趙煥蘭，曹嘉燦，劉奎，范葉珍，苗敏

（合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230601）

櫻桃番茄又稱圣女果、小番茄，果實(shí)營養(yǎng)豐富，酸甜適口，是一種廣受歡迎的果蔬；因其具有多汁、皮薄、組織柔軟等特性采后易受到機(jī)械損傷，而損傷后的果實(shí)極易遭受微生物侵染，使其在貯藏期間容易發(fā)生腐爛變質(zhì)[1-3]。同時(shí)貯藏期間易出現(xiàn)失水現(xiàn)象，造成表皮皺縮，使得口感和品相欠佳，降低其食用價(jià)值和商品價(jià)值[4-5]，因此尋找安全有效的保鮮方式延長櫻桃番茄的貯藏期具有重要意義。目前對包括櫻桃番茄在內(nèi)的果蔬保鮮措施已有廣泛的研究，主要措施包括化學(xué)方法（化學(xué)防腐劑）[2，6]、物理方法（低溫冷藏，熱處理，輻射）[7-9]、生物方法（植物抑菌物，拮抗微生物）[10-13]。

隨著人們對綠色環(huán)保和食品安全的不斷追求，安全無害的生物保鮮技術(shù)成為研究熱點(diǎn)。在生物保鮮技術(shù)中，拮抗微生物因分布廣泛、獲取容易、培養(yǎng)經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)一直廣受關(guān)注。然而實(shí)際應(yīng)用過程中直接將拮抗微生物作為保鮮劑具有一定的局限性，若受到污染或是接觸不良環(huán)境都會使保鮮效果大打折扣，發(fā)酵液即拮抗微生物（生防菌）在適宜培養(yǎng)基內(nèi)生長后濾除菌體的培養(yǎng)液，其含有大量的活性代謝產(chǎn)物，因此將發(fā)酵液作為保鮮劑是更佳的保鮮措施[14-15]。生防菌發(fā)酵液在眾多領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，尤其是在果蔬采后保鮮方面。而細(xì)菌是目前研究最普遍，應(yīng)用最廣的一類拮抗微生物，常見的有假單胞菌和芽孢桿菌，其中新型生防菌貝萊斯芽孢桿菌在近幾年引起了人們廣泛地研究，文獻(xiàn)[16]發(fā)現(xiàn)一株貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵液對櫻桃番茄的自然腐敗有抑制作用，并且能延緩質(zhì)量損失，但對于保鮮指標(biāo)測量相對較少。

本研究前期分離鑒定得到一株貝萊斯芽孢桿菌，命名為A4。在此基礎(chǔ)上以A4發(fā)酵液為研究對象，探究其對櫻桃番茄貯藏品質(zhì)的影響。選取腐爛率及失重率，物性（硬度、脆性、緊實(shí)度），可溶性固形物、可滴定酸、類黃酮、番茄紅素及酚類物質(zhì)含量為評價(jià)指標(biāo)，以更全面地評判番茄品質(zhì)變化及A4發(fā)酵液的保鮮效果，最后初步探究發(fā)酵液作用的保鮮機(jī)理。本研究為貝萊斯芽孢桿菌的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，為櫻桃番茄采后貯藏保鮮提供新技術(shù)思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）A4：合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)室前期分離鑒定并保存。櫻桃番茄：市售，果實(shí)新鮮無傷，大小均勻一致。

胰蛋白胨、酵母提取物：BioFroxx公司；NaCl、NaOH、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、硼酸、沒食子酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒、過氧化物酶（peroxidase，POD）試劑盒：南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWY-1102雙層大容量恒溫?fù)u床：中國合肥啟誠生物科技有限公司；mls-3750高壓蒸汽滅菌鍋：日本三洋公司；ST8R低溫高速大離心機(jī)：賽默飛世爾科技公司；PK-S22恒溫水浴鍋：中國上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀：北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司；TA.XTplus物性測試儀：英國Stable公司。

1.3 方法

1.3.1 A4除臭發(fā)酵液的制備

參考文獻(xiàn)[17]的方法配制除臭發(fā)酵培養(yǎng)基（10 g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/LNaCl、葡萄糖20g/L，ddH2O定容至1 L，121℃滅菌20 min）。菌種活化后培養(yǎng)至濃度在600nm下的吸光度為0.6（OD600nm=0.6），轉(zhuǎn)接于除臭發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為0.5%，37℃、180 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)48 h，真空泵抽濾去除菌體，所得發(fā)酵液保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 櫻桃番茄保鮮試驗(yàn)處理

