吳 躍，朱 娛，周遠(yuǎn)群，李清暉，彭小勇，向鑫明，劉良明，李 濤

400042 重慶，陸軍特色醫(yī)學(xué)中心戰(zhàn)傷休克與輸血研究室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

一般創(chuàng)傷的休克發(fā)生率為10%～15%，戰(zhàn)創(chuàng)傷休克的發(fā)生率可高達(dá)25%～30%。其中32.6%～59.5%的傷員死于失血性休克。研究者近年針對(duì)常規(guī)環(huán)境戰(zhàn)創(chuàng)傷休克早期救治提出了許多新的原則，包括低壓復(fù)蘇、延遲復(fù)蘇等；同時(shí)針對(duì)戰(zhàn)創(chuàng)傷休克所致器官功能損傷也建立了多種綜合防治措施，提高了戰(zhàn)創(chuàng)傷休克救治水平。針對(duì)急進(jìn)高原環(huán)境合并創(chuàng)傷休克，本實(shí)驗(yàn)室前期提出了快速降低海拔高度等防治措施。但目前針對(duì)高原合并戰(zhàn)創(chuàng)傷休克早期救治缺乏有效的防治措施。

低氧寒冷是高原環(huán)境的顯著特點(diǎn)，低氧可導(dǎo)致肺、腦等器官功能損傷。線(xiàn)粒體是細(xì)胞內(nèi)供能、細(xì)胞氧化應(yīng)激以及鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控的重要細(xì)胞器，也是對(duì)缺氧最為敏感的細(xì)胞器。本實(shí)驗(yàn)室相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，低氧刺激可引起線(xiàn)粒體形態(tài)變化，表現(xiàn)為線(xiàn)粒體過(guò)度分裂。當(dāng)線(xiàn)粒體過(guò)度分裂時(shí)，線(xiàn)粒體功能呈現(xiàn)明顯障礙。研究表明抑制線(xiàn)粒體過(guò)度分裂對(duì)心血管疾病等有重要的保護(hù)作用。線(xiàn)粒體分裂抑制劑(mitochondrial division inhibitor-1，Mdivi-1)是一種動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1, Drp1)活性抑制劑，對(duì)Drp1所致線(xiàn)粒體分裂有顯著的抑制作用。有研究報(bào)道Mdivi-1可通過(guò)抑制線(xiàn)粒體分裂對(duì)神經(jīng)性疾病發(fā)揮明顯治療作用。但Mdivi-1能否通過(guò)抑制線(xiàn)粒體分裂發(fā)揮對(duì)高原戰(zhàn)創(chuàng)傷休克的糾正作用，目前未見(jiàn)報(bào)道。

為此，本研究通過(guò)對(duì)急進(jìn)高原大鼠行脾動(dòng)脈離斷方法復(fù)制高原戰(zhàn)創(chuàng)傷休克模型，觀察Mdivi-1對(duì)大鼠失血量、輸液量、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、器官功能以及大鼠存活的影響。為高原戰(zhàn)創(chuàng)傷休克的救治提供重要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

成年SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(210.3±7.9)g，由陸軍特色醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(渝)20170002。

Mdivi-1購(gòu)自Tocris公司(英國(guó)，規(guī)格50 mg)，使用時(shí)溶于二甲基亞砜進(jìn)行配制；乳酸林格氏液(Lactate Ringer’s，LR)購(gòu)自四川科倫藥業(yè)股份有限公司(中國(guó))；肝素鈉注射液購(gòu)自常州千紅生化制藥股份有限公司(中國(guó))，規(guī)格2 mL∶12 500 U；氯化鈉注射液購(gòu)自四川科倫藥業(yè)股份有限公司(中國(guó))。

