吳雨嫻 張旺喆麒 徐洋 柴曉云

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系有機化學(xué)教研室，上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 200433)

隨著免疫抑制劑、激素以及抗生素的廣泛使用，侵襲性真菌，尤其是白念珠菌、新生隱球菌、曲霉、肺孢子菌等深部真菌感染的發(fā)病率、致死率逐年升高[1-2]。由于深部真菌種類較多，感染癥狀無特異性，故常漏診、誤診。同時，真菌感染傳統(tǒng)的實驗室診斷方法，如真菌涂片鏡檢、真菌培養(yǎng)、影像學(xué)檢查等雖各有優(yōu)勢，但難以兼顧高特異性、高敏感性和高效性的特點[3-4]。因此，快速檢測、及早確診、及時治療、科學(xué)監(jiān)控對深部真菌感染的治療具有重要的臨床意義。

熒光成像技術(shù)被認為是對活體細胞與組織進行分析成像最簡便有效的途徑，為腫瘤等重大疾病的早期診斷、病情監(jiān)測和精準(zhǔn)診療提供了一種快捷、靈敏、直觀的成像方式，且其在真菌成像中的研究也越來越多[5-7]。熒光成像技術(shù)的核心即尋找適合復(fù)雜生物樣品成像的熒光探針。近紅外熒光探針已廣泛應(yīng)用于生物樣品的熒光識別成像，成為生物醫(yī)學(xué)研究中必不可少的工具。通過與特定的生物分子、離子、蛋白等結(jié)合引起自身光化學(xué)性質(zhì)的改變，從而監(jiān)測目標(biāo)分析物的時空分布和變化。近年來，對于近紅外熒光探針的研究，一方面體現(xiàn)在利用新的生物標(biāo)志物設(shè)計熒光探針，該研究依賴于分子生物學(xué)的發(fā)展；另一方面體現(xiàn)在新的熒光信號調(diào)控機制的研究與發(fā)現(xiàn)，包括光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機制、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機制、熒光共振能量轉(zhuǎn)移機制、共價鍵能量轉(zhuǎn)移機制、聚集誘導(dǎo)發(fā)光機制、激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移機制等。

本文總結(jié)了基于藥物設(shè)計的、用于真菌成像的近紅外熒光探針，一方面加速了對真菌相關(guān)生物過程的研究，另一方面也為真菌感染提供新的臨床診斷和治療策略。

1 棘白菌素類熒光探針

棘白菌素類抗真菌藥物作為一類廣譜抗真菌藥，其作用機制是通過抑制β-1,3-葡聚糖合成酶，干擾真菌細胞壁的合成而發(fā)揮抗真菌作用。哺乳動物細胞沒有細胞壁，所以該類藥物對動物體毒副作用相對較小，是安全性較高的一類抗真菌藥物[8]?？ú捶覂糇鳛樵擃愃幬锏拇?，具有廣譜、高效、半衰期長、不良反應(yīng)少、患者耐受性好等優(yōu)點，其臨床應(yīng)用價值得到廣泛的認可[9]。因此，基于卡泊芬凈設(shè)計的熒光探針，可通過卡泊芬凈選擇性識別真菌細胞的β-1,3-葡聚糖合成酶而實現(xiàn)真菌的熒光成像。

棘白菌素類熒光探針，可用于特異性標(biāo)記真菌。Pratt等[10]將卡泊凈芬和氟硼二吡咯染料(BODIPY, BOD)偶聯(lián)設(shè)計合成熒光探針CSF-BOD(見圖1)。熒光探針與白念珠菌共孵育后觀察其成像結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白念珠菌生殖管軸向生長頂端的點狀熒光比母細胞的熒光強，這是因為細胞內(nèi)囊泡可轉(zhuǎn)運β-1,3-葡聚糖合成酶與高爾基復(fù)合物，此處富集大量β-1,3-葡聚糖合成酶。而單獨使用卡泊芬凈和BODIPY均未觀察到任何熒光標(biāo)記。選擇抗棘白菌素的白念珠菌fks1-S645F菌株進行成像實驗，發(fā)現(xiàn)熒光探針的結(jié)合大幅降低，與fks1-S645F突變菌株的β-1,3-葡聚糖合成酶對棘白菌素的敏感性降低是一致的。這進一步說明，熒光探針CSF-BOD是通過卡泊芬凈選擇性識別真菌細胞的β-1,3-葡聚糖合成酶的特點來特異性標(biāo)記真菌細胞，進而實現(xiàn)真菌的近紅外熒光成像。一方面，CSF-BOD在混雜其它革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌(如銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌等)的情況下仍能特異性識別真菌。另一方面，除識別真菌外，CSF-BOD還能識別菌絲等真菌結(jié)構(gòu)。