參考文獻(xiàn)[18]對櫻桃番茄進(jìn)行處理：將櫻桃番茄分為兩組，每組4kg，一組浸泡于10%的A4發(fā)酵液中（FJY），另一組浸泡于10%的LB培養(yǎng)基（10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10 g/L NaCl，ddH2O 定容至 1 L，121℃滅菌20 min）中作為對照（CK）。10 min后取出自然晾干，裝入保鮮盒，25℃，80%～90%相對濕度條件下貯藏。1.3.3 腐爛率及失重率的測定

參考文獻(xiàn)[19]方法，每2 d測量每組櫻桃番茄總質(zhì)量，同時(shí)觀察并記錄番茄腐爛個(gè)數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)2次。腐爛率和失重率計(jì)算公式如下。

1.3.4 硬度、脆性、緊實(shí)度的測定

處理方法同1.3.2，間隔2 d各組隨機(jī)選取5個(gè)櫻桃番茄樣品，果實(shí)赤道處選取2個(gè)位置作為測量點(diǎn)，使用質(zhì)構(gòu)儀測量櫻桃番茄的硬度、脆性和緊實(shí)度，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 可溶性固形物及可滴定酸的測定

1.3.4 中測質(zhì)構(gòu)后的櫻桃番茄樣品用于可溶性固形物及可滴定酸的測定，使用數(shù)顯糖度儀測量其汁液的可溶性固形物含量。取適當(dāng)果肉組織，用液氮冷凍后研磨至細(xì)粉狀，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參考文獻(xiàn)[20]的酸堿滴定法測定并計(jì)算可滴定酸含量，使用0.01 mol/L NaOH溶液進(jìn)行滴定。

1.3.6 類黃酮、番茄紅素及總酚的測定

參考文獻(xiàn)[21]的方法測定類黃酮的含量，在波長510 nm處測定吸光度，并用蘆丁做標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算類黃酮含量。

參考文獻(xiàn)[22]的方法測定番茄紅素的含量，稱取0.40 g組織粉末，加入4 mL提取液（正己烷∶丙酮∶乙醇的體積比為 2∶1∶1），充分溶解后于冰浴靜置 10 min，取上清液檢測，以正己烷為空白，在波長472 nm處測定吸光度，并計(jì)算番茄紅素含量。

參考文獻(xiàn)[21]的方法的測定總酚的含量，在波長735 nm處測定吸光度值，并用沒食子酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚含量。

1.3.7 抗性酶活力及丙二醛（malondialdehyde，MDA）濃度的測定

總SOD活力測定：根據(jù)總超氧化物歧化酶試劑盒說明書配制溶液，參考操作表添加相關(guān)試劑，混勻后，室溫放置10 min，使用酶標(biāo)儀于波長550 nm處測定吸光度。

POD活力測定：根據(jù)過氧化物酶（POD）試劑盒說明書進(jìn)行操作，準(zhǔn)確稱取果肉組織0.10 g，加入900 μL濃度為0.05 mol/L pH7磷酸鹽緩沖液，冰水浴條件下制備成10%的組織勻漿液，3 500 r/min離心10 min后，取上清液進(jìn)行POD活力的測定。參考操作表添加相關(guān)試劑，混勻后，3 500 r/min離心10 min，使用酶標(biāo)儀于420 nm處測定吸光度。

參考文獻(xiàn)[23]的方法測定苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）的活力，制備粗酶提取液及硼酸緩沖液，取50 μL的粗酶液，加入150 μL pH8.8的硼酸緩沖液，在波長290 nm處測定起始吸光度及在37℃恒溫箱中放置1 h后的吸光度。

參考文獻(xiàn)[24]測定MDA濃度，采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法測定丙二醛（MDA）的濃度。分別檢測在450、532、600 nm 3處波長的吸光度，即可計(jì)算出MDA的濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS statistics 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性采用鄧肯氏多重比較法，Origin9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果分析

2.1 腐爛率及失重率

A4發(fā)酵液櫻桃番茄貯藏期間腐爛率和失重率的影響如圖1所示。

圖1 A4發(fā)酵液對櫻桃番茄貯藏期間腐爛率和失重率的影響Fig.1 Effects of Bacillus velezensis A4 fermentation supernatant on decay rate and weight loss rate of cherry tomato during storage