1.2 模型制備

將大鼠從平原(重慶)空運(yùn)至高原(拉薩，海拔3 600 m)，放置72 h，正常進(jìn)食飲水。實(shí)驗(yàn)前禁食、自由飲水，以3%的戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，仰臥固定動(dòng)物，左股動(dòng)、靜脈分別插管用于采血、平均動(dòng)脈血壓(mean arterial pressure，MAP)監(jiān)測(cè)和輸液。插管完成后各注入100 U肝素鈉，穩(wěn)定10 min。從腹中線(xiàn)剖腹，暴露脾臟，從脾動(dòng)脈分支之間橫行切斷脾實(shí)質(zhì)，并切斷一條脾動(dòng)脈分支，使血自由流至腹腔內(nèi)，關(guān)閉腹腔。當(dāng)MAP降至40 mmHg時(shí)即為造模成功。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及指標(biāo)觀察

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為兩部分(圖1)：大鼠非控制性出血性休克模型成功后，進(jìn)行低壓復(fù)蘇，觀察Mdivi-1對(duì)低壓維持時(shí)間的影響。在低壓復(fù)蘇過(guò)程中，將Mdivi-1分別按0.1、0.5 mg/kg加入5 mL的LR中進(jìn)行低壓復(fù)蘇，根據(jù)前期本實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果，復(fù)蘇壓力維持在50～60 mmHg，5 mL含Mdivi-1的LR輸注完畢后，采用LR繼續(xù)以維持低壓復(fù)蘇，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程不結(jié)扎血管止血，觀察大鼠血壓維持情況、液體輸注量、失血量以及動(dòng)物最后的存活時(shí)間變化。根據(jù)第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在低壓復(fù)蘇維持1 h后徹底止血，結(jié)扎脾臟動(dòng)脈，清理腹腔內(nèi)積血，計(jì)算失血量。在確定治療階段用LR繼續(xù)復(fù)蘇至2倍失血量。實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組(只開(kāi)腹，不作手術(shù)處理)、休克組、LR對(duì)照組(乳酸林格氏液)、0.1和0.5 mg/kg Mdivi-1組。在徹底復(fù)蘇后觀察各組大鼠輸液量，經(jīng)皮氧分壓，肺腦含水量，心、肝和腎臟損傷指標(biāo)的變化以及大鼠存活時(shí)間。

圖1 實(shí)驗(yàn)方案

1.4 指標(biāo)參數(shù)測(cè)定

1.4.1 肺腦含水量 在觀察時(shí)相點(diǎn)，分別取大鼠全腦和右肺，用吸水紙清理表面的血跡，標(biāo)記稱(chēng)量；放置于37℃烤箱中72 h，重新稱(chēng)量。含水量計(jì)算公式為：含水量=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量。

1.4.2 心、肝和腎臟損傷指標(biāo)測(cè)定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在大鼠徹底復(fù)蘇后2 h，取大鼠全血采用生化分析儀(DX800，Beckman Coulter，美國(guó))測(cè)定心損指標(biāo)肌鈣蛋白I(cardiac troponin I， cTnI)、 肝臟功能損傷指標(biāo)[谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)]和腎臟功能損傷指標(biāo)[尿素氮(urea nitrogen，Urea)，肌酐(creatinine，Crea)]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，血壓、失血量、輸液量、器官功能等參數(shù)采用單因素或雙因素方差分析。大鼠存活時(shí)間采用Kaplan Meier法和Log-rank檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Mdivi-1對(duì)高原非控制性出血休克大鼠失血量、血壓及存活時(shí)間的影響

2.1.1 MAP 大鼠在高原放置72 h后，血壓水平為110～120 mmHg。經(jīng)脾動(dòng)脈離斷自由出血致MAP降至40 mmHg，模型成功后，采用LR或Mdivi-1復(fù)蘇，但不進(jìn)行止血處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純LR復(fù)蘇能將MAP維持在50～60 mmHg約 1 h，1 h后MAP開(kāi)始下降，2 h后MAP只能維持在20 mmHg左右。0.1和0.5 mg/kg Mdivi-1輸注能較好地維持MAP在50～60 mmHg約3 h (圖2A)。

