鄭文愛 喬鳳 唐小正 吳偉偉 王皇玉

(1.海南省第五人民醫(yī)院檢驗科，海口 570206；2.海南省第五人民醫(yī)院皮膚科，?？?570206)

紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum)是最常見的一種皮膚癬菌，也是淺部真菌病的主要病原菌之一。紅色毛癬菌主要侵犯人的皮膚、指甲/趾甲，偶可侵犯人的毛發(fā)，所致癬病病程持久，且治愈后易復(fù)發(fā)。本資料主要對海南地區(qū)分離自皮膚癬菌病患者的106例紅色毛癬菌臨床分離株進行基于紅色毛癬菌核糖體rDNA非轉(zhuǎn)錄區(qū)(NTS)的基因分型研究和藥敏試驗，探討基因型和感染部位、基因型和藥物敏感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

受試菌株 106株紅色毛癬菌來源于2015年1月1日—2019年5月30日海南島內(nèi)多個市縣淺部真菌感染的患者。菌株均經(jīng)形態(tài)學(xué)和核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ribosomal internal tran scribeds pacer(ITS)region)序列分析鑒定符合紅色毛癬菌。其中來源于男性患者71株，女性患者35株，年齡1～68歲(平均31.8歲)。股癬49株，體癬27株，甲真菌病16株，手足癬11株，面癬3株。質(zhì)控菌株為廣東省菌種保藏中心提供的ATCC-MYA-4438和ATCC 00294。

抗真菌藥物 氟康唑(FCZ)、伊曲康唑(ITR)、伏立康唑(VCZ)、酮康唑(KETO)、特比萘芬(TER)，均購自北京華中海威公司，5種藥物的純度分別是：98.5%、99.0%、99.0%、99.0%、99.0%。5種藥物的貯存液溶劑除了氟康唑用滅菌蒸溜水溶解外，其余4種脂溶性藥物均需溶于二甲基亞砜(DMSO)。抗真菌藥貯存液濃度為試驗中最高濃度的100倍，分裝于2 mL凍存管中置于-80℃存儲備用。各藥物工作濃度范圍為：氟康唑0.125～64 μg/mL，酮康唑 0.0313～16 μg/mL，特比萘芬、伊曲康唑、伏立康唑0.001～0.5 μg/mL。

試劑盒 高保真DNA提取試劑盒(購自華大基因公司)，試劑盒提供的擴增NTS區(qū)引物(5′-3′)：25SCON2：TAGACCGTCGTGAGACAG、NS1-R：GAGACAAGCATATGACTAC；擴增TRS-1區(qū)引物(5′-3′)：TrNTSF-2：ACCGTATTAAGCTAGCGCTGC、TrNTSR-4：TGCCACTTCGATTAGGAGGC；擴增TRS-2區(qū)引物(5′-3′)：TrNTSR-1：CTCAGTCGAACCGTGAGGC、TrNTSC-1：CGAGACCACGT GATACATGCG。

1.2 方法

DNA提取及PCR擴增 利用NTS區(qū)的特異性引物(25SCON2、NS1-R)擴增出NTS作為模版，再各自利用TRS-1 及TRS-2區(qū)的特異性引物(TrNTSF-2、TrNTSR-4和TrNTSR-1、TrNTSC-1)擴增出TRS-1 及TRS-2。

TRS-1、TRS-2分型結(jié)果判讀 序列測定顯示NTS區(qū)包含兩個串聯(lián)重復(fù)亞單位，TRS-1以200 bp為一個拷貝單位串聯(lián)重復(fù)排列，緊接一個 49 bp的部分重復(fù)。TypeⅠ型為一個 200 bp拷貝緊接一個 49 bp的部分重復(fù)；TypeⅡ型為兩個串聯(lián)重復(fù)200 bp拷貝緊接 一個49 bp的部分重復(fù)；TypeⅢ型為3個串聯(lián)重復(fù)200 bp拷貝緊接一個49 bp的部分重復(fù)；TypeⅣ型為4個串聯(lián)重復(fù)200 bp拷貝緊接一個49 bp的部分重復(fù)；<200 bp或條帶復(fù)雜的歸入其他帶型。同理，TRS-2以77 bp為一個拷貝單位串聯(lián)重復(fù)排列，緊接1個46 bp的部分重復(fù), TypeⅠ型為1個77 bp拷貝緊接1個46 bp的部分重復(fù)；TypeⅡ型為兩個串聯(lián)重復(fù) 77 bp拷貝緊接 1個46 bp的部分重復(fù)；<77 bp或條帶復(fù)雜的歸入其他帶型。

抗真菌藥物敏感性試驗 采用微量液體稀釋法(參照 CLSI-M38-A2 方案)[1]，質(zhì)控菌株ATCC?MYA-4438紅色毛癬菌。特比萘芬、伊曲康唑、伏立康唑試驗濃度0.001～0.5 μg/mL，酮康唑藥物濃度0.0313～16 μg/mL，氟康唑藥物濃度0.125～64 μg/mL。

2 結(jié) 果

106株紅色毛癬菌基因分型TRS-1有5種帶型，其中TypeⅠ52株(49.06%)，TypeⅡ14株(13.21%)，TypeⅢ5株(4.72%)，TypeⅣ型3株(2.83%)，其他帶型32株(30.18%)。TRS-2有3種帶型，其中TypeⅠ68株(64.15%)，TypeⅡ6株(5.66%)，其他帶型32株(30.19%)。TRS-1以I型和其他型為主，TRS-2也是以I型和其他型為主。此二種主要基因型在不同部位的分型中也是一致的。藥敏試驗結(jié)果顯示在不同感染部位中均以特比萘芬GM(geometric mean MIC)最低，其次是伏立康唑，排在第三的是伊曲康唑。不同感染部位藥物敏感試驗結(jié)果及基因型見表1、2。

