郭寧珂，佘 漢，譚 磊，周遠(yuǎn)群，彭小勇，李 濤，劉良明

453000 河南 新鄉(xiāng)，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院外科1； 400042 重慶，陸軍特色醫(yī)學(xué)中心戰(zhàn)傷休克與輸血研究室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2

膿毒癥(sepsis)是人體對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的器官功能障礙，是ICU中常見(jiàn)的危重病癥，其發(fā)生率和病死率均很高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年有300萬(wàn)膿毒癥患者，約100萬(wàn)人死于膿毒癥，迄今為止，膿毒癥仍然是人類(lèi)生命安全的巨大威脅。腸屏障功能在膿毒癥發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。正常情況下，腸道屏障能夠有效阻斷病原體進(jìn)入內(nèi)環(huán)境，膿毒癥時(shí)，腸道屏障被破壞，可導(dǎo)致腸道內(nèi)菌群及內(nèi)毒素移位，加重膿毒癥的進(jìn)程，并引起多器官功能障礙甚至死亡。目前關(guān)于腸屏障功能保護(hù)在膿毒癥的治療中越來(lái)越受到關(guān)注，保護(hù)腸道屏障，降低腸通透性對(duì)于膿毒癥的防治具有重要的臨床意義。目前針對(duì)膿毒癥的常規(guī)治療措施主要包括液體復(fù)蘇、抗感染、抗凝等，但對(duì)腸屏障功能的保護(hù)效果并不顯著，因此亟待尋找能夠有效保護(hù)膿毒癥腸屏障功能的新方法。

近年來(lái)中藥對(duì)膿毒癥器官功能的保護(hù)作用引起廣泛的關(guān)注，小白菊內(nèi)酯(

parthenolide

，PTL)是從中藥野甘菊中提純的倍半萜內(nèi)酯化合物，屬于萜類(lèi)化合物，其來(lái)源豐富，價(jià)格低廉，同時(shí)具有廣泛的藥理和生物活性。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，PTL具有良好的抗炎效果，對(duì)心臟缺血再灌注損傷、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病具有重要的保護(hù)作用。同時(shí)，有研究報(bào)道，PTL可顯著改善膿毒癥大鼠的低血壓。然而，PTL對(duì)膿毒癥大鼠腸屏障功能是否具有保護(hù)作用，尚不清楚。為此本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation and puncture，CLP)復(fù)制膿毒癥大鼠模型，觀察小白菊內(nèi)酯對(duì)膿毒癥大鼠腸道屏障功能的影響，為膿毒癥的防治尋找新的措施。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

成年SPF級(jí)SD大鼠，雌雄不拘，體質(zhì)量(200±20)g，由陸軍特色醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物飼養(yǎng)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵循動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定。PTL(美國(guó)Santa Cruz公司)，伊文思藍(lán)(Evans blue，EB)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、D-乳酸、白介素-6(IL-6) 的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特(Elabscience)生物科技股份有限公司。

1.2 膿毒癥大鼠模型制備

大鼠用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，消毒殺菌剪開(kāi)腹腔，取出盲腸，將糞便搟至末端，結(jié)扎，用錐形器刺穿使糞便漏出，將盲腸還納回腹腔，縫合傷口，腹腔注射5 mL生理鹽水，放回籠中飼養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方案

將96只大鼠隨機(jī)分成6組：正常對(duì)照(Normal)組、膿毒癥(Sep)組、常規(guī)治療(LR)組和小白菊內(nèi)酯1、5、10 mg/kg組(PTL組)。膿毒癥組：采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制作膿毒癥模型；常規(guī)治療組：在膿毒癥模型制作12 h后，經(jīng)股靜脈輸注乳酸林格氏35 mL/kg+多巴胺5～10 μg/(kg·min)，輸注3 h，同時(shí)肌注頭孢呋辛鈉100 mg/kg，維持平均動(dòng)脈壓(mean arterial blood pressure, MAP)>70 mmHg；小白菊內(nèi)酯組：在CLP建立前30 min尾靜脈給予小白菊內(nèi)酯(1、5、10 mg/kg)，膿毒癥模型制作12 h后，在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上給予1、5、10 mg/kg小白菊內(nèi)酯。每組16只用于觀察大鼠存活時(shí)間和存活率變化，其中8只用于觀察大鼠的血壓。