2.1.2 失血量和輸液量 大鼠在非控制性出血性休克后不復(fù)蘇，其失血量占全身總血量的65%～70%；采用LR進(jìn)行低壓復(fù)蘇，盡管可短時(shí)升高大鼠的血壓，但大鼠失血量和液體輸注量顯著增加，失血量達(dá)110%～120%，大鼠液體輸注量為22～25 mL；Mdivi-1輸注可較好維持血壓，減少失血量和輸液量，0.5 mg/kg Mdivi-1組的失血量?jī)H為全身總血量的45%～50%，液體輸注總量為5 mL (圖2B、C)。

a: P<0.01，與LR對(duì)照組比較；1：休克組；2：LR對(duì)照組；3：0.1 mg/kg Mdivi-1組；4: 0.5 mg/kg Mdivi-1組

2.1.3 存活時(shí)間和存活率 由于單純LR輸注絕大部分大鼠在2 h之內(nèi)死亡，平均存活時(shí)間只在90 min左右；0.1和0.5 mg/kg Mdivi-1輸注后大鼠存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，一半的大鼠存活時(shí)間超過(guò)3 h；0.5 mg/kg Mdivi-1組大鼠平均存活時(shí)間在160 min左右 (圖3)。

a: P<0.01，與假手術(shù)組比較；b: P<0.05，c: P<0.01，與LR對(duì)照組比較；1：假手術(shù)組；2：休克組；3：LR對(duì)照組；4：0.1 mg/kg Mdivi-1組；5: 0.5 mg/kg Mdivi-1組

2.2 Mdivi-1對(duì)高原非控制性出血休克大鼠止血后復(fù)蘇效果的影響

2.2.1 MAP、失血量和輸液量 高原創(chuàng)傷失血休克大鼠采用LR低壓復(fù)蘇1 h后，徹底結(jié)扎脾動(dòng)脈止血、復(fù)蘇，2 h后其MAP只能維持在60 mmHg左右。采用0.1或0.5 mg/kg Mdivi-1輸注后，MAP明顯升高，0.5 mg/kg Mdivi-1 輸注后2 h，MAP可維持在80 mmHg以上 (圖 4A)。LR低壓復(fù)蘇1 h，失血量在55%～58%，液體輸注量13～15 mL；Mdivi-1輸注可明顯減少失血量和輸液量，0.5 mg/kg Mdivi-1組的失血量為42%～45%，液體輸注量約5 mL (圖4B、C)。

a: P<0.01，與LR對(duì)照組比較；1：休克組；2：LR對(duì)照組；3：0.1 mg/kg Mdivi-1組；4: 0.5 mg/kg Mdivi-1組

2.2.2 經(jīng)皮氧分壓 正常情況下，大鼠腹部皮膚的經(jīng)皮氧分壓為28±5 mmHg。在高原創(chuàng)傷休克后大鼠經(jīng)皮氧分壓明顯降低(<5 mmHg)；采用LR或聯(lián)合Mdivi-1復(fù)蘇后，可顯著改善大鼠經(jīng)皮氧分壓，但Mdivi-1效果明顯優(yōu)于LR。LR對(duì)照組在徹底止血復(fù)蘇后經(jīng)皮氧分壓為10 mmHg左右，而0.5 mg/kg Mdivi-1徹底止血復(fù)蘇后，大鼠經(jīng)皮氧分壓可達(dá)(19±3)mmHg (圖5A)。

低壓復(fù)蘇末為低壓維持50～60 mmHg 1 h后結(jié)扎止血的時(shí)間點(diǎn)；徹底復(fù)蘇末為結(jié)扎止血后徹底復(fù)蘇結(jié)束后2 h點(diǎn)；1：假休克組；2：休克組；3：LR對(duì)照組；4：0.1 mg/kg Mdivi-1組；5: 0.5 mg/kg Mdivi-1組

2.2.3 肺腦含水量 正常情況下，大鼠肺和腦含水量分別為(77.4±5.0)%和(78.0±0.6)%。非控制性出血休克LR輸注后，大鼠的肺、腦含水量均有所升高，分別達(dá)到(80.8±2.4)%、(80.0±1.2)%；與LR復(fù)蘇相比，Mdivi-1復(fù)蘇均可顯著降低大鼠肺腦含水量，其中0.5 mg/kg Mdivi-1復(fù)蘇后大鼠肺腦含水量為(78.1±0.8)%、(78.8±0.7)% (圖5B、C)。

