周世潔，王 莉，劉良明，李 濤，閆 紅

400042 重慶，陸軍特色醫(yī)學(xué)中心：麻醉科1，戰(zhàn)傷休克與輸血研究室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2

膿毒癥是宿主對感染反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙。長時(shí)間以來，腸道被認(rèn)為在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用，是引起多器官功能障礙綜合征的助推器。膿毒癥時(shí)產(chǎn)生的前炎癥細(xì)胞因子，包括TNF-α、IL-1β等會(huì)引起腸絨毛損傷萎縮、腸上皮細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腸道屏障功能破壞、通透性增加，腸道細(xì)菌及其釋放的內(nèi)毒素進(jìn)入血液循環(huán)，引起腸源性感染，對膿毒癥患者造成致命打擊。因此研究膿毒癥腸道屏障功能保護(hù)措施對提高膿毒癥患者救治率有重要意義。

右美托咪定是一種高效、高選擇性的α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜良好、易喚醒、不引起明顯呼吸抑制、顯著減少患者術(shù)后譫妄等作用，目前廣泛應(yīng)用于重癥和圍術(shù)期患者。近年來研究報(bào)道右美托咪定對膿毒癥引起的器官功能損傷具有保護(hù)作用,但右美托咪定對膿毒癥腸道屏障功能是否具有保護(hù)作用，目前尚不清楚。對此，本研究采用大鼠盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation and puncture，CLP)構(gòu)建膿毒癥模型和LPS處理的細(xì)胞(RAW264.7)模型，觀察右美托咪定對膿毒癥大鼠腸道通透性、前炎癥細(xì)胞因子、腸道病理結(jié)構(gòu)、巨噬細(xì)胞極化等的影響，探究其對膿毒癥大鼠腸道屏障功能的保護(hù)作用及機(jī)制，為膿毒癥治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

成年雄性SPF級SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，由陸軍特色醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。鹽酸右美托咪定注射液購自中國揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司；伊文思藍(lán)(Evans blue, EB)、iNOS抗體購自美國Sigma公司；二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)、腫瘤壞死因子-ɑ(tumour necrosis factor ɑ，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)ELISA試劑盒購自Elabsicence公司；2,6-二異丙基苯胺(2,6-diisopropylaniline,DAPI)購自美國Aabcam公司。

1.2 大鼠膿毒癥模型制備

大鼠術(shù)前12 h禁食，自由飲水。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期報(bào)道的方法，用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔麻醉，制作膿毒癥模型。膿毒癥模型術(shù)后12 h，觀察大鼠平均動(dòng)脈壓(mean arterial blood pressure, MAP)，MAP下降30%及以上，認(rèn)為模型制備成功。

1.3 實(shí)驗(yàn)方案

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組 128只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組32只大鼠。假手術(shù)(Sham)組：僅開腹關(guān)腹，不做盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)；膿毒癥組(sepsis, Sep組)：采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)建立膿毒癥模型；常規(guī)治療組(conventional treatment, Ct組)：在膿毒癥組建模術(shù)后12 h，經(jīng)股靜脈插管輸注林格氏液(35 mL/kg)+血管活性藥物多巴胺(1.75 mg/kg)，輸注速度為2.5 mL/h，同時(shí)肌注抗生素頭孢呋辛納(100 mg/kg)；右美托咪定組(Dex組)：在盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)前30 min，經(jīng)尾靜脈注射右美托咪定(10 μg/kg)，術(shù)后12 h，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上經(jīng)股靜脈輸注右美托咪定(10 μg/kg)。實(shí)驗(yàn)分為3批：第1批(每組16只)用于觀察SD大鼠24 h存活時(shí)間和存活率；第2批(每組8只)在復(fù)蘇完成后用于檢測SD大鼠腸道通透性和小腸病理變化；第3批(每組8只)在復(fù)蘇結(jié)束后用于檢測血漿中前炎癥細(xì)胞因子水平和腸道巨噬細(xì)胞極化情況。

