郭 巖，馬 建，楊宗政，張?zhí)煊睿瑢O 煒，吳志國

（1.天津津港基礎(chǔ)設(shè)施養(yǎng)護(hù)運(yùn)營(yíng)工程管理有限公司，天津 300456；2.天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津 300457；3.天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院，天津 300457）

0 引言

石油作為運(yùn)輸業(yè)重要的動(dòng)力燃料，其產(chǎn)量與需求量逐年提高。石油生產(chǎn)、儲(chǔ)存及使用等過程中難免會(huì)泄露于外界環(huán)境中[1]，因其具有成分復(fù)雜、難降解等特點(diǎn)，長(zhǎng)期滯留于環(huán)境中會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的水、土環(huán)境污染[2,3]。石油中包含多種不同的正構(gòu)、異構(gòu)烷烴、多環(huán)芳烴等[4-5]，在眾多石油烴污染的修復(fù)方法中，生物修復(fù)法是清除環(huán)境中石油烴污染物最經(jīng)濟(jì)、有效的方法，能夠通過微生物的特異性代謝作用將石油烴轉(zhuǎn)化成無毒的終產(chǎn)物[6-8]。具有石油烴降解能力的菌株種類繁多，但其中有關(guān)分枝桿菌屬的報(bào)道相對(duì)較少，且大多只針對(duì)多環(huán)芳烴類石油烴進(jìn)行了研究。例如，劉沙沙等[9]發(fā)現(xiàn)微黃分枝桿菌對(duì)芘有著良好的增溶與降解作用。Wu等[10]發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌能夠在以芴和蒽為唯一碳源的培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)并起到良好的降解作用。Sun等[11]發(fā)現(xiàn)嗜芳族分枝桿菌可通過雙加氧酶降解菲。現(xiàn)有研究大多只報(bào)道了分枝桿菌的多環(huán)芳烴降解能力，對(duì)柴油類石油烴的降解研究鮮有報(bào)道，因此針對(duì)分枝桿菌進(jìn)行柴油的降解研究對(duì)該菌屬的降解多樣性具有重要的推動(dòng)作用。

本研究基于含油污泥篩選得到一株柴油降解菌Mycolicibacterium fluoranthenivoransY3，并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，考察菌株的生長(zhǎng)特性及以柴油為底物的條件下菌株的柴油耐受程度和降解特性，通過GC-MS進(jìn)一步研究其降解能力與機(jī)制，研究結(jié)果可推進(jìn)分枝桿菌屬對(duì)石油烴降解的多樣性并為石油烴污染的原位修復(fù)提供重要種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料與培養(yǎng)基

柴油為車用0#柴油，石油醚為國產(chǎn)分析純，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）分析用試劑為高效液相色譜純，分子生物學(xué)試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

菌種篩選材料取自天津港南疆污水處理廠（38.97°N，117.77°E），該污水處理廠進(jìn)水常年以港口、船舶含油污水及生活污水為主，污水中所含石油主要為柴油、燃料油等，污水經(jīng)斜板隔油+混凝沉淀處理后得到的含油污泥置于曬泥場(chǎng)晾曬，取曬泥場(chǎng)0～10 cm深處油泥作為菌種篩選材料。

（1）無機(jī)鹽培養(yǎng)基：NaCl 1 g，NH4Cl 1.34g，K2HPO41.5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g， 1L去離子水，pH 7.0（固體培養(yǎng)基加20 g/L瓊脂）。

（2）柴油培養(yǎng)基：無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加1%（V/V）柴油。

（3）LB培養(yǎng)基：含牛肉膏5 g，蛋白胨10 g， NaCl 5 g，pH為7.0（固體培養(yǎng)基加20 g/L瓊脂）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 柴油降解菌的篩選

