靜脈周細(xì)胞標(biāo)志物(PDGFR-β和NG2)表達(dá)顯著降低， PDGFR-β和NG2表達(dá)分別較假手術(shù)組降低了78.73%和72.42%，見圖1A、B；表明肺微小靜脈周細(xì)胞大量丟失。Fer-1能顯著減少膿毒癥后肺血管周細(xì)胞丟失，表現(xiàn)為Fer-1預(yù)處理后，周細(xì)胞標(biāo)志物PDGFR-β和NG2表達(dá)分別較CLP組分別增加了146.33%和163.71%。肺組織細(xì)胞流式結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠肺周細(xì)胞占比約3.11%，CLP組膿毒癥后肺血管周細(xì)胞大量丟失，周細(xì)胞占比下降至0.86%，F(xiàn)er-1預(yù)處理組肺血管周細(xì)胞占比幾乎恢復(fù)至正常水平，見圖1C。結(jié)果表明，膿毒癥可導(dǎo)致肺血管周細(xì)胞鐵死亡和丟失，鐵死亡抑制劑Fer-1可減少膿毒癥后肺血管周細(xì)胞鐵死亡，減少周細(xì)胞丟失。

A、B：Western blot檢測(cè)結(jié)果及定量分析與Sham組比較； b：P<0.01，與CLP組比較；C：肺單細(xì)胞懸液流式細(xì)胞術(shù)分析 Blank：空白未染色組

2.2 膿毒癥急性肺損傷、肺血管通透性變化及Fer-1的保護(hù)作用

HE染色結(jié)果顯示(圖2A)：假手術(shù)組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰可見，肺泡壁厚度正常，肺泡間隔無(wú)水腫，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。CLP組大鼠出現(xiàn)明顯的肺損傷改變：肺泡出現(xiàn)大范圍破裂伴局灶性肺不張，肺泡壁水腫、增厚，間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與CLP組相比，F(xiàn)er-1組大鼠肺損傷減輕，肺泡破裂情況明顯減少，肺泡壁水腫減輕，厚度降低。肺濕干質(zhì)量比結(jié)果顯示(圖2D):與假手術(shù)組大鼠相比,膿毒癥大鼠肺濕干質(zhì)量比增加了22.50% (

P

<0.01)。Fer-1組大鼠肺濕干質(zhì)量比較CLP組降低了9.10% (

P

<0.01)。EB結(jié)果顯示(圖2B、C):正常組大鼠肺表面光滑，幾乎無(wú)藍(lán)色斑點(diǎn)。膿毒癥大鼠肺表面顏色暗淡, EB大量外滲，全肺呈明顯深藍(lán)色，左肺上葉每毫克蛋白內(nèi)EB含量為(13.36±3.01)ng，是假手術(shù)組的3.94倍。 Fer-1組大鼠肺表面色澤明顯改善,藍(lán)色斑點(diǎn)大幅減少，左肺上葉單位蛋白EB含量相較于CLP組降低了50.39%(

P

<0.01) 。表明膿毒癥可導(dǎo)致明顯的肺組織損傷，肺血管通透性升高，鐵死亡抑制劑Fer-1能減輕膿毒癥后急性肺損傷，對(duì)膿毒癥后肺血管通透性具有保護(hù)作用。

A：各組大鼠肺病理結(jié)構(gòu)變化(HE ×200)；B、C：肺EB染色；D：肺濕干質(zhì)量比 a：P<0.01，與Sham組比較；b：P<0.01，與CLP組比較

2.3 膿毒癥肺血管周細(xì)胞鐵死亡及Fer-1的保護(hù)作用

A：Western blot檢測(cè)結(jié)果；B：A圖灰度值定量分析結(jié)果(n=3)；C：肺小靜脈脂質(zhì)過(guò)氧化物(LPO)含量測(cè)定(n=8)；D：肺單細(xì)胞選擇流式細(xì)胞術(shù)分析 a：P<0.01，與Sham組比較；b：P<0.01，與CLP組比較

2.4 Fer-1減輕膿毒癥后炎癥反應(yīng)，提高膿毒癥大鼠存活率

大鼠血漿炎癥因子檢測(cè)結(jié)果顯示(圖4)：膿毒癥大鼠血漿TNF-α和IL-6水平顯著升高，分別是Sham組的5.32倍和5.88倍，F(xiàn)er-1組和CLP組相比，血漿TNF-α和IL-6水平分別降低了58.92%和68.39%。膿毒癥大鼠在24 h內(nèi)大量死亡，存活時(shí)間為(34.8±4.26)h，僅1只存活超過(guò)72 h；鐵死亡抑制劑Fer-1組大鼠僅2只在24 h內(nèi)死亡，平均存活時(shí)間為(57.7±4.66)h，72 h存活率為43.75%(7/16)，動(dòng)物存活情況顯著改善。表明Fer-1可顯著抑制膿毒癥后炎癥因子水平的增加，抑制膿毒癥后炎癥反應(yīng)，明顯改善動(dòng)物存活。