1.3.2 RAW264.7細(xì)胞模型構(gòu)建 將RAW264.7巨噬細(xì)胞分為3組，正常對照(Control)組：PBS清洗培養(yǎng)皿后，更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)組：PBS清洗培養(yǎng)皿后，更換為無血清培養(yǎng)基，并加入500 ng/mL LPS處理12 h；Dex組：PBS清洗培養(yǎng)皿后，替換為無血清培養(yǎng)基，然后給予1 μmol/L右美托咪定，待30 min后,再加入500 ng/mL LPS處理12 h。實(shí)驗(yàn)前1 d將RAW264.7細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿細(xì)胞數(shù)為1×10/mL。取細(xì)胞上清液用于測定細(xì)胞上清液中前炎癥細(xì)胞因子(TNF-α)水平。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 存活時(shí)間和存活率 膿毒癥大鼠復(fù)蘇完成后，拔出股靜脈插管同時(shí)結(jié)扎血管，并逐層縫合傷口。然后將大鼠放回籠中正常飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，每30 min觀察1次，直至復(fù)蘇后24 h，記錄大鼠的存活時(shí)間和存活率。

1.4.2 腸道通透性 為觀察右美托咪定對膿毒癥大鼠腸屏障功能的保護(hù)作用，分別采用EB灌注腸腔測定腸組織的通透性和取靜脈血檢測DAO含量，觀察腸道通透性。膿毒癥大鼠復(fù)蘇完成后，取靜脈血1 mL，室溫下靜置30 min，3 500 r/min 離心10 min，取上層血清，ELISA試劑盒檢測血中DAO含量。另取一段長約7 cm的小腸，用PBS沖洗干凈腸腔并制備成腸囊，注入0.2 mL 1.5% 的EB溶液，37 ℃水浴30 min，打開腸囊，PBS沖洗至沖洗液澄清后50 ℃干燥24 h，記錄腸干質(zhì)量，加入甲酰胺溶液于50 ℃孵育24 h，用酶標(biāo)儀檢測上清，讀取波長650 nm處的光密度值，根據(jù)

D

(650)值計(jì)算腸組織中EB含量。

1.4.3 腸組織病理結(jié)構(gòu) 膿毒癥大鼠復(fù)蘇完成后，將其麻醉固定，開腹，取一段腸組織用PBS沖洗干凈后，置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水、包埋、切片、HE染色，用光學(xué)顯微鏡觀察腸組織病理結(jié)構(gòu)情況。

1.4.4 血清前炎癥細(xì)胞因子 復(fù)蘇完成后，經(jīng)靜脈取血2 mL，室溫下靜置30 min，3 500 r/min 離心10 min，取上層血清，采用ELISA法檢測大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量。

1.4.5 免疫熒光觀察腸道巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá) 復(fù)蘇完成后，將大鼠麻醉固定開腹，取一段腸組織，用冰PBS沖洗腸腔，放入4%多聚甲醛中固定24 h，20%蔗糖脫水24 h后，換用30%蔗糖脫水24 h，待樣本沉底后，用OCT包埋，做冰凍切片(切片厚度為20 μm)。PBS洗滌3次，每次5 min，3%過氧化氫處理10 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加羊血清室溫下封閉30 min，吸去多余液體，滴加稀釋的一抗(iNOS，1∶200)，4 ℃過夜，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加與一抗相對于的熒光二抗，室溫下避光孵育1 h，PBS洗滌3次，每次5 min，DAPI(1∶50)37 ℃避光反應(yīng)10 min，PBS洗滌3次，每次5 min。在Leica激光共聚焦顯微鏡下觀察iNOS的表達(dá)。

1.4.6 免疫熒光觀察離體巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá) 將RAW264.7細(xì)胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿，待細(xì)胞生長良好后，棄培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加羊血清室溫下封閉30 min，吸去多余液體，滴加稀釋的一抗(iNOS，1∶200)，4 ℃過夜，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加與一抗相對于的熒光二抗，室溫下避光孵育1 h，PBS洗滌3次，每次5 min，DAPI(1∶50)37 ℃避光反應(yīng)10 min，PBS洗滌3次，每次5 min。在Leica激光共聚焦顯微鏡下觀察iNOS的表達(dá)。