從天津港南疆污水處理廠采集含油污泥作為菌株篩選材料，稱取5 g油泥樣品制成油泥水混合液，將其按5%（V/V）接種量加入到柴油含量為0.5%（V/V）的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，置于30℃搖床上以180 r/min的轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)3～5 d，待培養(yǎng)液明顯渾濁后，將培養(yǎng)液以5%（V/V）接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的柴油培養(yǎng)基中（柴油濃度依次為：1%、2%、3%），如此共富集培養(yǎng)三輪，取完成富集的菌液梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4，10-5、10-6，各吸取200 μL稀釋后菌液均勻涂布于含柴油的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基（無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基表面均勻涂布 200 μL柴油）中，30℃培養(yǎng)2～3 d，挑取不同菌落形態(tài)的單菌落連續(xù)純化3次，得到若干株細(xì)菌，分別接種于柴油培養(yǎng)基中，5 d后測(cè)定柴油的降解率，選擇對(duì)柴油降解率最高的菌株命名為Y3（初步柴油降解率為42.5%）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

菌落的生長(zhǎng)狀況、菌株的形態(tài)特征以及菌株的生理生化測(cè)試按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步判定，并采用掃描電鏡（JSMIT300LV）在10000倍下觀察Y3形態(tài)。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定

采用16S rDNA序列分析方法鑒定Y3菌株，由金唯智生物科技有限公司完成測(cè)序工作，測(cè)序結(jié)果用NCBI Blast程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募﨨CBI中的已知序列進(jìn)行同源性比對(duì)，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并在Genebank申請(qǐng)16S rDNA保藏號(hào)。

1.2.4 種子液的獲取

取保存菌種，于LB平板劃線，30℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種于20 mL LB培養(yǎng)基中，于30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h。

1.2.5 菌株的生長(zhǎng)特性研究

將種子液以5%接種量接種至LB培養(yǎng)基中，考察在不同初始pH（5、6、7、8、9）、不同溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）、不同NaCl濃度（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L）、不同金屬離子（Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Ni2+各 50 mg/L）等因素對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。各個(gè)試驗(yàn)中的固定條件為：pH=7、溫度為30℃、無NaCl、無金屬離子，NaCl與金屬離子不作為生長(zhǎng)特性試驗(yàn)的主要條件。實(shí)驗(yàn)中以不接菌的LB培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，測(cè)定菌株的OD600表征菌量。

1.2.6 柴油降解曲線

將種子液以5%（V/V）的接種量接種于柴油培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)7 d，以不接菌的柴油培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定菌株的OD600及柴油降解率。

1.2.7 接種量對(duì)柴油降解效果的影響

將種子液分別以1%、3%、5%、10%、15%（V/V）的接種量接種于柴油培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)5d，以不接菌的柴油培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定菌株的OD600及柴油降解率。

1.2.8 不同條件對(duì)菌株Y3降解柴油的影響

將種子液以5%接種量接種至柴油培養(yǎng)基中，考察不同柴油濃度（0.5%、1%、2%、3%）、初始pH（5、6、7、8、9）、溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）、外加碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、碳酸鈉、乙酸鈉，投加濃度均為100 mg/L）、氮源（氯化銨、酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸鈉，投加濃度均為1.34 g/L）等因素對(duì)菌株生長(zhǎng)和降解效果的影響。各個(gè)試驗(yàn)中的固定條件為：柴油濃度1%（V/V）、pH=7、溫度為30℃，碳氮源為外加條件，不作為降解試驗(yàn)的主要條件。以不接菌的柴油培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，測(cè)定菌株的OD600及柴油降解率。

1.2.9 菌株Y3降解柴油的組分分析

將種子液以5%接種量接種至柴油培養(yǎng)基，在最優(yōu)條件下（柴油濃度1%（V/V）、30℃、pH=6）培養(yǎng)5 d，利用正己烷萃取最終發(fā)酵液中柴油等有機(jī)組分，在萃取液中加入無水硫酸鈉直至不再結(jié)塊，取上清液適當(dāng)稀釋，于氣相色譜-質(zhì)譜儀測(cè)定發(fā)酵液成分。

1.3 分析測(cè)定方法

1.3.1 柴油的測(cè)定

以石油醚為萃取劑，采用液液萃取的方法，萃取無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中的柴油，并采用紫外分光光度法在225 nm處測(cè)定其濃度[12]。按式（1）計(jì)算柴油降解率。

式中：C0—空白培養(yǎng)基柴油的濃度；C1—實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基柴油的濃度。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜儀分析條件