A：血清IL-6水平(n=8)；B：血清TNF-α水平(n=8)；C：存活時(shí)間 (n=16)；D：72 h存活率 (n=16) a：P<0.01，與Sham組比較； b：P<0.01，與CLP組比較

2.5 周細(xì)胞的鑒定

使用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)進(jìn)行周細(xì)胞的鑒定，結(jié)果顯示：周細(xì)胞標(biāo)志性蛋白，血小板衍生生長(zhǎng)因子β(PDGFR-β),alpha-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)，神經(jīng)膠質(zhì)抗原2(NG2)呈陽(yáng)性表達(dá)；內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1/CD31)表達(dá)呈陰性。見圖5。

圖5 共聚焦顯微鏡檢測(cè)周細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)

2.6 LPS誘導(dǎo)的周細(xì)胞鐵死亡及Fer-1的保護(hù)作用

LPS處理周細(xì)胞12 h后周細(xì)胞活性顯著降低(圖6A)，細(xì)胞內(nèi)ROS和Lipid ROS顯著升高，周細(xì)胞內(nèi)Fe大量蓄積，周細(xì)胞發(fā)生鐵死亡； Fer-1可拮抗LPS誘導(dǎo)的周細(xì)胞鐵死亡(圖6B、C)，表現(xiàn)為周細(xì)胞活性恢復(fù)，胞內(nèi)ROS、Lipid ROS和Fe含量均顯著下降(圖6)。表明LPS能誘導(dǎo)周細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，F(xiàn)er-1能顯著減輕LPS誘導(dǎo)的鐵死亡。

A：CCK-8測(cè)定周細(xì)胞細(xì)胞活性 (n=8) a：P<0.01，與Normal組比較；b：P<0.01，與LPS組比較；B：共聚焦顯微鏡觀察周細(xì)胞內(nèi)ROS和Fe2+含量；C：共聚焦顯微鏡觀察周細(xì)胞內(nèi)Lipid ROS含量

3 討論

血管滲漏是嚴(yán)重創(chuàng)傷休克、膿毒癥等臨床重癥致多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)甚至死亡的關(guān)鍵因素，血管滲漏主要是通過(guò)細(xì)胞旁途徑和跨細(xì)胞(也稱穿細(xì)胞)途徑發(fā)生，具體表現(xiàn)為進(jìn)行性水腫、低血容量性及分布性休克、非蛋白尿性低蛋白血癥以及血液濃縮。目前針對(duì)血管滲漏的救治措施效果有限，研究血管滲漏的調(diào)控機(jī)制，尋找有效的防治措施，對(duì)提高膿毒癥等臨床重癥的治療效果有重要意義。

周細(xì)胞是在19世紀(jì)70年代被發(fā)現(xiàn)的一群新的獨(dú)特的細(xì)胞類型，周細(xì)胞包裹著毛細(xì)血管，可以影響血管的發(fā)育和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。毛細(xì)血管壁由內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞共同構(gòu)成，內(nèi)皮細(xì)胞形成血管腔，周細(xì)胞則像“爪子”一樣環(huán)繞著內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞之間由基底膜隔開。周細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞表面的覆蓋率在不同組織中有所不同，兩者的比例在1∶1～1∶100之間，血管周細(xì)胞密度以大腦和視網(wǎng)膜最高，骨骼肌最低。NEES等發(fā)現(xiàn)左心室每單位體積的周細(xì)胞數(shù)量超過(guò)心肌細(xì)胞數(shù)量。周細(xì)胞的數(shù)量及周細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上的覆蓋率對(duì)血管的屏障功能至關(guān)重要。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥時(shí)周細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞且數(shù)量急劇減少，可引起微血管發(fā)生嚴(yán)重滲漏。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)外源性輸注周細(xì)胞可以通過(guò)直接覆蓋和旁分泌機(jī)制顯著改善膿毒癥大鼠血管屏障功能，提高動(dòng)物存活率和延長(zhǎng)存活時(shí)間。

鐵死亡是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡形式，其特征是鐵依賴性脂質(zhì)過(guò)氧物積累到致死水平。鐵死亡在細(xì)胞形態(tài)上主要表現(xiàn)為明顯的線粒體皺縮，膜密度增加和嵴減少，這與其他細(xì)胞死亡形式明顯不同。和自噬對(duì)比，鐵死亡不會(huì)形成典型的封閉雙層膜結(jié)構(gòu)(自噬小泡)。