1.4.7 細(xì)胞上清前炎癥細(xì)胞因子水平檢測 收集各組細(xì)胞上清液，依據(jù)ELISA試劑盒方法檢測細(xì)胞上清液中TNF-α含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，存活時(shí)間和存活率用Kaplan-Meier法分析。

P

<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 右美托咪定對膿毒癥大鼠存活時(shí)間和存活率的影響

膿毒癥組大鼠24 h存活1只，存活率為6.25%，存活時(shí)間為(5.70±6.36)h；常規(guī)液體治療組大鼠24 h存活2只，存活率為12.50%，存活時(shí)間為(10.10±7.80)h，與膿毒癥組相比，存活時(shí)間有所增加；右美托咪定治療組大鼠24 h存活6只，存活率為37.50%，存活時(shí)間為(18.30±5.80)h,存活率較常規(guī)治療組顯著提高，存活時(shí)間明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05，圖1)。

a:P<0.01，與Sham組比較；b:P<0.05，與Ct組比較; c:P<0.01，與Sep組比較

2.2 右美托咪定對膿毒癥大鼠腸道通透性的影響

EB灌注腸腔結(jié)果發(fā)現(xiàn)：膿毒癥后大鼠腸組織滲漏明顯，與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01)；常規(guī)液體治療后，腸道屏障功能有部分改善；經(jīng)右美托咪定治療后，膿毒癥大鼠腸屏障功能明顯改善，與常規(guī)治療組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01，圖2A)。假手術(shù)組大鼠血中DAO含量為(0.34±0.04)ng/mL，與假手術(shù)組比較，膿毒癥組大鼠血中DAO含量明顯增加，為(6.32±0.83)ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01)；常規(guī)治療組大鼠血中DAO含量為(5.89±1.01)ng/mL，與膿毒癥組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)；右美托咪定可明顯降低血中DAO含量，其值為(4.47±0.81)ng/mL，與常規(guī)治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)(圖2B)。

a:P<0.01，與Sham組比較；b:P<0.05，與Ct組比較； c:P<0.01，與Sep組比較

2.3 右美托咪定對膿毒癥大鼠腸組織結(jié)構(gòu)的影響

腸組織HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠腸絨毛結(jié)構(gòu)完整清晰,柱狀上皮細(xì)胞排列整齊，未見紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤；膿毒癥組腸絨毛萎縮、斷裂，紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤明顯；常規(guī)治療組未見明顯改善；右美托咪定治療后，腸絨毛萎縮情況明顯好轉(zhuǎn)，腸絨毛排列整齊，紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤減少，腸組織結(jié)構(gòu)顯著恢復(fù)，提示右美托咪定改善了膿毒癥大鼠腸病理損傷(圖3)。

A: Sham組；B：Sep組；C：Ct組；D：Dex組

2.4 右美托咪定對膿毒癥大鼠血前炎癥細(xì)胞因子水平的影響

與假手術(shù)組相比，膿毒癥組大鼠血清前炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01)；常規(guī)治療組大鼠血清前炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β有一定程度下降，與膿毒癥組相比，降低比例為10.56%，無顯著性差異(

P

>0.05)；右美托咪定治療后，大鼠血清前炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β下降明顯，與膿毒癥組比較，降低比例為33.93%，與常規(guī)治療組相比，降低比例為26.13%(

P

<0.01)，見圖4。

a: P<0.01，與Sham組比較；b: P<0.01,與Ct組比較； c： P<0.01，與Sep組比較

2.5 右美托咪定對M1型巨噬細(xì)胞的影響

腸道巨噬細(xì)胞極化類型的免疫熒光染色結(jié)果提示：Dex能抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化(圖5)。膿毒癥組大鼠腸道巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)增加，提示膿毒癥后腸道巨噬細(xì)胞M1型的數(shù)量增多；與膿毒癥組相比，常規(guī)治療組大鼠腸道巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)未見明顯減少；右美托咪定組大鼠腸道巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)則明顯減少，提示M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量減少。RAW264.7細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：LPS刺激后，RAW264.7細(xì)胞iNOS明顯增多、TNF-α分泌顯著增加(