根據(jù)大鼠存活率、存活時(shí)間和動(dòng)脈血壓確立PTL最佳濃度。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將32只大鼠隨機(jī)分成4組：正常對(duì)照(Normal)組、膿毒癥(Sep)組、常規(guī)治療(LR)組和小白菊內(nèi)酯(PTL 5 mg/kg)組，每組8只，檢測(cè)腸組織伊文思藍(lán)(Evans blue， EB)含量、血D-乳酸水平、血炎癥細(xì)胞因子水平、肝腎功能的變化。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 大鼠存活情況觀察 待液體復(fù)蘇結(jié)束后，拔出大鼠股靜脈插管并結(jié)扎，然后縫合傷口。將大鼠回籠飼養(yǎng)，正常飲食飲水，每小時(shí)觀察1次，觀察至復(fù)蘇后48 h，記錄大鼠的存活時(shí)間和狀態(tài)。

1.4.2 腸組織EB含量測(cè)定 正常大鼠用30 mg/kg，其余各組用15 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，打開(kāi)腹腔，截取一段小腸，制備成腸囊，往腸囊中注射EB，沖洗腸腔至沖洗液澄清，烤干加入甲酰胺溶液在酶標(biāo)儀上650 nm處測(cè)定光密度值[

D

(650)]，計(jì)算出每克腸干質(zhì)量所含EB含量，反映腸道通透性。1.4.3 血D-乳酸濃度檢測(cè) CLP12 h 后，取大鼠腹主動(dòng)脈血2 mL，室溫下靜置20 min，1 000×

g

離心20 min，取上層血清，在酶標(biāo)板條的各孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，加入酶工作液，再加入顯色劑37 ℃孵育10 min，加入終止液，酶標(biāo)儀上振5 s，于波長(zhǎng)530 nm處用比色法測(cè)定光密度值[

D

(530)]，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算D-乳酸濃度，反映腸道通透性。1.4.4 血炎癥細(xì)胞因子水平的測(cè)定 CLP 12 h 后，抽取大鼠腹主動(dòng)脈血2 mL，室溫下靜置20 min，1 000×

g

離心20 min，取上層血清，在酶標(biāo)板條的各孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，37 ℃孵育90 min，倒去孔內(nèi)液體，加入生物素化抗體工作液，37 ℃孵育60 min，洗滌3次，加入酶結(jié)合工作液，37 ℃孵育30 min，洗滌5次，加入底物溶液，37 ℃孵育15 min，加入終止液，在適宜波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值，分別制作標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算各組大鼠血液所含IL-6、IL-1β濃度。

1.4.5 大鼠小腸HE染色 大鼠腹腔麻醉固定，腹部開(kāi)口，截取距胃端6～7 cm腸段，在冰的PBS溶液中沖洗表面血跡，4%多聚甲醛溶液固定48～72 h。固定時(shí)間結(jié)束取出腸組織，切成2～3 mm厚的小塊，放置脫水盒中慢速水流沖洗過(guò)夜，再進(jìn)行透明、浸蠟及包埋、切片、染色操作，封片晾干后在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.6 肝腎功能的檢測(cè) CLP 12 h 后，取大鼠腹主動(dòng)脈血2 mL，室溫下靜置20 min，1 000×

g

離心20 min應(yīng)用生化自動(dòng)分析儀檢測(cè)谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、尿素氮(urea nitrogen，Urea)、肌酐(creatinine，Crea)等指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，

P

<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTL對(duì)膿毒癥大鼠存活率和存活時(shí)間的影響