2.2.4 重要器官功能 大鼠非控制性出血性休克后，呈現(xiàn)明顯心臟、肝臟和腎臟器官功能損傷，表現(xiàn)為大鼠心肌損傷標(biāo)志物cTnI，肝臟損傷標(biāo)志物AST和ALT，腎臟損傷標(biāo)志物Urea和Crea水平顯著升高；單純LR復(fù)蘇對(duì)大鼠心臟、肝臟和腎臟功能無(wú)明顯的保護(hù)作用；Mdivi-1輸液對(duì)大鼠重要器官功能有明顯的保護(hù)作用，尤以心、肝臟更為明顯，可顯著降低大鼠cTnI， AST和ALT水平(圖6)。

A:肌鈣蛋白I；B:谷草轉(zhuǎn)氨酶；C: 谷丙轉(zhuǎn)氨酶；D:血尿素氮；E:血肌酐； a：P<0.05，b: P<0.01，與LR對(duì)照組比較；1：假手術(shù)組；2：休克組；3：LR對(duì)照組；4 ：0.1 mg/kg Mdivi-1組；5: 0.5 mg/kg Mdivi-1組

2.2.5 存活時(shí)間和存活率 在大鼠非控制性出血性休克后低壓復(fù)蘇1 h結(jié)扎止血，與不復(fù)蘇相比，單純LR輸注可延長(zhǎng)大鼠的存活時(shí)間，平均存活時(shí)間為(17.97+18.87)h，但24 h和72 h存活率僅分別為18.75%(3/16)和6.25%(1/16)； Mdivi-1輸注可顯著延長(zhǎng)大鼠存活時(shí)間，0.5 mg/kg Mdivi-1組大鼠平均存活時(shí)間為(49.56±25.37)h，24 h和72 h存活率分別為81.25%(13/16)和50% (8/16)，見(jiàn)圖7。

a: P<0.01，與假手術(shù)組比較；b: P<0.05，c: P<0.01，與LR對(duì)照組比較 1：假手術(shù)組；2：休克組；3：LR對(duì)照組；4：0.1 mg/kg Mdivi-1組；5: 0.5 mg/kg Mdivi-1組

3 討論

戰(zhàn)創(chuàng)傷休克的發(fā)生率和病死率很高，特別是高原環(huán)境下，戰(zhàn)創(chuàng)傷休克后死亡率更高。目前針對(duì)戰(zhàn)創(chuàng)傷休克徹底止血前提出了低壓復(fù)蘇和延遲復(fù)蘇等新策略。但針對(duì)高原環(huán)境戰(zhàn)創(chuàng)傷休克，僅采用常規(guī)液體進(jìn)行低壓復(fù)蘇能否滿(mǎn)足救治的需求，是否有延長(zhǎng)黃金救治時(shí)間窗和保護(hù)器官功能的措施，目前未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)高原環(huán)境戰(zhàn)創(chuàng)傷休克后，大鼠重要器官功能受損，組織氧分壓以及肺腦含水量均有明顯變化，單純采用LR進(jìn)行液體復(fù)蘇，盡管可以一定程度升高血壓，但對(duì)1 h黃金救治時(shí)間窗并未明顯延長(zhǎng)，并且對(duì)大鼠經(jīng)皮氧分壓、器官功能和肺腦含水量無(wú)明顯改善作用。與LR相比，Mdivi-1可顯著改善大鼠經(jīng)皮氧分壓、減輕器官功能損傷、降低肺腦含水量、減少大鼠失血量、延長(zhǎng)大鼠黃金救治時(shí)間窗至3 h左右。研究為高原戰(zhàn)創(chuàng)傷失血休克早期救治提供了全新的措施。