表1 不同部位分離的106株紅色毛癬菌MIC范圍和GM

因紅色毛癬菌目前尚無藥敏折點，所以本藥敏試驗結(jié)果所說的不敏感株是指伊曲康唑或伏立康唑或特比萘芬MIC≥0.5 μg/mL，酮康唑MIC≥16 μg/mL，氟康唑MIC≥64 μg/mL的紅色毛癬菌株。結(jié)果顯示在不同感染部位菌株中伊曲康唑MIC≥0.5 μg/mL的有33株，其中股癬15株、體癬13株、足癬2株、面癬2株、甲真菌病1株；伏立康唑MIC≥0.5 μg/mL的有2株，股癬和足癬各1株；特比萘芬MIC≥0.5 μg/mL有2株，均為股癬；氟康唑MIC≥64 μg/mL的有12株，其中股癬9株、體癬2株、手癬1株；酮康唑均MIC<4 μg/mL。不敏感株多出現(xiàn)在股癬。其中有5株對伊曲康唑(MIC≥0.5 μg/mL)不敏感的股癬株同時對氟康唑(MIC≥64 μg/mL)不敏感，1株同時對特比萘芬(MIC≥0.5 μg/mL)不敏感；1株對伏立康唑不敏感的股癬株同時對氟康唑(MIC≥64 μg/mL)不敏感。不敏感菌株TRS-1分型TypeⅠ為主，TRS-2分型也是TypeⅠ為主。不同感染部位耐藥菌株基因型分布見表3。

表2 不同部位分離的106株紅色毛癬菌基因型分布

圖1 TRS-1部分?jǐn)U增條帶圖(TypeⅠ:4，6，7，10，11，12，14；TypeⅣ:9；Other Type: 1,2,5,8,13) 圖2 TRS-2部分?jǐn)U增條帶圖(TypeⅠ: 1,3～7,11,12；TypeⅡ:9；Other Type: 2,8,10,13)

3 討 論

紅色毛癬菌基因分型方法有很多，Jackson等[1]報道了紅色毛癬菌NTS區(qū)的兩個高變區(qū)：TRS-1區(qū)和TRS-2區(qū)，各由一種串聯(lián)重復(fù)序列組成，不同的菌株其重復(fù)次數(shù)不同，少數(shù)菌株還存在缺失、轉(zhuǎn)換或顛換現(xiàn)象，成為紅色毛癬菌株獨特的分子指紋。國內(nèi)外學(xué)者[2-3]通過幾種方法的比較，發(fā)現(xiàn)TRS-1、TRS-2指紋圖譜最適合用于紅色毛癬菌種內(nèi)分型，國內(nèi)學(xué)者[4-6]也以此為基礎(chǔ)進行紅色毛癬菌種內(nèi)分型。本研究中我們共收集了來自海南島各地患者的106株紅色毛癬菌，選用Jackson等[1]的TRS-1和TRS-2分型方法進行種內(nèi)分型，TRS-1分5種帶型，占比最多的是TypeⅠ，其次是其他型；TRS-2分出3種帶型，占比最多的是TypeⅠ，其次是其他型；說明海南地區(qū)流行的紅色毛癬菌TRS-1基因型以一個 200 bp拷貝緊接一個 49 bp的部分重復(fù)的TypeⅠ為主，和TRS-2基因型以77 bp為一個拷貝單位串聯(lián)重復(fù)排列，緊接1個46 bp的部分重復(fù)的TypeⅠ為主。這與閆瑋等[4]的研究相同，說明本地區(qū)流行的紅色毛癬菌與國內(nèi)其他地區(qū)流行的基因型差異不大。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同感染部位來源的菌株TRS-1分型均以TypeⅠ和其他型為主，這與占萍等[7]通過兩足一手病例分析發(fā)現(xiàn)80%以上的患者手足部位菌株基因型相同，說明可能紅色毛癬菌基因型與菌株來源有關(guān)，與感染部位無關(guān)。但因本研究的菌株數(shù)較少(106株)，尚不能完全肯定此論述。

本研究依據(jù)“CLSI-M38-A2”方案檢測這106株紅色毛癬菌藥敏，試驗結(jié)果顯示5種抗真菌藥物對本地區(qū)的紅色毛癬菌表現(xiàn)出不同的活性。MIC幾何均數(shù)由低至高分別為特比萘芬(0.0092 μg/mL)、伏立康唑(0.0181 μg/mL)、伊曲康唑(0.1491 μg/mL)、酮康唑(0.1630 μg/mL)、氟康唑(2.3164 μg/mL)。

藥敏結(jié)果共有42株菌MIC≥0.5或≥64 μg/mL(見表3)，其中7株出現(xiàn)同時對兩種藥不敏感的情況。經(jīng)TRS-1和TRS-2分型，這些不敏感株的常見TRS-1的基因型以TypeⅠ為主；TRS-2的常見基因形是TypeⅠ和其他型。這與本地區(qū)的流行基因型基本一致。說明本地區(qū)的不敏感菌株可能與來源有關(guān)。

表3 耐藥菌株基因型分布情況

紅色毛癬菌的種內(nèi)分型有許多潛在的臨床和流行病學(xué)應(yīng)用價值，如通過基因分型可以證實感染的來源，在臨床上當(dāng)抗真菌治療失敗時可以確定是復(fù)發(fā)還是再感染，判斷某些患者的慢性感染是否由某種菌株的某一特定基因型引起等。