圖1 卡泊芬凈熒光探針CSF-BOD的結(jié)構(gòu) 圖2 卡泊芬凈熒光探針probe 1-3的結(jié)構(gòu) 圖3 卡泊芬凈熒光探針CSF-DDAO的結(jié)構(gòu)

除標(biāo)記真菌外，此類探針還可用于真菌耐藥性的監(jiān)測。Jaber等[11]對卡泊芬凈熒光探針進行了深入研究，將熒光染料四甲基羅丹明和硝基苯并噁二唑標(biāo)記的卡泊芬凈探針(probe 1和probe 2，見圖 2)用于白念珠菌的成像。研究發(fā)現(xiàn)，卡泊芬凈熒光探針與卡泊芬凈一樣，可在念珠菌液泡中迅速積累，這一點可通過與液泡蛋白和液泡特異性染色劑的共定位得以證實。因此，區(qū)別于上述用于標(biāo)記真菌的卡泊芬凈熒光探針，該探針可通過監(jiān)測真菌細胞內(nèi)的熒光囊泡，預(yù)測真菌對棘白菌素耐藥性，有助于設(shè)計侵襲性真菌感染的最佳藥物治療策略。

Loh等[12]也發(fā)現(xiàn)卡泊芬凈探針(Probe 3，見圖 2)可以迅速進入真菌細胞內(nèi)并定位于液泡內(nèi)，并且探針的攝取率與棘白菌素的耐藥性之間存在正相關(guān)，為識別耐藥菌株提供了新的方法。相較于傳統(tǒng)的依賴于甲殼素特異性染料鈣氟白(calcofluor white, CFW)來檢測真菌耐藥性的方法，卡泊凈芬熒光探針具有更高的靈敏性和更快的檢測效率等優(yōu)點，這一優(yōu)點在幾丁質(zhì)含量較低的耐藥菌株(如光滑梭菌)中更加顯著。

此外，利用卡泊芬凈對真菌細胞的高度靶向特性，將卡泊芬凈與1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮偶聯(lián)合成新型探針CSF-DDAO(見圖3)，用其制備脂質(zhì)體L-CSF-DDAO，并用于患真菌性角膜炎的小鼠，研究證實可用于檢測角膜曲霉感染[13]。該探針依賴棘白菌素作為其載體，應(yīng)用時僅以局部形式使用，不會對全身藥物水平產(chǎn)生影響。同時，與CSF-DDAO探針相比L-CSF-DDAO探針在感染眼中信號持續(xù)時間更短(CSF-DDAO探針：4 h，L-CSF-DDAO探針：1 h)，可能有效減輕了與藥物相關(guān)的毒性。綜上，L-CSF-DDAO探針是非侵入性快速診斷曲霉引起的真菌性角膜炎的可靠方法。

2 多烯藥物類熒光探針

多烯類抗真菌藥物兩性霉素B在真菌感染治療中發(fā)揮了舉足輕重的作用。兩性霉素B具有廣譜、高效的特性，對淺部真菌感染和深部真菌感染均有效，是白念珠菌、隱球菌、曲霉等真菌感染的首選治療藥物。其通過結(jié)合真菌細胞膜的麥角甾醇，進一步影響膜的通透性和滲透性，從而導(dǎo)致真菌死亡[14]。Baibek等[15]將熒光團與兩性霉素B結(jié)構(gòu)中的羧基和糖氨基分別偶聯(lián)得到可用于標(biāo)記真菌細胞膜的熒光探針AmB-NBD-1A/2A、AmB-NBD-1B/2B、AmB-MeroCy和AmB-Cy5(見圖 4)，并成功進行了真菌成像研究。該研究證實了氨基糖是兩性霉素B的活性必需基團。值得關(guān)注的是，AmB-MeroCy和AmB-Cy5不僅成功標(biāo)記了白念珠菌細胞膜，對于有耐藥性的C.aurisstrainNCPF 8993也能進行有效標(biāo)記，這表明耐藥性不是由于兩性霉素B和真菌細胞膜的相互作用受阻而產(chǎn)生的。同時，證實了熒光探針不僅可用于浮游真菌細胞的成像檢測，還可用于聚集黏連真菌的成像檢測。AmB-Cy5熒光探針還能在革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌存在的情況下高選擇性地識別真菌，具有很高的特異性。這種探針可在多種微生物混雜的背景下高效、快速、準(zhǔn)確地識別真菌，適應(yīng)了臨床的復(fù)雜性，具有很高的實用性，為臨床上病原微生物的快速診斷鑒別提供基礎(chǔ)。