膿毒癥組大鼠48 h存活率為0，常規(guī)治療組大鼠48 h存活1只，存活率為6.2%，平均存活16 h；PTL 1 mg/kg組大鼠48 h存活2只，存活率為12.5%，平均存活時(shí)間為20 h；PTL 5 mg/kg組大鼠48 h存活8只，存活率為50%，平均存活時(shí)間為34 h；PTL 10 mg/kg組大鼠48 h存活4只，存活率為25%，平均存活時(shí)間24 h；PTL 10 mg/kg組大鼠48 h存活率不升反降，可能是由于藥物濃度增高時(shí)毒性增強(qiáng)所致(圖1)，提示PTL的最佳治療濃度為5 mg/kg。

a：P<0.05，與LR組比較；b：P<0.05，PTL 5 mg/kg組比較

2.2 PTL對(duì)膿毒癥大鼠MAP的影響

膿毒癥組大鼠MAP降低，常規(guī)治療組大鼠MAP較膿毒癥組有所升高。與常規(guī)治療組相比，PTL 1 mg/kg組大鼠MAP升高幅度不明顯，PTL 5 mg/kg和10 mg/kg組能夠顯著升高膿毒癥大鼠MAP，且PTL 5 mg/kg組MAP高于10 mg/kg組(圖2)。提示PTL可顯著提高膿毒癥大鼠平均動(dòng)脈血壓，最適濃度為5 mg/kg，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用PTL 5 mg/kg。

a: P<0.05，與LR組比較

2.3 PTL對(duì)膿毒癥大鼠腸屏障功能的保護(hù)作用

以EB檢測(cè)腸屏障功能，結(jié)果顯示膿毒癥組大鼠小腸表面顏色最深，提示EB滲漏最多。正常對(duì)照組大鼠小腸EB滲漏少，表面顏色淺，提示腸屏障功能好。PTL治療后，大鼠腸屏障功能有所改善，EB滲漏減少。PTL 5 mg/kg組EB含量較常規(guī)治療組降低了55.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05，圖3B)。D-乳酸是腸道內(nèi)細(xì)菌代謝及酵解的產(chǎn)物，是反映腸屏障功能的重要指標(biāo)。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，膿毒癥組血D-乳酸濃度平均增加比例為93.6%；與膿毒癥組相比，常規(guī)治療組血D-乳酸濃度降低了74.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；與常規(guī)治療組相比，PTL5 mg/kg組血D-乳酸濃度降低了69.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05，圖3C)。膿毒癥組大鼠腸上皮細(xì)胞脫落、大量炎性細(xì)胞聚集，腺體結(jié)構(gòu)破壞，腸道絨毛結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞脫落；正常對(duì)照組小腸黏膜組織形態(tài)正常，PTL5 mg/kg組腸上皮結(jié)構(gòu)完整性、絨毛結(jié)構(gòu)、上皮細(xì)胞壞死等較膿毒癥組有明顯改善(圖3D)。

a：P<0.05，與Normal組比較；b：P<0.05，與LR組比較

2.4 PTL對(duì)膿毒癥大鼠血炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-1β水平的影響

膿毒癥組大鼠血中IL-6、IL-1β水平較正常對(duì)照組顯著升高(

P

<0.05，圖4)；常規(guī)治療組大鼠血IL-6濃度較膿毒癥組降低了76.0%；PTL 5 mg/kg組IL-6濃度進(jìn)一步降低，較常規(guī)治療組降低了93.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05，圖4A)。膿毒癥大鼠血IL-1β濃度在常規(guī)治療后下降7.8%；給予PTL治療后，IL-1β濃度顯著降低，較常規(guī)治療組下降了62.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05，圖4B)。表明PTL可以顯著抑制炎癥細(xì)胞因子釋放，抑制炎癥反應(yīng)。