氣相色譜條件（GCMS-QP2020）：色譜柱Rxi-5Sil（0.25 mm×30 m×0.25 μm）；進(jìn)樣量 1 μL，不分流；柱溫升溫程序：40℃保持5 min，以10℃/min升至290℃，保持10 min，再以15℃/min升至310℃，保持2 min。

質(zhì)譜條件：EI源，離子源溫度220℃，接口溫度200℃。溶劑延遲時(shí)間2.5 min，掃描范圍35～500 amu，自動(dòng)調(diào)諧。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定

通過柴油培養(yǎng)基培養(yǎng)、篩選和分離，純化得到1株高效柴油降解菌株Y3。通過革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)確定菌株Y3為革蘭氏陰性菌，其菌落形態(tài)為圓形，白色，表面濕滑不透明，邊緣整齊，其生理生化特性見表1，掃描電鏡照片及菌落形態(tài)特征如圖1所示。

圖1 菌株Y3形態(tài)圖

表1 菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以菌株Y3的DNA為模板，利用通用引物擴(kuò)增得到1387 bp的16S rRNA基因片段。通過在基因序列數(shù)據(jù)庫中的比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)其與Mycolicibacterium fluoranthenivoransFA-4的同源性達(dá)99.78%。將Y3與分枝桿菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析如圖2所示，菌株Y3的16S rRNA基因序列GenBank登陸號(hào)為OM149383。

圖2 菌株Y3基于16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2 菌株的生長(zhǎng)特性

不同溫度、pH、NaCl濃度、金屬離子對(duì)菌株Y3生長(zhǎng)的影響，如圖3所示。

菌株Y3在20～40℃的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)較好，30℃獲得了最佳生長(zhǎng)，屬于中溫菌（圖3-a）。在6.0～8.0的pH范圍內(nèi)菌株生長(zhǎng)良好，pH =6.0條件下菌株獲得最佳生長(zhǎng)，pH=5.0的條件下菌株生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，說明菌株Y3適宜在中性偏酸性的環(huán)境中生存（圖3-b）。Y3在鹽度范圍為3%以內(nèi)均可生長(zhǎng)，具有良好的耐鹽性（圖3-c）。菌株Y3在50 mg/L的Zn2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+條件下均能生長(zhǎng)，與對(duì)照組相比Co2+完全抑制了菌株的生長(zhǎng)，Ni2+、Zn2+、Cu2+的抑制作用相對(duì)較弱，Mn2+則無明顯的抑制作用（圖3-d）。

圖3 菌株的生長(zhǎng)特性

2.3 菌株的柴油降解特性

2.3.1 降解曲線

Y3對(duì)柴油的降解曲線，如圖4所示。在7 d的培養(yǎng)過程中，菌株Y3持續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)柴油降解率也不斷提高，直至第5 d，OD600達(dá)到最高值，柴油降解率可達(dá)46.7%，隨后趨于平穩(wěn)，因此后續(xù)降解實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)以5 d為宜。

圖4 菌株的柴油降解曲線

2.3.2 菌株的降解特性

由圖5可知，隨著接種量逐漸提高，菌株的OD600和柴油降解率也隨之升高，當(dāng)接種量為10%（V/V）時(shí)，菌株的OD600和柴油降解率最高，接種量超過10%（V/V）時(shí)，菌株的生長(zhǎng)量和柴油降解率略有降低（圖5-a）。由此可知，單純提高接種量并不能顯著提升菌株的柴油降解率，接菌量過大，會(huì)引起細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而使部分細(xì)菌死亡[13]。當(dāng)接種量為5%，柴油濃度在1%（V/V）以內(nèi)，菌株Y3生長(zhǎng)旺盛，對(duì)柴油的降解率均在40%以上，而隨著柴油濃度的提升，菌株的生長(zhǎng)受到抑制，OD600僅為0.7左右，降解率大幅下降，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選擇1%（V/V）柴油濃度進(jìn)行（圖5-b）。菌株Y3在30℃條件下柴油降解率最高，可達(dá)48.1%，溫度為20℃和40℃時(shí)，發(fā)酵液相對(duì)澄清，Y3的生長(zhǎng)與降解能力明顯下降 （圖5-c）?？梢姕囟冗^高或過低，都會(huì)抑制微生物的代謝活動(dòng)[14]。在pH為5的高酸性環(huán)境，菌株Y3難以生長(zhǎng)，對(duì)柴油的降解率僅有10%，而在pH為6的弱酸環(huán)境下，Y3對(duì)柴油的降解效果最好，降解率可達(dá)55%（圖5-d）。碳酸鈉對(duì)Y3降解柴油的促進(jìn)效果明顯，柴油降解率由47.2%提升至71.2%（圖5-e）。氯化銨為Y3降解柴油過程中的最佳氮源（圖5-f）。