鐵死亡有三大生化特征：①活性鐵池(labile iron pool )內(nèi)游離鐵蓄積和依賴鐵的過(guò)氧化物酶激活；②具有多不飽和脂肪酸酰基尾部和易發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的雙烯丙基碳的磷脂發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化；③脂質(zhì)過(guò)氧化還原、修復(fù)系統(tǒng)受損，包括GSH-GPX4, GCH1-BH4, NADPH-FSPQ-CoQ10。鐵死亡的調(diào)控途徑非常復(fù)雜，包括鐵、脂質(zhì)和氨基酸等在內(nèi)的多代謝途徑共同控制著細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性。膿毒癥時(shí)鐵代謝發(fā)生嚴(yán)重紊亂，包括鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收以及外排，這可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量鐵的蓄積；鐵大量蓄積一方面可以激活含鐵脂氧合酶，另一方面又可以催化芬頓反應(yīng)(Fenton reaction)產(chǎn)生大量活性氧簇。大量研究表明鐵蓄積不僅可以作為膿毒癥患者病情嚴(yán)重程度的有效評(píng)價(jià)指標(biāo)還可以預(yù)測(cè)膿毒癥病人的預(yù)后情況。近年來(lái)有研究指出，膿毒癥后機(jī)體存在嚴(yán)重鐵死亡，抑制鐵死亡有望成為膿毒癥治療的新靶點(diǎn)。LI等指出膿毒癥后NCOA4介導(dǎo)鐵蛋白自噬可參與誘導(dǎo)心肌細(xì)胞鐵死亡，造成心肌損傷，XIAO等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鐵死亡抑制劑Fer-1通過(guò)TLR4/NF-κB通路顯著改善脂多糖誘導(dǎo)的SD大鼠心肌損傷，靶向心肌細(xì)胞鐵死亡有望成為治療膿毒癥后心臟損傷的重要方法。WEI等報(bào)道外源性補(bǔ)給鳶尾素可通過(guò)抑制鐵死亡保護(hù)膿毒癥后肝臟功能；衣康酸可通過(guò)Nrf2通路抑制巨噬細(xì)胞鐵死亡拮抗膿毒癥急性肺損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膿毒癥后肺微小靜脈周細(xì)胞鐵死亡增加，周細(xì)胞大量丟失；EB實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肺血管發(fā)生嚴(yán)重滲漏，通透性升高，肺組織嚴(yán)重受損。鐵死亡抑制劑Fer-1能減輕膿毒癥后肺血管周細(xì)胞鐵死亡，拮抗周細(xì)胞丟失，減輕肺血管滲漏，保護(hù)肺血管屏障功能，顯著改善動(dòng)物存活。研究結(jié)果表明，周細(xì)胞鐵死亡在膿毒癥肺血管屏障功能損傷中起重要作用， 鐵死亡抑制劑對(duì)膿毒癥肺血管屏障功能有重要保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)原代分離周細(xì)胞，觀察LPS處理對(duì)周細(xì)胞鐵死亡的影響及鐵死亡抑制劑Fer-1對(duì)LPS誘導(dǎo)周細(xì)胞鐵死亡的拮抗作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS處理周細(xì)胞后，周細(xì)胞內(nèi)ROS、Lipid ROS和Fe含量顯著增加，鐵死亡標(biāo)志性蛋白GPX4表達(dá)顯著降低，COX2表達(dá)顯著增加，結(jié)果表明LPS可誘導(dǎo)周細(xì)胞鐵死亡，鐵死亡抑制劑Fer-1能拮抗LPS誘導(dǎo)的鐵死亡，但膿毒癥后周細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的具體機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

微循環(huán)血管通透性的維護(hù)，依賴于血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的完整性，除了以往認(rèn)為的“毛細(xì)血管滲漏”外，小靜脈和細(xì)小靜脈在此過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。組胺、緩激肽等其他半衰期較短炎癥介質(zhì)造成的速發(fā)短暫效應(yīng)僅累及口徑20～60μm的細(xì)靜脈，此時(shí)細(xì)動(dòng)脈和毛細(xì)血管不受累。創(chuàng)傷、燒傷、休克、細(xì)菌毒素等刺激造成的直接血管損傷，則可累及細(xì)靜脈及毛細(xì)血管。因此，本研究采用在體視鏡下顯微分離肺小靜脈和細(xì)小靜脈的方法研究鐵死亡與血管屏障功能的關(guān)系。