由圖1A可知，相同貯藏時(shí)間內(nèi)發(fā)酵液處理組的腐爛果實(shí)數(shù)量顯著少于對照組，第12天數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，對照組的腐爛率已高達(dá)27.97%，而發(fā)酵液處理組的腐爛率僅為6.38%，顯著低于對照組。由圖1B可知，貯藏30 d后對照組果實(shí)已接近全部腐爛變質(zhì)，而處理組仍有相當(dāng)數(shù)量果實(shí)處于形態(tài)色澤較好的健康狀態(tài)。表明貝萊斯芽孢桿菌A4的發(fā)酵液具有顯著抑制櫻桃番茄腐爛的作用。

由圖1C可知，櫻桃番茄的失重率隨貯藏時(shí)間的延長而逐漸增加，在整個(gè)貯藏期間對照組的失重率均顯著高于處理組。這一趨勢表明A4發(fā)酵液能有效降低水分的蒸發(fā)，較好地保持果實(shí)質(zhì)量。

2.2 硬度、脆性及緊實(shí)度

A4發(fā)酵液對番茄貯藏期間各物性指標(biāo)的影響如圖2所示。

圖2 A4發(fā)酵液對番茄貯藏期間各物性指標(biāo)的影響Fig.2 Effects of Bacillus velezensis A4 fermentation supernatant on physical properties of cherry tomato during storage

由圖2A、圖2B可知，櫻桃番茄貯藏期間果實(shí)硬度和脆性均隨貯藏時(shí)間的延長而逐漸降低，貯藏初期（0～2 d），對照組與處理組的硬度及脆性并無明顯差異，但隨著貯藏時(shí)間延長，櫻桃番茄果實(shí)的硬度及脆性經(jīng)A4發(fā)酵液處理后降低緩慢，得到較好的保持；同時(shí)A4發(fā)酵液對果實(shí)緊實(shí)度的維持效果顯著，隨貯藏時(shí)間延長，發(fā)酵液處理組果實(shí)的緊實(shí)度都顯著高于對照組果實(shí)（圖2C）。以上結(jié)果表明，A4發(fā)酵液可以抑制櫻桃番茄物性指標(biāo)的降低，維持較好的感官屬性。

2.3 可溶性固形物及可滴定酸

發(fā)酵液對櫻桃番茄貯藏期間可溶性固形物和可滴定酸含量的影響如圖3所示。

圖3 A4發(fā)酵液對櫻桃番茄貯藏期間可溶性固形物、可滴定酸含量的影響Fig.3 Effects of Bacillus velezensis A4 fermentation supernatant on the content of soluble solids and titratable acids in cherry tomato during storage

由圖3A可知，櫻桃番茄貯藏期間果實(shí)可溶性固形物含量隨貯藏時(shí)間的延長而逐漸降低，而經(jīng)A4發(fā)酵液處理的櫻桃番茄果實(shí)的可溶性固形物含量降低緩慢，尤其在貯藏期的8 d～12 d，果實(shí)的可溶性固形物含量得到較好的保持；果實(shí)中可滴定酸含量顯示出同樣的變化趨勢，在貯藏初期發(fā)酵液對可滴定酸的保持作用有限，但隨著貯藏時(shí)間延長，發(fā)酵液具有延緩可滴定酸損失的效果（圖3B）。上述結(jié)果表明A4發(fā)酵液能抑制櫻桃番茄可溶性固形物和可滴定酸的含量降低。

2.4 類黃酮、番茄紅素及總酚

由于短期貯藏條件下櫻桃番茄中類黃酮、番茄紅素、總酚的含量變化不大，進(jìn)而延長貯藏時(shí)間，測定第6天和第12天上述3項(xiàng)指標(biāo)的變化。A4發(fā)酵液對櫻桃番茄貯藏期間類黃酮、番茄紅素及總酚含量的影響如圖4所示。

圖4 A4發(fā)酵液對櫻桃番茄貯藏期間類黃酮、番茄紅素及總酚含量的影響Fig.4 Effects of Bacillus velezensis A4 fermentation supernatant on the content of flavonoids,lycopene,and total phenols in cherry tomato during storage