圖5 菌株Y3的降解特性

2.4 柴油降解的GC-MS分析

長(zhǎng)期的含柴油、燃料油潮濕泥土環(huán)境使菌株耐受碳?xì)浠衔镂廴经h(huán)境，而柴油富含長(zhǎng)鏈烷烴，且燃料油中約含有52%的芳烴組分，使其很難被生物降解[15]，從此環(huán)境中篩選得到的菌株Y3也由此具備了良好的碳?xì)浠衔锃h(huán)境耐受性與降解能力。與未接菌的對(duì)照CK相比，在最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)5 d后菌株Y3對(duì)柴油中各組分（C10-C32）均有一定的降解效果，柴油各單一組分發(fā)生明顯變化（圖6）。菌株Y3對(duì)柴油中的直鏈烷烴具有良好的降解效果，均達(dá)到30%以上的降解率，其中正十六烷、正十九烷、正三十二烷的降解率分別達(dá)到47.8%、71.2%與51.2%，Y3對(duì)支鏈烷烴也有著一定降解能力，其中2,6,10-三甲基十三烷降解率高達(dá)57.6%（圖7）。與菌株Y3相比，Ivanovaa等[16]篩選得到的嗜酸分枝桿菌對(duì)輕質(zhì)低粘度油（體積分?jǐn)?shù)為0.5%～1%）的正構(gòu)烷烴和異烷烴降解率分別為99%和44%， Kim等[17]利用Mycobacterium vanbaalenii-PYR-1菌株對(duì)十二烷、十三烷、十六烷、二十烷、二十四烷、二十五烷和二十八烷（體積分?jǐn)?shù)為1%）進(jìn)行降解，發(fā)現(xiàn)其對(duì)十二烷、十三烷降解速度最快，分別為62%和68%，而其他烷烴降解率為20%～30%。這與菌株Y3降解特性相似，這種降解趨勢(shì)在大多數(shù)代謝烷烴的分枝桿菌中較為典型[18]。但值得注意的是，以上研究中菌株對(duì)烷烴的降解時(shí)間分別長(zhǎng)達(dá)28 d和30 d，而Y3僅用5 d即達(dá)到上述水平，可見Mycolicibacterium fluoranthenivoransY3有較高的烷烴降解效率。

圖6 柴油降解的GC-MS分析

圖7 菌株Y3對(duì)柴油各組分利用情況

鑒于上述研究的分析比較結(jié)果以及分枝桿菌對(duì)多環(huán)芳烴降解研究的普遍性[19,20]，可見MycolicibacteriumfluoranthenivoransY3具有較為獨(dú)特與高效的石油烴降解能力，同時(shí)，螢蟲分枝桿菌（Mycolicibacterium fluoranthenivorans）的柴油烷烴降解特性是首次進(jìn)行研究，填補(bǔ)了分枝桿菌降解柴油相關(guān)研究的空白，對(duì)分枝桿菌屬修復(fù)石油烴污染的研究具有重要的推動(dòng)意義。

3 結(jié)論

（1）從天津港南疆污水處理廠含油污泥中篩選得到MycolicibacteriumfluoranthenivoransY3菌株，具有良好的耐鹽性以及耐Mn2+的能力。

（2）Y3能耐受3%（V/V）的柴油，在柴油濃度為1%（V/V）、接種量為10%（V/V）、溫度為30℃、pH為6.0的條件下，降解柴油第5 d可達(dá)50.1%的降解率。

（3）Y3可降解柴油中所有的碳?xì)浠衔铮–10-C32），能夠較好地利用直鏈或支鏈烷烴，在柴油等石油烴污染修復(fù)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用價(jià)值。