高原環(huán)境由于其低氧、低壓以及高寒等可引起機(jī)體多種反應(yīng)，其中較為嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)肺水腫和腦水腫等，甚至死亡。針對(duì)高原戰(zhàn)創(chuàng)傷休克，以往本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了系列研究，發(fā)現(xiàn)高原戰(zhàn)創(chuàng)傷休克與平原戰(zhàn)創(chuàng)傷休克相比程度更重，易并發(fā)肺腦水腫，對(duì)液體耐受量顯著降低。在此基礎(chǔ)上提出了小容量液體復(fù)蘇，高滲液體復(fù)蘇等液體復(fù)蘇原則與方案。但以往研究表明，單純液體如LR、羥乙基淀粉 (hetastarch，HES)復(fù)蘇，盡管可不同程度擴(kuò)張血容量、提高血壓，但無(wú)攜氧功能，限制了其復(fù)蘇效果。由于高原環(huán)境主要特點(diǎn)為低氧，線(xiàn)粒體作為機(jī)體對(duì)缺氧最敏感、氧利用最多的細(xì)胞器，針對(duì)線(xiàn)粒體尋找高原戰(zhàn)創(chuàng)傷休克新的防治措施對(duì)提高高原戰(zhàn)創(chuàng)傷休克的救治具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)Mdivi-1可延長(zhǎng)黃金救治時(shí)間窗，保護(hù)器官功能，對(duì)高原戰(zhàn)創(chuàng)傷休克有明顯的保護(hù)作用。同時(shí)Mdivi-1顯著降低了徹底止血前的失血量，降低了液體用量，能夠較好的維持MAP在50～60 mmHg。

本研究發(fā)現(xiàn)Mdivi-1可顯著改善高原創(chuàng)傷休克組織氧供，降低肺腦含水量，但目前其機(jī)制尚不清楚。研究表明，高原低氧等可明顯損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致其細(xì)胞間連接破壞或細(xì)胞死亡增加，這也是導(dǎo)致高原低氧肺腦水腫的重要機(jī)制。Mdivi-1可能通過(guò)保護(hù)線(xiàn)粒體功能防止高原休克所致內(nèi)皮細(xì)胞損傷。研究表明，線(xiàn)粒體功能與細(xì)胞功能密切相關(guān)，一方面線(xiàn)粒體為細(xì)胞存活提供基本的能量需求，另一方面線(xiàn)粒體對(duì)細(xì)胞死亡有明顯的調(diào)控，線(xiàn)粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)可釋放細(xì)胞色素C致細(xì)胞凋亡。但Midvi-1具體如何減輕了高原戰(zhàn)傷休克肺腦含水量有待進(jìn)一步研究。

線(xiàn)粒體作為細(xì)胞內(nèi)重要的能量供應(yīng)站，對(duì)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞死亡等均有明顯的調(diào)控作用。正常情況下，線(xiàn)粒體處于不斷分裂融合動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，以保持線(xiàn)粒體正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)量的相對(duì)穩(wěn)定，維持線(xiàn)粒體功能。通過(guò)線(xiàn)粒體分裂，一方面滿(mǎn)足細(xì)胞對(duì)能量的需求，將一個(gè)線(xiàn)粒體分為兩個(gè)線(xiàn)粒體，另一方面可通過(guò)分裂將部分功能損害的線(xiàn)粒體分裂出去，保留正常部分；通過(guò)線(xiàn)粒體融合將兩個(gè)線(xiàn)粒體融合成一個(gè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)線(xiàn)粒體的修復(fù)。研究顯示，細(xì)胞在受低氧、藥物或細(xì)菌刺激后，會(huì)導(dǎo)致其線(xiàn)粒體形態(tài)的改變，其中線(xiàn)粒體過(guò)度分裂是最主要的表現(xiàn)。其機(jī)制可能通過(guò)線(xiàn)粒體分裂蛋白Drp1活化而導(dǎo)致其向線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)位增加而增加線(xiàn)粒體分裂。本研究在以往發(fā)現(xiàn)低氧刺激可導(dǎo)致線(xiàn)粒體過(guò)度分裂基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)Mdivi-1對(duì)高原戰(zhàn)創(chuàng)傷休克具有重要的保護(hù)作用,但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Mdivi-1可顯著延長(zhǎng)大鼠黃金救治時(shí)間窗，減輕器官功能損傷、降低肺腦含水量、提高高原創(chuàng)傷休克大鼠的存活率，可為高原戰(zhàn)創(chuàng)傷休克的早期救治提供新的措施。