由圖4可知，貯藏期間發(fā)酵液處理組中櫻桃番茄的類黃酮、番茄紅素和總酚含量均顯著高于對照組，其中發(fā)酵液對總酚含量的保持最為突出。以上結(jié)果表明A4發(fā)酵液能較好地保持櫻桃番茄中類黃酮、番茄紅素、總酚的含量。

2.5 抗性酶活力及丙二醛MDA濃度

抗性酶活力及MDA濃度變化如圖5所示。

由圖5可知，發(fā)酵液處理櫻桃番茄第6天和第12天，果實(shí)3種抗性酶活力隨時(shí)間的延長而逐漸增加。與對照相比，處理組中總SOD活力雖有增加，但差異較小。而POD活力及PAL活力顯著增加，與對照相比，發(fā)酵液處理櫻桃番茄第12天，POD活力增加了20%，PAL活力增加了32%。櫻桃番茄儲藏期間，果實(shí)的MDA濃度隨貯藏時(shí)間的延長而逐漸增加，經(jīng)A4發(fā)酵液處理后，MDA濃度增加緩慢。以上結(jié)果表明，A4發(fā)酵液可以增加櫻桃番茄3個(gè)抗性酶的活力同時(shí)延緩MDA濃度的增加。

3 討論與結(jié)論

本研究為全面評價(jià)櫻桃番茄品質(zhì)的變化，選取了3個(gè)方面的指標(biāo)，一方面為綜合性評價(jià)指標(biāo)（腐爛率和失重率），在采后的運(yùn)輸貯藏等過程中，因呼吸作用、蒸騰作用以及病原微生物侵染等因素的影響，使得櫻桃番茄極易出現(xiàn)失水腐爛等現(xiàn)象，所以失重率和腐爛率能綜合地反映櫻桃番茄品質(zhì)的變化。第二方面是包括硬度、脆性和緊實(shí)度在內(nèi)的物性指標(biāo)，物性指標(biāo)是衡量果實(shí)本身特性和貯藏過程中果實(shí)品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)，如果實(shí)抗壓力愈強(qiáng)，果實(shí)的硬度就愈大也越耐貯藏。第三方面是風(fēng)味與營養(yǎng)指標(biāo)，包括可溶性固形物、可滴定酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及類黃酮、番茄紅素及酚類物質(zhì)的含量，其中可溶性固形物通常包括可溶性糖及果膠營養(yǎng)成分，同時(shí)也會一定程度上影響番茄口感，因此可以反應(yīng)番茄的營養(yǎng)和風(fēng)味變化；而可滴定酸是番茄酸味的主要來源，是番茄重要的風(fēng)味指標(biāo)；類黃酮、番茄紅素及酚類物質(zhì)均是重要的抗氧化物質(zhì)，是番茄貯藏后重要的營養(yǎng)指標(biāo)。

結(jié)果表明貝萊斯芽孢桿菌A4發(fā)酵液能顯著降低櫻桃番茄在貯藏期間的腐爛率和失重率、延緩硬度、脆性、緊實(shí)度3個(gè)物性指標(biāo)的降低、同時(shí)較好地維持了可滴定酸、可溶性固形物、類黃酮、番茄紅素、酚類物質(zhì)的含量，保持了番茄的風(fēng)味與營養(yǎng)品質(zhì)。進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）3種抗性酶的活性在整個(gè)貯藏期內(nèi)均高于對照組，而處理組丙二醛（MDA）的濃度上升緩慢，對照組迅速升高。這說明預(yù)先用發(fā)酵液處理的果實(shí)在逆境脅迫條件下，防御系統(tǒng)會提高，參與果實(shí)防御相關(guān)的酶（SOD、POD、PAL）共同作用，降低 MDA的積累，減少對果實(shí)的傷害，從而提高果實(shí)抗病性，更好地保持櫻桃番茄的貯藏品質(zhì)。

本研究為發(fā)酵液作為生防制劑的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，也為果蔬保鮮提供了新的技術(shù)思路。基于本研究在后續(xù)的試驗(yàn)中可以進(jìn)一步分析鑒定貝萊斯芽孢桿菌A4發(fā)酵液中發(fā)揮主要抑菌作用的有效成分，探究其抑菌機(jī)理并基于此嘗試濃縮、添加適當(dāng)化合物等方法改善發(fā)酵液成分，提高保鮮效果，為生產(chǎn)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。