P

<0.01)，經(jīng)右美托咪定處理后，RAW264.7細(xì)胞iNOS表達(dá)和TNF-α水平均明顯降低(

P

<0.05)，見圖6、7。說明右美托咪定可抑制巨噬細(xì)胞M1表型， 抑制前炎癥細(xì)胞因子釋放。

圖5 免疫熒光觀察腸道巨噬細(xì)胞iNOS的表達(dá)

圖6 免疫熒光觀察離體巨噬細(xì)胞iNOS的表達(dá)

a:P<0.01，與Control組比較；b:P<0.05,與LPS組比較

3 討論

膿毒癥表現(xiàn)為機(jī)體對感染的免疫反應(yīng)失調(diào)，具有很高的發(fā)病率和死亡率，是重癥監(jiān)護(hù)病房住院患者死亡常見原因之一，腸道屏障功能受損在膿毒癥病程發(fā)展中具有重要作用。膿毒癥后腸道通透性明顯增加，腸道內(nèi)有毒物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)一步加重膿毒癥病情的發(fā)展。

右美托咪定是臨床常用的麻醉鎮(zhèn)靜藥物，近年來越來越多的研究表明右美托咪定對器官功能具有保護(hù)作用。SHE等發(fā)現(xiàn)右美托咪定對膿毒癥大鼠血管內(nèi)皮屏障具有保護(hù)作用，其機(jī)制與保護(hù)線粒體功能有關(guān)。ZHANG等發(fā)現(xiàn)右美托咪定能增加腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的表達(dá)并減少細(xì)胞凋亡，改善腸道損傷。右美托咪定對膿毒癥器官功能的保護(hù)作用與它能抑制炎癥有關(guān)，MEI等證實(shí)Dex可顯著抑制膿毒癥大鼠炎癥反應(yīng)而改善腦功能。本研究發(fā)現(xiàn)：膿毒癥大鼠血清前炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β明顯增加，而右美托咪定可顯著降低上述炎癥細(xì)胞因子水平，改善腸道屏障功能，提高膿毒癥大鼠的存活率和存活時(shí)間。但右美托咪定是如何降低膿毒癥后腸道炎癥反應(yīng)的呢？

巨噬細(xì)胞是一種異質(zhì)性極強(qiáng)的免疫細(xì)胞，不同病理刺激條件下巨噬細(xì)胞會(huì)極化為不同的類型，在機(jī)體炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。巨噬細(xì)胞極化類型主要包括經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(M1)和交替激活的巨噬細(xì)胞(M2)。M1型巨噬細(xì)胞主要由脂多糖(LPS)活化，分泌促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β)，在膿毒癥過度炎癥期激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答，引起免疫功能紊亂；M2型巨噬細(xì)胞則主要由IL-4、干擾素γ(interferon-γ, IFN-γ)激活，釋放抗炎因子IL-10等限制炎癥，促進(jìn)組織修復(fù)以及受傷區(qū)域的愈合。本研究選取腸道巨噬細(xì)胞作為研究對象，探究Dex對M1型巨噬細(xì)胞極化的影響。整體實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Dex能顯著降低促炎因子TNF-α、IL-β釋放，抑制腸道巨噬細(xì)胞的M1極化，M1型標(biāo)志物iNOS，TNF-α表達(dá)減少。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Dex能抑制RAW264.7細(xì)胞向M1型極化、降低炎癥細(xì)胞因子的水平。研究結(jié)果提示，Dex在膿毒癥中發(fā)揮的抑炎效應(yīng)，可能與其抑制巨噬細(xì)胞向M1極化相關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定對膿毒癥引起的腸道屏障功能損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與右美托咪定抑制腸道巨噬細(xì)胞向M1型極化，降低炎癥反應(yīng)有關(guān)。這在一定程度上闡釋了Dex通過抑炎效應(yīng)發(fā)揮對器官功能保護(hù)作用的機(jī)制，為膿毒癥的器官功能保護(hù)提供防治措施。但Dex是否會(huì)促進(jìn)腸道巨噬細(xì)胞向M2型極化，以及Dex如何調(diào)控巨噬細(xì)胞極性的機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。