a：P<0.05，與Normal組比較；b：P<0.05，與LR組比較 A： IL-6；B： IL-1β

2.5 PTL對(duì)膿毒癥大鼠肝腎功能的影響

膿毒癥組大鼠AST、ALT水平較正常對(duì)照組顯著增加，常規(guī)治療組AST和ALT較膿毒癥組顯著降低， 分別降低了30.4%和38.6%(

P

<0.05)； PTL 5 mg/kg組AST和ALT進(jìn)一步下降，較常規(guī)治療組分別降低了24.6%和28.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05，圖5A、B)。膿毒癥組大鼠尿素氮和肌酐水平較正常對(duì)照組顯著增加，常規(guī)治療組大鼠尿素氮和肌酐水平較膿毒癥組有所下降，分別下降了27.1%和 20.6%，PTL 5 mg/kg組大鼠尿素氮和肌酐水平進(jìn)一步降低，較常規(guī)治療組分別降低了25.6%和27.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05，圖5C、D)。結(jié)果提示PTL可以減輕膿毒癥時(shí)肝、腎功能的損傷。

a：P<0.05，與Normal組比較；b：P<0.05，與LR組比較 A： ALT；B： AST；C： Crea；D： Urea

3 討論

膿毒癥時(shí)由于腸屏障功能受損，導(dǎo)致腸道菌群易位，可加重膿毒癥和失控炎癥反應(yīng)，并最終導(dǎo)致多器官功能衰竭。為了尋找有效的保護(hù)膿毒癥腸屏障功能方法，本實(shí)驗(yàn)利用CLP膿毒癥大鼠模型研究了小白菊內(nèi)酯PTL對(duì)腸屏障功能的保護(hù)作用。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTL對(duì)膿毒癥大鼠腸道屏障功能具有明顯的保護(hù)作用，可明顯降低膿毒癥大鼠的腸道通透性，降低膿毒癥大鼠血液炎癥細(xì)胞因子水平，保護(hù)其重要器官功能，提高膿毒癥大鼠存活率。PTL對(duì)膿毒癥大鼠腸屏障功能的保護(hù)作用可能與其抗炎作用有關(guān)。

腸道被認(rèn)為是多器官功能衰竭的“中心器官”，膿毒癥、創(chuàng)傷后腸道屏障功能受損，腸通透性增加，引起腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素易位，嚴(yán)重?fù)p害各器官功能，最終導(dǎo)致多器官功能衰竭(MODS)。此外，腸道免疫系統(tǒng)的完整性和調(diào)節(jié)功能是宿主防御對(duì)抗外來(lái)物的基礎(chǔ)，在膿毒癥過(guò)程中，腸道免疫功能失常，中性粒細(xì)胞被激活、大量炎性因子產(chǎn)生、氮氧反應(yīng)物質(zhì)釋放增加炎癥反應(yīng)。PTL是一種倍半萜類(lèi)化合物，具有顯著的抗炎作用，對(duì)缺血再灌注和自身免疫性腦脊髓炎有良好拮抗作用。本研究發(fā)現(xiàn)，PTL對(duì)膿毒癥大鼠腸屏障功能有良好保護(hù)作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其對(duì)膿毒癥大鼠肝腎功能也有很好的保護(hù)作用，具有很好的抑制炎癥反應(yīng)作用，可顯著抑制膿毒癥大鼠細(xì)胞因子釋放。

研究表明PTL可阻斷NF-κB信號(hào)通路。PTL獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)能抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、STATS、JNK，NF-κB的過(guò)度激活是膿毒癥患者預(yù)后不良的標(biāo)志，可通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抑制過(guò)度炎癥，抑制多器官功能障礙的發(fā)生發(fā)展。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，IκB激酶可磷酸化降解，導(dǎo)致NF-κB激活。PTL可阻斷IκB蛋白的磷酸化和降解，下調(diào)磷酸化NF-κB p65的表達(dá)。因此，我們推測(cè)PTL可能通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路，減少炎性因子釋放，改善膿毒癥的腸通透性。當(dāng)然，PTL保護(hù)膿毒癥大鼠腸道屏障功能的具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究闡明。

本研究結(jié)果證實(shí)，PTL可以降低膿毒癥大鼠腸道通透性、保護(hù)腸屏障功能，其機(jī)制可能與其抑制炎癥因子釋放有關(guān)。但PTL對(duì)膿毒癥大鼠腸屏障功能保護(hù)的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究闡明；而PTL在大動(dòng)物和人膿毒癥是否有同樣效果亦需要進(jìn)一步研究證實(shí)。