圖4 兩性霉素B熒光探針的結(jié)構(gòu) 圖5 納他霉素?zé)晒馓结楴atamycin-BOD結(jié)構(gòu) 圖6 唑類熒光探針Probe 1-2的結(jié)構(gòu)

納他霉素(natamycin)也稱匹馬菌素、游鏈霉素，是一種重要的多烯類抗真菌藥物。作為一種天然的食品添加劑，納他霉素對真菌的抑制和殺滅具有廣譜和高效的特點，且毒副作用小。Sintes等[16]設(shè)計合成了納他霉素-BODIPY熒光探針natamycin-BOD(見圖5)，并對該探針的熒光顯微鏡下真菌細胞的選擇性成像進行了研究。該探針的合成在溫和條件下進行，且不需要任何保護基團或活化試劑，也不產(chǎn)生任何副產(chǎn)物。結(jié)果顯示，該探針具有對多種真菌的廣泛適用性，且在混雜細菌的情況下，對真菌具有高度選擇性。

3 氮唑類藥物熒光探針

氮唑類藥物是臨床上應(yīng)用最廣、種類最多的廣譜高效抗真菌藥物，其作用靶點為真菌細胞膜麥角甾醇生物合成過程中的一個關(guān)鍵酶-羊毛甾醇14α去甲基化酶(CYP51)。氮唑類藥物能抑制真菌的CYP51，從而導(dǎo)致真菌細胞膜結(jié)構(gòu)和功能喪失，最終導(dǎo)致真菌死亡[17]。

Benhamou等[18]通過丹酰染料和Cy5設(shè)計合成了氮唑探針Azole-Probe-1和Azole-Probe-2(見圖6)，Azole-Probe-1為丹?；玖蠠晒馓结?，Azole-Probe-2為Cy5熒光探針。這種兩種探針在被攝取的前幾個小時主要定位并聚集于線粒體中，且均能作用于細胞色素P450的活性位點。這類探針實現(xiàn)了氮唑類藥物在真菌細胞內(nèi)的可視化，提供了唑類藥物的攝取、流出和亞細胞定位的重要信息，獲得有關(guān)重要氮唑類抗真菌藥物活性和定位的詳細信息。

除上述可與線粒體共定位的探針，Benhamou等[19]研究合成了用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成像的氮唑類熒光探針(見圖7)。麥角甾醇是膜的重要組成部分，也是唑類抗菌藥物的作用靶點，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)含有多種麥角甾醇合成酶，基于以上特點，合成該探針。與現(xiàn)有的只能對光滑念珠菌進行染色的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色劑相比，該系列探針可以對多種真菌進行染色，具有普適性，實現(xiàn)了多種真菌的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)追蹤成像。同時，結(jié)果顯示，該探針不具有細胞毒性，可適用于活細胞成像實驗。

圖7 唑類熒光探針Probe 3-8的結(jié)構(gòu)

氮唑類藥物熒光探針還可用于標(biāo)記某些真菌。Pratt等[10]將泊沙康唑和氟硼二吡咯染料偶聯(lián)設(shè)計合成熒光探針POS-BOD(見圖8)，并研究了該探針對白念珠菌和曲霉的成像情況。研究發(fā)現(xiàn)，POS-BOD對白念珠菌和曲霉都顯示出較強的熒光標(biāo)記。用未熒光標(biāo)記的泊沙康唑或伏立康唑處理以上結(jié)果時，熒光信號大幅減弱或消失，說明泊沙康唑或伏立康唑與熒光探針POS-BOD可以競爭性結(jié)合作用靶點羊毛甾醇14α-去甲基化酶。而用卡泊芬凈處理時，對POS-BOD標(biāo)記的細胞熒光信號影響不大，也進一步說明了泊沙康唑和卡泊芬凈的作用位點不同。

圖8 泊沙康唑熒光探針POS-BOD的結(jié)構(gòu)

4 總結(jié)與展望

隨著熒光成像技術(shù)的不斷更新發(fā)展，熒光探針在生物學(xué)上的應(yīng)用越來越廣泛?？拐婢幬锵嚓P(guān)的分子探針為真菌檢測、真菌感染的診斷、真菌生物學(xué)研究提供了研究手段。基于藥物的真菌熒光探針充分發(fā)揮了熒光探針的應(yīng)用潛能，推動了生物熒光成像應(yīng)用，并將作為一種工具廣泛用于真菌學(xué)研究。將該類探針應(yīng)用于侵入性真菌感染的真菌檢測成像，以期實現(xiàn)病原真菌從體外到體內(nèi)的近紅外熒光成像，為病原真菌重大傳染性疾病的早期診斷與精準(zhǔn)診療提供新的成像技術(shù)，為抗真菌藥物的發(fā)現(xiàn)提供便捷、快速、可視化的篩選平臺。